Tuyển chọn và cải thiện các chủng acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng ở quy mô pilot

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THÚY HƯƠNG TUYỂN CHỌN VÀ CẢI THIỆN CÁC CHỦNG ACETOBACTER XYLINUM TẠO CELLULOSE VI KHUẨN ĐỂØ SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG Ở QUY MÔ PILOT Chuyên ngành: Vi sinh Mã số:1.05.12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Giáo sư hướng dẫn: PGS.TS. PHẠM THÀNH HỔ NĂM 2006 MỤC LỤC Danh mục các ký hiệu các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các đồ thò, biểu đồ Danh mục các hình Chương 1. MỞ ĐẦU 1 . Mục tiêu của đề tài . Nội dung của đề tài . Những điểm mới của luận án Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Cellulose vi khuẩn 4 2.1.1 Cấu trúc cellulose vi khuẩn 4 2.1.2 Một số tính chất của cellulose vi khuẩn 9 2.2 Vi sinh vật sản sinh cellulose 10 2.2.1 Nhóm vi sinh vật có khả năng sản sinh cellulose 10 2.2.2 Đặc điểm chung Acetobacter – giống vi khuẩn sinh cellulose hiệu quả cao 11 2.2.3 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Acetobacter xylinum 13 2.2.4 Sinh tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Acetobacter xylinum 14 2.3 Lên men thu nhận cellulose vi khuẩn 19 2.4 Ứng dụng của cellulose vi khuẩn và triển vọng 25 2.5 Mối quan hệ giữa tính đề kháng Sulfaguanidine và sinh tổng hợp cellulose gia tăng ở chủng đột biến Acetobacter xylinum 29 2.6 Cố đònh tế bào vi sinh vật 32 Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 3.1 Giống 36 3.2 Nguyên liệu và môi trường dinh dưỡng 36 3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 39 3.3.1 Các bước thí nghiệm 39 3.3.2 Lập bộ sưu tập giống 39 3.3.3 Sàng lọc giống phù hợp với nguồn nguyên liệu 42 3.3.4 Cải thiện giống: Đột biến bằng tia UV, chọn lọc dòng đột biến kháng Sulfaguanidine, có khả năng tổng hợp cellulose cao 42 3.3.5 Khảo sát quá trình nhân giống quy mô nhỏ và quy mô pilot 44 3.3.6 Thành phần môi trường phù hợp phương thức lên men bề mặt và lên men chìm45 3.3.7 Một số điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến quá trình lên men bề mặt và lên men chìm BC 46 3.3.8 Nghiên cứu biến động trong quá trình lên men BC ở quy mô phòng thí nghiệm46 3.3.9 Thử nghiệm lên men BC ở quy mô pilot 47 3.3.10 Phương pháp xử lý BC 47 3.3.11 Phương pháp cố đònh vi khuẩn A.xylinum trên BC 49 3.3.12 Tạo 2 chế phẩm A.xylinum BC16 và A.xylinum BC16S 1 . Ứng dụng chế phẩm Acetobacter xylinum để lên men BC 50 3.3.13 Cố đònh vi khuẩn Lactic và ứng dụng lên men sữa chua 51 3.3.14 Thăm dò sử dụng sinh khối Acetobacter xylinum làm tác nhân kết dính để tạo một số vật liệu có giá trò từ phế thải nông nghiệp 52 3.3.15 Phương pháp xử lý số liệu 52 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 53 4.1 Lập bộ sưu tập giống 53 4.2 Các kiểu lên men trên những nguồn nguyên liệu khác nhau 59 4.2.1 Môi trường rỉ đường 59 4.2.1.1 Sàng lọc giống cho nguồn nguyên liệu rỉ đường 59 4.2.1.2 Đột biến bằng tia UV chọn lọc