Phương pháp này được sử dụng để đo đường huyết trong toàn bộ quá trình nghiên cứu cùng với máy đo đường huyết tự động.
Nguyên tắc: Phản ứng oxi hóa glucose thành acid gluconic được xúc tác bởi glucose oxidase theo phản ứng (1)
Glucose + H 2 o + o 2 — acid gluconic + H 2 o 2 (1)
0-dianisidin + H 2 o 2 ---> phức hợp màu nâu vàng + H 2 o (2)
H2 02tạo thành sẽ bị peroxidase phân huỷ và giải phóng oxy, oxy hóa O- Dianisidin để tạo thành phức chất có màu vàng nâu theo phản ứng (2).
Cường độ màu xác định bằng phương pháp đo quang tương ứng với lượng glucose trong mẫu cần định lượng.
2.2.7. Phương pháp xử lý sô liệu:
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê với sự hỗ trợ của phần mềm Excel 2003. Sự khác biệt có ý nghĩa khi p<0,05.
2.3. Thưc nghiêm và kết quả:
2.3.1. Xây dựng đường chuẩn về mật độ quang của dung dịch phospho:
Pha các dung dịch KH2PO4 có nồng độ lần lượt là: 1; 2; 2,5; 3; 4 X 10'^%(kl/tt) tính theo p vô cơ.
Đong vào mỗi ống nghiệm sạch có vạch đánh dấu lOml theo thứ tự sau: ■ 2ml mỗi dung dịch trên.
■ 2,5ml dung dịch tricloacetic. ■ 1 giọt p-nitrophenol.
■ Trung hòa bằng Iml amoniac, ■ Iml dung dịch amonimolypdat. ■ 0,4ml dung dịch eikonogen.
Lắc kỹ, để trong bóng tối 10 phút, đo mật độ quang tại bước sóng 660nm được kết quả trình bày ở bảng 1.
Bảng 5: Mật độ quang của các nồng độ dung dịch phosphat khác nhau
Nồng độ
phospho (%kl/tt) 1,0.10-" 2,0.10-" 2,5.10-^ 3,0.10-" 4,0.10-^
A 0,184 0,385 0,506 0,636 0,884
I— --- --- ---L__---
Từ kêt quả trên ta có đường chuân như sau:
Cpx 1000(%kt/tt)
Hình 3: Đồ thị tương quan giữa nồng độ phospho và mật độ quang
Từ đường chuẩn trên ta nhận thấy: ở bước sóng 660nm, trong giới hạn cho phép, nồng độ phospho trong dung dịch tỷ lệ thuận với mật độ quang thu được. Như vậy, có thể sử dụng phương pháp dùng một dung dịch chuẩn phospho biết trước nồng độ để định lượng một dung dịch phospho khác bằng cách đo mật độ quang tại bước sóng 660nm.
2.3.2. Khảo sát phương pháp định lượng hoạt độ enzym G6Pase:
23.2.1. Sự thay đổi mật độ quang của các dung dịch theo lượng dịch enzym sử dụng:
Với các lượng enzym xúc tác khác nhau, giá trị mật độ quang thu được như sau:
Bảng 6: Giá trị mật độ quang đo được tương ứng với những lượng enzym xúc tác Lương enzym xúc tác (ml) Mật độ quang 0,2 0,295 0,3 0,402 0,4 0,605 0,5 0,685 Đồ thị tưofng ứng có được là 0,8 0,7 0,6 - 0,5 A 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 y=1,73x + 0,0162 R? = 0,9734 0.2 0,4 Lượng enzym xúc tác (ml) 0,6
Hình 4: Đồ thị tương quang giữa mật độ quang và lượng enzym xúc tác
Qua đồ thị trên, chúng ta thấy, mật độ quang thu được trong giới hạn đã khảo sát tỷ lệ thuận với lượng enzyme tham gia xúc tác với cùng một lượng cơ chất. Tức là lượng enzym xúc tác càng lớn sẽ giải phóng ra một lượng phospho vô cơ càng lớn
2.3.22. Sự thay đổi mật độ quang của các dung dịch theo thời gian xúc tác:
Với lượng enzym xúc tác không đổi là 0,2 ml và cùng một lượng cơ chất như nhau, khi ủ trong những khoảng thời gian như nhau, mật độ quang thay đổi như bảng và đồ thị sau:
Bảng 7; Giá trị mật độ quang tương ứng với các lượng thòi gian xúc tác
Thời gian xúc tác (phút) Mât đô quang
10 0,289 12 0,354 14 0,395 16 0,442 18 0,501 20 0,576
Đồ thị thu được tương ứng ở hình 5:
Hình 5: Đồ thị tương quan giữa mật độ quang và thời gian xúc tác
Đồ thị trên cho thấy: trong điều kiện và thời gian đã khảo sát mật độ quang của dung dịch tỷ lệ thuận với thời gian phản ứng.
