ĐÃT VẨN ĐỂ Hiện nay, cùng với bệnh ung thư và tim mạch, đái tháo đường là một trong ba bệnh được thế giới quan tâm nhiều bởi đây là một bệnh mạn tính thường có nhiều biến chứng nguy hiểm với số người mắc tăng nhanh, chi phí cho điều trị cao do phải sử dụng thuốc lâu dài và thường xuyên. Do vậy, việc tìm ra một thuốc có tác dụng điều trị tốt, giá cả phù hợp, ít tác dụng phụ là mục tiêu của nhiều nghiên cứu về thuốc điều trị bệnh này. Để phòng và điều trị đái tháo đường, từ lâu nhân dân ta đã sử dụng Mướp đắng theo kinh nghiệm dân gian một cách rộng rãi và có hiệu quả. Đồng thời, có nhiều công trình nghiên cứu trong và ngoài nước đều đi đến kết luận: trong các bộ phận khác nhau của Mướp đắng (thân, lá, quả...) chứa các thành phần có tác dụng gây hạ đường huyết trên động vật thí nghiệm cũng như trên người 1, 5, 6, 7, 16. Đặc biệt, Phạm Văn Thanh (Viện Dược Liệu) đã chiết xuất và bào chế thành công viên nang với thành phần chính là glycosid quả Mướp đắng, kết quả thử nghiệm lâm sàng cho thấy chế phẩm này gây hạ đường huyết đáng kể trên người bệnh đái tháo đường 5. ở nước ta, mặc dù Mướp đắng đã được nghiên cứu và ứng dụng từ lâu nhưng cơ chế hạ đường huyết của Mướp đắng vẫn là một câu hỏi chưa có lời giải đáp. Đến nay, các nghiên cứu đưa ra nhiều 2 Ìả thuyết khác nhau về cơ chế hạ đường huyết của Mưóỉp đắng như; > Tác dụng tại tụy: Kích thích tế bào beta của đảo tụy tăng tiết insulin 16. > Tác dụng ngoài tụy : a. ức chế tổng hợp glucose bằng cách ức chế các enzym tân tạo đường như GóPase; Fl,6DPase 17.
B ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI ************************ NGUYỄN THANH M NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA GLYCOSID TOÀN PHẦN TỪ QUẢ MƯỚP ĐẮNG {MOMORDIGA CHARANTIA) LÊN HOẠT ĐỘ ENZYM GLUCOSE-6-PHOSPHATASE CỦA GAN CHUỘT TÃNG ĐƯỜNG HUYẾT THựC NGHIỆM (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2001-2006) Người hướng dẫn : Ths Phùng Thanh Hương Nơi thực : Bộ mơn Hóa sinh Trường Đại học Dược Hà nội Thời gian thực hiện: 512005-5 12006 Hà Nội-5/2006 J ¿ é i C Ẩ ỈU I đ n ^ Em xỉn bày tỏ lồng biết ơn sáu sắc, khâm phục yêu qúy tới Cô giáo: Ths Phùng Thanh Hương - người tận tình, chu đáo hướng dần em q trình làm khố luận giúp em trưởng thành sông Em xin gửi tới Thầy giáo - GS.TS Nguyễn Xuân Thắng, người giúp đỡ cho em lời khun q giá q trình làm khố luận - lời cảm ơn chán thành Em xin cảm ơn Thầy giáo, Cô giáo, chị em kỹ thuật viên - mơn Hóa sinh, trường Đại học Dược Hà Nội - tạo điều kiện giúp đỡ để em hồn thành khố luận Em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn tới Thầy, Cơ giáo trường Đại học Dược Hà Nội tận tình giảng dạy để chúng em có ngày hơm Sinh viên: Nguyễn Thanh Mơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN Đ Ể PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 Bệnh đái tháo đường: 1.1.1 Khái niệm: 1.1.2 Dịch tễ: 1.2 Các dược liệu điều trị ĐTĐ xu hướng nghiêncứu chế tác dụng: 1.3 Mướp đắng: 1.3.1 Sơ lược Mướp đắng: 1.3.1 Tác dụng hạ đường huyết Mưófp đắng: 1.4 Enzym Glucose-6-phosphatase: 10 1.4.1 Đại cương enzym GóPase: 10 1.4.2 Vai trò Glucose-6-phosphatase điều hòa đường huyết bệnh đái tháo đường; 15 1.4.3 Một số