dòng có khả năng sản sinh BC cao trên môi trường rỉ đường 62 4.2.1.3 Nhân giống A.xylinum BC16 và A.xylinum BC16S 1 64 4.2.1.4 Thành phần môi trường rỉ đường phù hợp kiểu lên men bề mặt 66 4.2.1.5 Thành phần môi trường rỉ đường phù hợp kiểu lên men chìm 68 4.2.2 Môi trường nước mía 70 4.2.2.1 Sàng lọc giống phù hợp với môi trường nước mía 70 4.2.2.2 Nhân giống A.xylinumBC17 72 4.2.2.3 Thành phần môi trường nước mía phù hợp kiểu lên men bề mặt và lên men chìm sản xuất BC 73 4.2.3 Một số môi trường khác 75 4.3 Các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến quá trình lên men 78 4.4 Thử nghiệm lên men sản xuất BC ở quy mô pilot 86 4.4.1 Lên men bề mặt quy mô pilot trên diện tích rộng 1,5 m 2 86 4.4.2 Lên men bề mặt quy mô pilot trên khay nhỏ 87 4.4.3 Lên men chìm quy mô 75 lít/mẻ 88 4.5 Xử lý BC và sản phẩm BC 91 4.6 Ứng dụng mới của cellulose vi khuẩn (BC): Dùng BC làm chất nền ( matrix) và giá đỡ ( supporter) để cố đònh tế bào vi khuẩn 94 4.6.1 BC phù hợp với các yêu cầu cơ bản của chất nền (matrix) trong kỹ thuật cố đònh vi sinh vật 94 4.6.2 Thăm dò một số phương pháp cố đònh vi khuẩn lên chất nền ( matrix) 95 4.6.3 Cố đònh tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum trên chất nền- giá đỡ BC tạo chế phẩm để ứng dụng trong lên men cellulose vi khuẩn 97 4.6.4 Cố đònh vi khuẩn Lactic tạo chế phẩm vi khuẩn Lactic 110 4.7 Ứng dụng sinh khối Acetobacter xylinum làm tác nhân kết dính 113 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 117 Các bài báo khoa học được đăng Tài liệu tham khảo Phụ lục DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT MC: Microbial cellulose (cellulose vi sinh vật) BC: Bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn) PC: Plant cellulose (cellulose thực vật) S-BC: Static Bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận bằng phương pháp nuôi cấy tónh) A-BC: Agitated Bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận bằng phương pháp nuôi cấy chìm) pABA: p – aminobenzoic acid Tia UV: Ultraviolet - Tia tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các vi sinh vật sản sinh cellulose Bảng 2.2 nh hưởng của các nguồn carbon đến sự tổng hợp BC của A.xylinum Bảng 3.1 Đòa điểm thu thập giống và mẫu phân lập Bảng 3.2 Thành phần môi trường rỉ đường Bảng 3.3 Nội dung và các bước thí nghiệm Bảng 4.1 Quan hệ với nhiệt độ Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra các đặc điểm sinh hoá Bảng 4.3 Ký hiệu bộ sưu tập giống Bảng4.4 Tuyển chọn giống qua sự sinh trưởng trên môi trường đặc và môi trường lỏng Bảng 4.5 Tuyển chọn giống qua sản lượng BC trong lên men bề mặt và lên men chìm Bảng 4.6 nh hưởng của tia tử ngoại đến tế bào vi khuẩn A. xylinum Bảng 4.7 Khả năng sinh trưởng và tổng hợp cellulose của các dòng đột biến trên môi trường rỉ đường Bảng 4.8 Kết quả nhân giống cấp 3 của 2 chủng BC16 và BC 16S1 Bảng 4.9 Tuyển chọn giống phát triển trên môi trường nước mía thông qua sự phát triển trên môi trường đặc và lỏng Bảng 