2.32.3. Độ lặp lại của kết quả trên cùng một mẫu gan:
Với mỗi mẫu gan sau khi nghiền với đệm và ly tâm thu dịch enzym để xác định hoạt độ được lấy 4 mẫu (mỗi mẫu 0,2 ml) dịch enzym để tiến hành xác định hoạt độ song song. Kết quả thu được như sau:
Bảng 8: Giá trị hoạt độ enzym của các mẫu định lượng song song từ một mẫu gan Chuột 1 2 3 4 5 Đường huyết (mmol/1) 6,1 5,9 5,7 6,5 5,6 Mẫu 1 (//mol/phút/g) 47,5 47,6 45,4 46,5 46,8 Mẫu 2 (/imol/phút/g) 47,3 48,5 46,1 45,9 46,0 Mẫu 3 (//mol/phút/g) 46,9 48,3 46,3 46,9 46,5 Mẫu 4 ( ^ mol/phút/g) 47,1 48,1 45,6 46,4 46,1
^ Độ lệch chuẩn tương đối giữa các mẫu lớn nhất là RSD = như vậy, phưofng pháp xác định hoạt độ enzym này có độ lặp lại và đáng tin cậy để sử dụng trong nghiên cứu.
2.3.3. Hoạt độ enzym GổPase của gan chuột bình thường:
23.3.1. Hoạt độ emym GóPase của gan chuột nhắt trắng:
Chuột nhắt trắng sau khi cho nhịn đói 12h, đo đường huyết và hoạt độ enzym GóPase. Kết quả thu được trình bày ở bảng 9:
Bảng 9: Đường huyết và hoạt độ enzyiĩi GóPase của chuột nhắt tráng bình thường
Chuột đực Chuột 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TB Đường huyêt (mmol/1) 6,7 5,5 5,6 6,3 6,7 5,7 5,8 6,6 6,8 5,9 6,2 ±0,4 Hoạt độ GóPase (/iiĩiol/phút/g) 46,9 49,2 47,4 47,6 46,5 47,0 46,1 45,2 45,0 49,0 47,0±2,2 Chuột cái Chuột 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TB Đường huyêt (mmol/1) 6,5 5,9 5,6 6,8 6,3 5,8 5,8 5,9 6,8 6,9 6,3±0,6 Hoạt độ GóPase (//mol/phút/g) 45,9 48,2 47,4 49,5 46,2 47,6 45,9 45,2 45,5 49,2 47,1 ±2,4 26
2.3.3.2. Hoat đô emym GóPase của san chuôt cốns trắne:
Chuột cống trắng sau khi cho nhịn đói 12h, đo đưòmg huyết và hoạt độ enzym GóPase. Kết quả thu được trình bày ở bảng 10:
Bảng 10: Đường huyết và hoạt độ enzym GóPase của chuột cống trắng bình thường
Chuột 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TB Chuôt Đường huyết (mmol/1) 5,7 5,5 5,3 5,9 5,4 5,2 5,8 5,6 5,1 5,5 5,5± 0,5 đực Hoạt độ GóPase (//mol/phút/g) 45,9 47,2 47,7 47,6 46,5 44,0 44,1 44,2 45,0 46,5 45,8±1,8 Chuột 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TB Chuột Đường huyết (mmol/1) 5,1 5,2 5,5 5,7 5,2 5,4 6,0 5,4 5,8 5,0 5,4±0,6 cái Hoạt độ GóPase (/ymol/phút/g) 45,3 44,2 45,4 46,6 45,5 46,0 46,1 45,2 45,0 43,1 45,3±2,2 27
2.3.4. Ảnh hưởng của glycosid quả Mướp đắng lên hoạt tính enzyni GóPase gan chuột nhắt trắng tăng đường huyết bởi adrenalin liều Ig/kg:
Cũng tiến hành như trên, kết quả thu được ở bảng 11:
Bảng 11: Đưòtig huyết và hoạt độ enzym GóPase của gan chuột ở mô hình TĐH do adrenalỉn
Chỉ số
Đường huyết (mmol/1) Hoạt độ enzym
t=0 t=l(giờ) Mức TĐH so với t=0 (%) ụ. mol/phút/g Mức thav đổi HĐE (%) Lô bình thưòíng 5,9±0.4 6,2±0,5 5,1 47,5±1.2 Lô chứng (uông nước cất) 6,1±0,5 15,1±0,6 147,5 43,0 -9,5(*)(2) Lô thử (uống glycosid) 5,7±0,6 10,3±0.9 80,7(*) 28,1 -34,6(*)(1)
với lô bình thường (*) p<0,05. Từ kết quả trên ta thấy;
^ Mức tăng đường huyết của lô chứng cao hơn lô thử (p<0,05). Hoạt độ enzym ở lô thử giảm 34,6% so với lô chứng (p<0,05). Hoạt độ enzym ở lô chứng giảm 9,5% so với lô bình thường.
2.3.5. Ảnh hưởng của glycosỉd Mướp đắng lên hoạt độ enzym GóPase của gan chuột cống trắng tăng đường huyết bởi STZ liều lOOmg/kg :
Sau khi gây bệnh và điều trị một tuần, mức đường huyết cũng như giá trị hoạt độ enzym giữa lô chứng và lô thử có sự thay đổi như bảng 12:
Bảng 12; Đường huyết và hoạt độ enzym G6Pase của gan chuột ở mô hình TĐH do STZ
Đường huyết (mmol/1) Hoạt độ enzym
Chỉ số t=0 t=7 (ngày) Mức TĐH so với t=7 (%) mol/phút/g Mức thay đổi HĐE (%) Lô bình thường 5,2±0,5 4,8±0,3 -7,69(**) 43,5
Lô chứng (uông nước cât) 5.0±0,4 10,9±0,6 118,0 71,2 +63,7(*)(2) Lô thử (uông glycosid) 4,7±0,3 6,3±0.9 34,4 (*) 45,1 -35,7(*)(1)
(1) Mức thay đổi HĐE so với lô chứng.(2) Mức thay đổi HĐE so với lô bình thường (**) p>0,05, (*) p<0,05.
Nhận xét:
Đường huyết ở lô điều trị bằng glycosid tăng thấp hơn lô chứng. Sự khác nhau này có ý nghĩa thống kê (p<0,05).
Hoạt độ của enzym GổPase ở lô thử giảm 35,7% (p<0,05) so với lô chứng.
Hoạt độ enzym GổPase ở lô chứng và lô bình thường thay đổi nhiều: Lô chứng tăng cao hơn lô bình thường 63,7% (p<0,05).
PHẨN 3: BÀN LUẬN
3.1. Phương pháp xác định hoạt độ của enzym GóPase:
Nguyên tắc chung để xác định hoạt độ của một enzym là xác định lượng cơ chất được enzym đó xúc tác tham gia phản ứng. Tuy nhiên, trong trường hợp lượng cơ chất tham gia phản ứng không thể hoặc khó xác định được thì có thể tính gián tiếp thông qua lượng sản phẩm tạo thành sau phản ứng.
Đối với enzym GóPase, đây một enzym xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết este giữa nhóm phosphat và đường giải phóng ra đường tương ứng và phosphat vô cơ nên hoạt độ của enzym này được xác định thông qua lượng đường hoặc lượng phospho vô cơ giải phóng sau phản ứng. ở đây, chúng tôi định lượng lượng phospho vô cơ giải phóng theo phương pháp Fiske và Subbaraw.