phương pháp xác định hoạt độ enzymGóPase: .15 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ .18 2.1 Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu: .18 2.2 Phương pháp nghiên cứu: 19 2.2.1 Khảo sát phương pháp định lượng hoạt độ enzymGóPase: 19 2.2.2 Phương pháp xác định giá trị hoạt độ enzym GóPase gan chuột bình thường: 20 2.2.3 M c định ảnh hưởng glycosid Mướp đắng lên hoạt tính enzym GóPase gan chuột tăng đường huyết thực nghiệm với liều Iglkg: 20 2.2.4 Xác định ảnh hưởng glycosỉd Mướp đắng lên hoạt tính emym GóPase gan chuột tăng đường huyết thực nghiệm STZ với liềulOOmg/kg: 20 2.2.5 Phương pháp định lượng phospho vô (phương pháp FISKE SUBBAROW, kỹ thuật VANDEN-CARAVAY): 21 2.2.6 Phương pháp đo đường huyết dùng glucose oxidase: .21 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu: 21 2.3 Thực nghiệm kết quả: 22 2.3.1 Xây dựng đường chuẩn mật độ quang dung dịch phospho: 22 2.3.2 Khảo sát phương pháp định lượng hoạt độ enzym GổPase: 23 2.3.3 Hoạt độ enzym GóPase gan chuột bình thường: 26 2.3.4 Ảnh hưởng glycosid Mướp đắng lên hoạt tính enzym GổPase gan chuột nhắt trắng tăng đường huyết adrenalin liều Ig/kg: 28 PHẦN 3: BÀN LUẬN 30 3.1 Phương pháp xác định hoạt độ enzym GóPase: 30 3.2 Hoạt độ enzym GóPase chuột bình thường: 31 3.3 Về khả hạ glucose máu glycosid Mướp đắng: 32 3.4 Hoạt độ enzym GóPase mơ hình tăng đưịfng huyết adrenalin (Ig/kg): .32 3.5 Hoạt độ enzym GóPase mơ hình tăng đưịfng huyết STZ; 33 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 36 4.1 KẾT LUẬN: 36 4.2 ĐỂ XUẤT: 37 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ĐTĐ Đái tháo đường Fl,6DPase Fructose-1,6 Diphosphatase G6P Glucose phosphat GóPase Glucose-6-phosphatase G6PD Glucose-6-phosphat dehydrogenase GK Glucokinase GS Glycogen synthase HĐE Hoạt độ enzym MD Malate dehydrogenase SD Succinate dehydrogenase STZ Streptozotocin TĐH Tăng đường huyết WHO Tổ chức Y tế giới ĐÃT VẨN ĐỂ Hiện nay, với bệnh ung thư tim mạch, đái tháo đường ba bệnh giới quan tâm nhiều bệnh mạn tính thường có nhiều biến chứng nguy hiểm với số người mắc tăng nhanh, chi phí cho điều trị cao phải sử dụng thuốc lâu dài thường xuyên Do vậy, việc tìm thuốc có tác dụng điều trị tốt, giá phù hợp, tác dụng phụ mục tiêu nhiều nghiên cứu thuốc điều trị bệnh Để phòng điều trị đái tháo đường, từ lâu nhân dân ta sử dụng Mướp đắng theo kinh nghiệm dân gian cách rộng rãi có hiệu Đồng thời, có nhiều cơng trình nghiên cứu nước đến kết luận: phận khác Mướp đắng (thân, lá, ) chứa thành phần có tác dụng gây hạ đường huyết động vật thí nghiệm người [1], [5], [6], [7], [16] Đặc biệt, Phạm Văn Thanh (Viện Dược Liệu) chiết xuất bào chế thành cơng viên nang với thành phần glycosid Mướp đắng, kết thử nghiệm lâm sàng cho thấy chế phẩm gây hạ đường huyết đáng kể người bệnh đái tháo đường [5] nước ta, Mướp đắng nghiên cứu ứng dụng từ lâu chế hạ đường huyết Mướp đắng câu hỏi chưa có lời giải đáp Đến nay, nghiên cứu đưa nhiều Ìả thuyết khác chế hạ đường huyết Mưóỉp đắng như; > Tác dụng tụy: Kích thích tế bào beta đảo tụy tăng tiết insulin [16] > Tác dụng tụy : a ức chế tổng hợp glucose cách ức chế enzym tân tạo đường GóPase; Fl,6DPase [17] b Tăng cường