4.10 Tuyển chọn giống phát triển nhanh trên môi trường nước mía có khả năng sản sinh cellulose cao Bảng 4.11 Kết quả nhân giống cấp 3 vi khuẩn A.xylinum BC 17 Bảng 4.12 Sản lượng BC tươi thu được từ các môi trường phụ phẩm trái cây Bảng 4.13 Sản lượng BC khô thu được từ các môi trường phụ phẩm trái cây Bảng 4.14 Sản lượng BC thu từ môi trường tinh bột Bảng 4.15 Diễn biến sản lượng cellulose (S-BC) trên môi trường rỉ đường lên men bề mặt theo tỷ lệ giống và thời gian lên men Bảng 4.16 Diễn biến sản lượng cellulose (A-BC ) trên môi trường rỉ đường lên men chìm theo tỷ lệ giống và thời gian lên men Bảng 4.17 Các phương án điều chỉnh để cải thiện sản lượng A-BC ở quy mô pilot Bảng 4.18 Một số phương pháp tinh sạch màng BC Bảng 4.19 Đặc tính sản phẩm BC Bảng 4.20 Mật độ vi khuẩn Acetobacter xylinum BC16 theo thời gian ủ trên chất nền S-BC và A-BC Bảng 4.21 Mật độ vi khuẩn trên S-BC theo thời gian bảo quản Bảng 4.22 Mật độ vi khuẩn trên A-BC theo thời gian bảo quản Bảng 4.23 Nồng độ chế phẩm A.xylinum BC16 trong lên men bề mặt Bảng 4.24 Sản lượng S-BC theo chu kỳ lên men tái sử dụng Bảng 4.25 Nồng độ chế phẩm A.xylinum BC16S 1 trong lên men chìm Bảng 4.26 Sản lượng A-BC theo chu kỳ lên men tái sử dụng Bảng 4.27 Trò số pH và acid tổng của sữa chua trong 10 lần lên men tái sử dụng chế phẩm Bảng 4.28 Độ chòu lực của sản phẩm kết dính bằng phương pháp lên men Bảng 4.29 Độ chòu lực của một số sản phẩm kết dính bằng bột BC DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, BIỂU ĐỒ Đồ thò 4.1 Xác đònh các điều kiện nhân giống cấp 2 của A. xylinum BC16 và BC16S 1 Đồ thò 4.2 Thành phần môi trường rỉ đường phù hợp kiểu lên men bề mặt Đồ thò 4.3 Thành phần môi trường rỉ đường phù hợp kiểu lên men chìm Đồ thò 4.4 Xác đònh điều kiện nhân giống cấp 2 của A. xylinum BC 17 Đồ thò 4.5 Thành phần môi trường nước mía phù hợp kiểu lên men bề mặt và lên men chìm Đồ thò 4.6 nh hưởng của pH ban đầu đến sản lượng BC trong lên men bề mặt và lên men chìm trên môi trường rỉ đường Đồ thò 4.7 nh hưởng của nhiệt độ trong quá trình lên men BC Đồ thò 4.8 Diễn biến sản lượng A-BC theo tốc độ quay của máy lắc Đồ thò 4.9 Diễn biến sản lượng A-BC theo phương thức khuấy đảo trong quá trình lên men Đồ thò 4.10 Biến động trong quá trình lên men bề mặt cellulose vi khuẩn trên môi trường rỉ đường ởâ phòng thí nghiệm Đồ thò 4.11 Biến động trong quá trình lên men chìm cellulose vi khuẩn trên môi trường rỉ đường ởâ phòng thí nghiệm Đồ thò 4.12 So sánh các biến động trong quá trình lên men bề mặt cellulose vi khuẩn trên môi trường rỉ đường ởâ phòng thí nghiệm và quy mô pilot Đồ thò 4.13 So sánh các biến động trong quá trình lên men chìm cellulose vi khuẩn trên môi trường rỉ đường ởâ phòng thí nghiệm và quy mô pilot Đồ thò 4.14 Các phương án cải thiện sản lượng A-BC ở quy mô pilot Đồ thò 4.15 So sánh mật độ tế bào theo thời gian ủ trên chất nền dạng S-BC và A-BC Đồ thò 4.16 M ật độ vi khuẩn phát triển trên chất nền qua cải tiến phương pháp hấp