Có ba cách làm ngừng phản ứng trước khi tiến hành định lượng phospho như đã nêu ở phần tổng quan. Qua phân tích ưu và nhược điểm của mỗi phương pháp cho thấy dùng acid trichloroacetic là phương pháp đơn giản hiệu quả nhất. Do đó trong nghiên cứu này, phương pháp xác định hoạt độ của GóPase được dùng là phương pháp thứ 3 đã được nêu ở phần tổng quan: Làm ngừng phản ứng bằng acid trichloroacetic 10%. Hỗn hợp phản ứng sẽ bị acid hoá và gây tủa protein (trong đó có enzym) dẫn đến mất hoạt tính của enzym. Sau đó, phospho vô cơ giải phóng ra được định lượng theo phương pháp Fiske và Subbaraw.
Mặt khác, qua kết quả khảo sát về mức độ tuyến tính của lượng phospho vô cơ giải phóng ra theo thời gian và lượng enzym dùng để xúc tác ở trên cho thấy:
> Với lượng cơ chất không đổi là 0,2 ml (0,05 M), khi dùng các thể tích dịch enzym khác nhau: 0,2- 0,5 ml (Ig gan /40ml đệm) để xúc tác giải
phóng ra những lượng phospho vô cơ tỷ lệ thuận với lượng enzym xúc tác.
> Trong khoảng thời gian xảy ra phản ứng từ 10- 20 phút, lượng phospho vô cơ giải phóng ra cũng tỷ lệ thuận theo thời gian phản ứng.
> Đối với cùng một mẫu gan, sau khi nghiền và tạo thành dịch enzym dùng để xác định hoạt độ, giá trị hoạt độ enzym thu được từ kết quả của 4 mẫu dịch enzym khác nhau tiến hành định lượng song song lặp lại và ổn định.
Như vậy, có thể tính hoạt độ enzym theo đơn vị : ụ mol p/ phút/gam và áp dụng phương pháp xác định hoạt độ enzym này để so sánh hoạt độ G6Pase.
3.2. Hoạt độ enzym GóPase của chuột bình thường:
Theo kết quả thu được từ thực nghiệm, ở điều kiện xúc tác: T® = 37 °c,
pH=6,8 với phương pháp định lượng đã nêu ở trên giá trị hoạt độ enzym của chuột bình thường với mức đường huyết tương ứng như sau:
Bảng 13: Hoạt độ enzym của chuột bình thường với mức đường huyết tương ứng
Chuột Đường huyết
(mmol/1)
Hoạt độ enzym mol/phút/g)
Chuột nhắt trắng giống cái 6,3±0,6 47,1±2,4
Chuột nhắt trắng giống đực 6,2 ±0,4 47,0±2,2
Chuột cống trắng giống cái 5,4±0,6 45,3±2,2
Chuột cống trắng giống đực 5.5± 0,5 45,8±1,8
Không chỉ phụ thuộc vào phương pháp xác định, các chỉ số sinh lý còn thay đổi theo mỗi cá thể, giống, loài. Tuy nhiên, sự thay đổi này đáng kể hay
không còn phụ thuộc vào từng chỉ số cụ thể. Đối với hoạt độ GổPase, so sánh kết quả thu được giữa chuột đực và chuột cái không có sự khác nhau nhiều. Do vậy, khi lựa chọn chuột để thực hiện các thí nghiệm liên quan đến hoạt độ enzym GóPase không nhất thiết phải lựa chọn về giống. Mặt khác, cho đến nay ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu nào công bố về hoạt độ enzym GóPase trên chuột bình thường, do đó những kết quả thu được trong nghiên cứu của chúng tôi là những kết quả quan trọng bước đầu để cung cấp cho các nghiên sau này.
3.3. Vê khả năng hạ glucose máu của glycosid quả Mướp đáng:
Từ các kết quả trên, một lần nữa có thể khẳng định khả năng hạ đường huyết của glycosid Mướp đắng. Theo nghiên cứu của Phạm Văn Thanh (Viện Dược Liệu) thì khả năng hạ glucose máu của glycosid Mướp đắng tăng đáng kể khi phối hợp với bột tiêu [4]. Tuy nhiên chưa xác định được một tỷ lệ thích hợp giữa glycosid và bột tiêu sao cho mức hạ đường huyết là tối ưu. Do vậy cần có thêm nghiên cứu để tìm ra tỷ lệ này, đồng thời tìm thêm các phụ gia phối hợp khác để phát huy tốt nhất khả năng hạ đường huyết .