vận chuyển glucose vào mô [17], [16] c Tăng cường oxi hóa glucose cách hoạt hóa enzym glucose-6-phosphat dehydrogenase [16] > Chứa thành phần có tác dụng tương tự insulm [17], [16] > Mướp đắng có tác dụng thu nhặt, loại trừ gốc tự Superoxyd hydroxyl gốc có liên quan đến đái tháo đường [16], [17] GóPase enzym xúc tác cho phản ứng cuối trình tân tạo đường, hoạt tính enzym ảnh hưởng đến nồng độ đường huyết Mặt khác, nghiên cứu nước ngồi cho thấy, nhiều thuốc có tác dụng hạ đường huyết thông qua ức chế hoạt tính enzym GóPase Hơn nữa, Việt Nam chưa có nghiên cứu phương pháp xác định hoạt độ enzym GóPase Việc xây dựng phương pháp xác định hoạt độ GóPase phù hợp, hiệu để góp phần vào nghiên cứu thực nghiệm khác vấn đề cần giải Xuất phát từ thực tế trên, thực đề tài vói mục tiêu sau : Khảo sát phương pháp xác định hoạt độ enzym GóPase thơng qua kỹ thuật định lượng phospho vơ Fiske Subbarow Xác định giá trị hoạt độ enzytn GóPase gan chuột nhắt trắng chuột cống trắng bình thường Nghiên cứu ảnh hưởng glycosid tồn phần từ mướp đắng lên hoạt tính enzym GóPase gan chuột tăng glucose huyết thực nghiệm PHẨN I; TỔNG QUAN 1.1 Bệnh đái tháo đường: 1.1.1 Khái niêm: Theo định nghĩa WHO, Đái tháo đưòỉng {Diabete Mellitus) “tình trạng tăng glucose huyết mạn tính” [10] Trên thực tế, tập hợp rối loạn chuyển hố có biểu chung tăng nồng độ glucose máu, với nguyên nhân giảm tuyệt đối tương đối tác dụng và/hoặc tiết insulin ĐTĐ phân loại theo nhiều cách khác Dựa nguyên bệnh, Hiệp hội ĐTĐ Mỹ (1997) phân chia ĐTĐ thành loại sau [10], [25]: ■ ĐTĐ typ I: tổn thương tế bào beta dẫn đến thiếu hụt insulin hoàn toàn, với nguyên sau: * Miễn dịch qua trung gian tế bào * Không rõ nguyên nhân ■ ĐTĐ typ II: từ tình trạng kháng insulin kèm theo thiếu hụt insulin tương đối đến tình trạng thiếu hụt tiết insulin kèm theo đề kháng insulin ■ Các typ ĐTĐ đặc hiệu khác 1.1.2 Dich tễ: Theo ước tính WHO, năm 2000 tồn giới có khoảng 171 triệu người mắc bệnh theo dự đoán đến năm 2030, số người mắc bệnh tăng lên đến 366 triệu [10], [25] Đáng ý bệnh có xu hướng gia tăng mạnh quốc gia phát triển châu Phi, châu Mỹ La tinh châu Á, có Việt Nam Việt Nam, đái tháo đường bệnh thưịng gặp có tỷ lệ tử vong cao bệnh nội tiết Thống kê năm 2000 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh Hà Nội 4%, thành phố Hồ Chí Minh 4% [2] Với tính chất bệnh mạn tính, kéo dài gần suốt đời, lại kèm theo nhiều biến chứng nguy hiểm, ĐTĐ không làm giảm chất lượng sống người bệnh mà gây gánh nặng kinh tế làm giảm lực lượng lao động xã hội chi phí tốn cho điều trị Vì lí đó, ĐTĐ khơng vấn đề riêng ngành y tế mà trở thành vấn đề chung xã hội, đòi hỏi phải quan tâm nghiên cứu nhiều 1.2 Các dươc liêu điều tri ĐTĐ xu hưởng nghiên cứu chẽ tác dung; Thuốc điều trị đái tháo đường chia làm hai nhóm chính: Thuốc tân dược thuốc có nguồn gốc từ dược liệu Có nhiều nhóm thuốc tân dược sử dụng điều trị đái tháo đưịfng (insulin, sulfonylurea, nhóm biguanid ) nhiên nhược điểm hầu hết thuốc có nhiều tác dụng phụ, chi phí điều trị cao Từ lâu nay, nhân dân ta khai thác nguồn tài nguyên thuốc phong phú Việt Nam để dùng thuốc cổ truyền điều trị ĐTĐ Rất nhiều loài quen thuộc Chè xanh {Camellia