thụ Đồ thò 4.17 Mật độ vi khuẩn trên S-BC theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ mát Đồ thò 4.18 Mật độ vi khuẩn trên A-BC theo thời gian bảo quản ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ mát Đồ thò 4.19 Sản lượng S-BC theo chu kỳ tái sử dụng và so với đối chứng Đồ thò 4.20 Sản lượng A-BC theo chu kỳ tái sử dụng và so với đối chứng DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1 Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật Hình 2.2 So sánh đường kính của sợi cellulose vi khuẩn với các sợi tự nhiên và sợi nhân tạo Hình 2.3 Cấu trúc Bacterial Cellulose Hình 2.4 Cấu trúc A-BC và S-BC Hình 2.5 Cấu trúc Cellulose I và Cellulose II Hình 2.6 Cấu tạo một lỗ tiết cellulose Hình 2.7 Sơ đồ các con đường tổng hợp cellulose bởi A.xylinum Hình 2.8 Con đường tổng hợp cellulose từ cơ chất glucose Hình 2.9 Sơ đồ con đường tổng hợp cellulose bởi chủng đột biến kháng Sulfaguanidine A.xylinum BPR3001E Hình 3.1. Môt số phương thức trong quá trình nhân giống, lên men BC Hình 4.1 Sơ tuyển nhanh một số chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh cellulose Hình 4.2 Hình ảnh vi thể của một số chủng đại diện Hình 4.3 Hình ảnh đại thể khuẩn lạc một số chủng đại diện Hình 4.4 Quan hệ với oxy của một số chủng vi khuẩn Hình 4.5 Khả năng sinh trưởng phát triển và tạo màng BC của A.xylinum BC16 phù hợp với môi trường rỉ đường Hình 4.6 Hình ảnh sản phẩm BC Hình 4.7 Tế bào vi khuẩn A.xylinum trong mạng lưới cellulose Hình 4.8 Mạng lưới cellulose của hai dạng BC Hình 4.9 BC thô sau lên men Hình 4.10 Cố đònh vi khuẩn trên máy lắc Hình 4.11 Chế phẩm BC Hình 4.12 Lên men kết dính bằng phương pháp nhúng Hình 4.13 Sản phẩm kết dính xơ dừa bằng phương pháp nhúng [...]... hướng sử dụng BC làm vật liệu mới để tìm các ứng dụng trong nhiều liõnh vực khác nhau Đề tài Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng ở quy mô pilot nhằm : * Mục tiêu: - Sản xuất cellulose vi khuẩn ở quy mô pilot, để từng bước hướng tới sản xuất BC quy mô công nghiệp - Góp phần khai thác và mở rộng ứng dụng của cellulose vi khuẩn Để đạt được... lên men cellulose vi khuẩn ở phòng thí nghiệm - Đa dạng các kiểu lên men cellulose vi khuẩn : lên men bề mặt, lên men chìm 4 Thử nghiệm lên men cellulose vi khuẩn quy mô pilot - Lên men bề mặt quy mô pilot trên diện tích rộng 1,5m2 - Lên men bề mặt quy mô pilot trên khay nhỏ - Lên men chìm quy mô pilot 5 Tìm các ứng dụng mới của cellulose vi khuẩn (BC): - Sử dụng BC làm chất nền ( matrix) để cố đònh... đònh tế bào vi khuẩn - Sử dụng BC làm giá đỡ (supporter) để lên men bán rắn thu sinh khối vi sinh vật - Sử dụng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum làm tác nhân kết dính * Những điểm mới của luận án: Các điểm mới ở Vi t nam: - Luận án là công trình đầu tiên ở Vi t Nam nghiên cứu có hệ thống và đồng bộ quá trình lên men sản xuất cellulose vi khuẩn từ quy mô phòng thí nghiệm đến quy mô pilot qua các khâu:... dụng mới của BC : - Sử dụng BC