3.4. Hoạt độ enzym GổPase ở mô hình tăng đường huyết bằng adrenalin (Ig/kg):
Adrenalin là một hormon có tác dụng kích thích thần kinh giao cảm. Đây là một chất thông dụng để gây mô hình tăng đường huyết thực nghiệm. Hormon này làm tăng nồng độ glucose máu thông qua nhiều tác động lên các quá trình chuyển hoá trong cơ thể, chủ yếu là làm tăng nồng độ AMPv qua đó kích thích quá trình thoái hoá glycogen giải phóng glucose. Thêm vào đó, adrenalin ức chế tổng hợp glycogen và kích thích quá trình tân tạo đường qua một số enzym tham gia vào quá trình này. Tuy nhiên, hoạt độ enzym GóPase (một enzym chủ chốt
trong quá trình tân tạo đường) ở lô tiêm adrenalin lại thấp hơn lô bình thường 9,5% (p<0,05). Có thể giải thích cho kết quả này nhờ chính đặc điểm động học trong cơ thể của GổPase. Adrenalin làm tăng mạnh quá trình thoái hoá glycogen, quá trình này sẽ giải phóng ra một lượng GÓP rất lớn ở gan. Như đã đề cập ở phần tổng quan, hoạt động sinh lý của GóPase được điều hoà bởi chính nồng độ cơ chất G6P của nó. Bình thường khả năng hoạt động của GóPase cao hơn lượng cơ chất sẵn có trong cơ thể 4-5 lần, nếu nồng độ GÓP tăng cao sẽ làm cho enzym này hoạt động mạnh nhưng nếu lượng cơ chất quá cao sẽ gây tác dụng ngược lại. Cơ chất thừa sẽ gắn vào các trung tâm dị lập thể của enzym tạo nên tác dụng ức chế hoạt tính enzym này. Đây cũng có thể chính là một trong những cơ chế điều hoà ngược (feedback) của cơ thể đối với việc tăng đường huyết qúa mức do adrenalin gây ra.
Về ảnh hưcmg của glycoside lên hoạt độ enzyme GóPase, ở lô thử (lô sử dụng glycosid) hoạt độ enzym giảm 34,65% (p<0,05) so với lô chứng tương với mức tăng đường huyết thấp hơn lô thử là: 66,8%. Như vậy, một trong những cơ chế hạ đường huyết của glycosid quả Mướp đắng là: ức chế hoạt tính của enzym G6Pase.
3.5. Hoạt độ enzym GóPase ở lĩiô hình tăng đưòmg huyết do STZ:
Khác với adrenalin, STZ gây tăng đường huyết do tác dụng phá huỷ tế bào bêta của đảo tuỵ, gây thiếu insulin - một trong những nguyên nhân chính của bệnh đái tháo đường typ 1. Và do vậy, hoạt độ enzym GóPase ở lô chứng cao hơn rất nhiều so với lô bình thưòíng 63,7%. Lý do của sự thay đổi này là: ở gan, một trong những cơ chế điều hoà đường huyết của Insulin là ức chế tân tạo đường thông qua một số enzym chủ chốt tham gia vào quá trình này, trong đó có
GóPase. Khi thiếu insulin tức là thiếu yếu tố ức chế nên hoạt độ GóPase tăng cao hơn mức bình thường.
ở mô hình này, glycosid quả Mưófp đắng cũng có tác dụng ức chế hoạt tính enzym GóPase; lô thử giảm 35,7% (p<0,05) so với lô chứng. Như vậy một lần nữa cho thấy tác dụng hạ đường huyết thông qua ức chế hoạt độ enzym GóPase của Mướp đắng,
Tóm iai; Với các kết quả thu được ở trên có thể thấy: glycosid toàn phần từ quả
Mướp đắng gây ức chế hoạt tính enzym GóPase trên cả hai mô hình tăng đường huyết. Tác động ức chế hoạt tính enzym này có thể do tác động trực tiếp lên