sinensis), cỏ (Stevia rebaudiana), Cải xoong {Nasturtium ojficinal) dùng hàng ngày để phòng điều trị ĐTĐ theo kinh nghiệm dân gian, vừa mang lại hiệu tốt, lại tác dụng phụ độc tính, đặc biệt dễ kiếm rẻ tiền, Việc khai thác sử dụng thuốc có nguồn gốc tự nhiên điều trị bệnh xu hướng chung giới Không dừng lại việc sử dụng thuốc theo kinh nghiệm dân gian, nhiều nghiên cứu Việt Nam giới khẳng định tác dụng tìm chế nhiều dược liệu Lô hội {Aỉoe vera) ví dụ Nghiên cứu tác giả s Rajasekaran cộng (2004) cho thấy điều trị dài ngày dịch chiết ethanol Lô hội cho chuột cống đái tháo đưòfng gây STZ (55mg/kg) làm giảm đường huyết cách có hiệu khơng có biểu độc tính cấp Đồng thời nghiên cứu làm sáng tỏ chế hạ đường huyết Lô hội: tăng tổng hợp glycogen (139%) kích thích enzym glycogen synthase (tăng hoạt tính 50%) ức chế enzym glycogen phosphorylase (giảm hoạt tính 29%); làm tăng hoạt tính hexokinase (98%) giảm hoạt tính enzym: lactat dehydrogenase (46%), glucose-6-phosphatase (44%), fructose 1,6 diphosphatase (32%) [10] Năm 2001, nghiên cứu Peter Natesan Pushparạị cộng chế hạ đường huyết Averrhoa bilimbỉ cho kết tương tự Dịch chiết ethanol dược liệu gây hạ đường huyết cách có ý nghĩa chuột đái tháo đường STZ A.bilimbi tác động vào nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nồng độ glucose máu: tăng nồng độ insulin huyết thanh, ức chế hoạt tính enzym glucose-6-phosphatase gan, tăng dự trữ glycogen gan [19] Một dược liệu quan trọng dùng điều trị ĐTĐ Thổ phục linh (Smiỉax glabra) T Fukunaga (1997) ghi nhận dịch chiết methanol từ thân rễ Thổ phục linh có tác dụng hạ glucose huyết chuột nhắt bình thưịfng chuột ĐTĐ typ [28] Từ thân rễ Thổ phục linh, nhà khoa học tách hoạt chất gây hạ glucose huyết như; phenylpropanoid, glycosid số flavonoid Việt Nam, Nguyễn Ngọc Xuân Đào Văn Phan xác định ảnh hưởng Thổ phục linh lên nồng độ glucose insulin máu chuột cống ĐTĐ di truyền chủng GK đảo tuỵ lập [3] Ngồi ra, có nhiều dược liệu có tác dụng gây hạ đường huyết khác nghiên cứu Việt Nam nói riêng giới nói chung Tri mẫu 2.3.3.2 Hoat emym GóPase san cht cốns trắne: Chuột cống trắng sau cho nhịn đói 12h, đo đưịmg huyết hoạt độ enzym GóPase Kết thu trình bày bảng 10: Bảng 10: Đường huyết hoạt độ enzym GóPase chuột cống trắng bình thường Chuột Đường huyết Chuôt đực 10 TB 5,7 5,5 5,3 5,9 5,4 5,2 5,8 5,6 5,1 5,5 5,5± 0,5 45,9 47,2 47,7 47,6 46,5 44,0 44,1 44,2 45,0 46,5 45,8±1,8 10 TB 5,1 5,2 5,5 5,7 5,2 5,4 6,0 5,4 5,8 5,0 5,4±0,6 46,6 45,5 46,0 46,1 45,2 45,0 43,1 Hoạt độ GóPase Chuột Đường huyết (mmol/1) (//mol/phút/g) Chuột (mmol/1) Hoạt độ GóPase (/ymol/phút/g) 45,3 44,2 45,4 27 45,3±2,2 2.3.4 Ảnh hưởng glycosid Mướp đắng lên hoạt tính enzyni GóPase gan chuột nhắt trắng tăng đường huyết adrenalin liều Ig/kg: Cũng tiến hành trên, kết thu bảng 11: Bảng 11: Đưòtig huyết hoạt độ enzym GóPase gan chuột mơ hình TĐH adrenalỉn Đường huyết (mmol/1) Hoạt độ enzym Mức TĐH Chỉ số t=0 t=l(giờ) so với t=0 Mức thav ụ mol/phút/g đổi HĐE (%) (%) Lơ bình thưịíng Lơ chứng (uông nước cất) Lô thử (uống glycosid) 5,1 47,5±1.2 6,1±0,5 15,1±0,6 147,5 43,0 -9,5(*)(2) 5,7±0,6 10,3±0.9 80,7(*) 28,1 -34,6(*)(1) 5,9±0.4 6,2±0,5 với lơ bình thường (*) p