làm chất nền ( matrix) để cố đònh tế bào vi khuẩn - Dùng BC làm giá đỡ (supporter) để thu sinh khối vi sinh vật Nhờ 2 ứng dụng này đã tạo ra chế phẩm vi khuẩn Acetobacter xylinum , giúp thuận lợi hơn trong sản xuất BC ở quy mô lớn - Sử dụng tế bào vi khuẩn Acetobacter xylinum làm tác nhân kết dính 4 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cellulose vi khuẩn Năm 1886, A.J Brown... nhân giúp xác đònh các dạng kết tinh của cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn có đường kính bằng 1/100 đường kính của cellulose thực vật ( hình 2.1) Cellulose vi khuẩn có cấu trúc siêu mòn và độ chòu lực của cellulose vi khuẩn gần bằng với độ chòu lực của nhôm Khi đem so sánh đường kính của cellulose vi khuẩn và đường kính của các sợi nhân tạo cho thấy: kích thước của cellulose vi khuẩn còn nhỏ hơn... sự tổng hợp cellulose của vi khuẩn Acetobacter xylinum Tuy nhiên mãi đến nửa sau thế kỷ XX, cellulose vi khuẩn mới thực sự được chú ý 2.1.1 Cấu trúc cellulose vi khuẩn Các kỹ thuật hiện đại đã xác đònh được cấu trúc của cellulose vi khuẩn Kỹ thuật nhiễu xạ tia X phân biệt các dạng cấu trúc và kích thước của cellulose vi khuẩn Các kỹ thuật phổ Rama, phân tích phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt... dinh dưỡng và oxy đến tế bào Lớp màng cellulose do vi khuẩn A .xylinum tạo ra bao xung quanh môi trường hạn chế nguồn oxy từ bên ngoài vào môi trường, điều này ngăn cản sự cung cấp oxy cho các vi khuẩn hiếu khí khác, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình cạnh tranh sinh tồn của vi khuẩn A .xylinum Màng cellulose có khả năng giữ nước nên giúp cho vi khuẩn phân huỷ các chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế... tác bởi enzyme exo- hay endo-glucanase Các enzyme exo- hay endo-glucanase phân huỷ cellulose được phát hiện trong dòch nuôi cấy ở một vài chủng A .xylinum sản xuất cellulose [46,54,88] 2.3 Lên men thu nhận cellulose vi khuẩn 2.3.1 Nguồn nguyên liệu cho quá trình lên men sản xuất cellulose vi khuẩn 2.3.1.1 Môi trường nước dừa Hiện nay tại Vi t Nam và một số quốc gia khác, nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản. .. của cellulose trong tự nhiên là cellulose I và cellulose II, được phân biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ và tia hồng ngoại ( hình 2.5)[80] Tùy vào điều kiện môi trường nuôi cấy và giống vi khuẩn mà cellulose dạng nào chiếm ưu thế Cellulose I có thể chuyển hóa thành cellulose II, nhưng cellulose II không thể chuyển hóa thành cellulose I 8 a) b) Hình 2.5 Cấu trúc cellulose I (a )và cellulose. .. tổng hợp ở một vài sinh vật (một số tảo, nấm mốc và vi khuẩn như Sarcina 9 ventriculi, Acetobacter xylinum) [23] Hiện nay, sản phẩm công nghiệp của cellulose II chủ yếu có được là dựa trên sự biến đổi hóa học cellulose thực vật 2.1.2 Một số tính chất của cellulose vi khuẩn Chung và Shyu(1999) đã nghiên cứu các tính chất của BC như độ cứng, độ dính, độ dai và ảnh hưởng của dung dòch đường, muối và các chất