Theo kết quả thu được từ thực nghiệm, ở điều kiện xúc tác: T® = 37 °c,
pH=6,8 với phương pháp định lượng đã nêu ở trên giá trị hoạt độ enzym của chuột bình thường với mức đường huyết tương ứng như sau:
Bảng 13: Hoạt độ enzym của chuột bình thường với mức đường huyết tương ứng
Chuột Đường huyết
(mmol/1)
Hoạt độ enzym mol/phút/g)
Chuột nhắt trắng giống cái 6,3±0,6 47,1±2,4
Chuột nhắt trắng giống đực 6,2 ±0,4 47,0±2,2
Chuột cống trắng giống cái 5,4±0,6 45,3±2,2
Chuột cống trắng giống đực 5.5± 0,5 45,8±1,8
Không chỉ phụ thuộc vào phương pháp xác định, các chỉ số sinh lý còn thay đổi theo mỗi cá thể, giống, loài. Tuy nhiên, sự thay đổi này đáng kể hay
không còn phụ thuộc vào từng chỉ số cụ thể. Đối với hoạt độ GổPase, so sánh kết quả thu được giữa chuột đực và chuột cái không có sự khác nhau nhiều. Do vậy, khi lựa chọn chuột để thực hiện các thí nghiệm liên quan đến hoạt độ enzym GóPase không nhất thiết phải lựa chọn về giống. Mặt khác, cho đến nay ở Việt Nam chưa có một nghiên cứu nào công bố về hoạt độ enzym GóPase trên chuột bình thường, do đó những kết quả thu được trong nghiên cứu của chúng tôi là những kết quả quan trọng bước đầu để cung cấp cho các nghiên sau này.
3.3. Vê khả năng hạ glucose máu của glycosid quả Mướp đáng:
Từ các kết quả trên, một lần nữa có thể khẳng định khả năng hạ đường huyết của glycosid Mướp đắng. Theo nghiên cứu của Phạm Văn Thanh (Viện Dược Liệu) thì khả năng hạ glucose máu của glycosid Mướp đắng tăng đáng kể khi phối hợp với bột tiêu [4]. Tuy nhiên chưa xác định được một tỷ lệ thích hợp giữa glycosid và bột tiêu sao cho mức hạ đường huyết là tối ưu. Do vậy cần có thêm nghiên cứu để tìm ra tỷ lệ này, đồng thời tìm thêm các phụ gia phối hợp khác để phát huy tốt nhất khả năng hạ đường huyết .
3.4. Hoạt độ enzym GổPase ở mô hình tăng đường huyết bằng adrenalin (Ig/kg):
Adrenalin là một hormon có tác dụng kích thích thần kinh giao cảm. Đây là một chất thông dụng để gây mô hình tăng đường huyết thực nghiệm. Hormon này làm tăng nồng độ glucose máu thông qua nhiều tác động lên các quá trình chuyển hoá trong cơ thể, chủ yếu là làm tăng nồng độ AMPv qua đó kích thích quá trình thoái hoá glycogen giải phóng glucose. Thêm vào đó, adrenalin ức chế tổng hợp glycogen và kích thích quá trình tân tạo đường qua một số enzym tham gia vào quá trình này. Tuy nhiên, hoạt độ enzym GóPase (một enzym chủ chốt
trong quá trình tân tạo đường) ở lô tiêm adrenalin lại thấp hơn lô bình thường 9,5% (p<0,05). Có thể giải thích cho kết quả này nhờ chính đặc điểm động học trong cơ thể của GổPase. Adrenalin làm tăng mạnh quá trình thoái hoá glycogen, quá trình này sẽ giải phóng ra một lượng GÓP rất lớn ở gan. Như đã đề cập ở phần tổng quan, hoạt động sinh lý của GóPase được điều hoà bởi chính nồng độ cơ chất G6P của nó. Bình thường khả năng hoạt động của GóPase cao hơn lượng cơ chất sẵn có trong cơ thể 4-5 lần, nếu nồng độ GÓP tăng cao sẽ làm cho enzym này hoạt động mạnh nhưng nếu lượng cơ chất quá cao sẽ gây tác dụng ngược lại. Cơ chất thừa sẽ gắn vào các trung tâm dị lập thể của enzym tạo nên tác dụng ức chế hoạt tính enzym này. Đây cũng có thể chính là một trong những cơ chế điều hoà ngược (feedback) của cơ thể đối với việc tăng đường huyết qúa mức do adrenalin gây ra.
Về ảnh hưcmg của glycoside lên hoạt độ enzyme GóPase, ở lô thử (lô sử dụng glycosid) hoạt độ enzym giảm 34,65% (p<0,05) so với lô chứng tương với mức tăng đường huyết thấp hơn lô thử là: 66,8%. Như vậy, một trong những cơ chế hạ đường huyết của glycosid quả Mướp đắng là: ức chế hoạt tính của enzym G6Pase.
3.5. Hoạt độ enzym GóPase ở lĩiô hình tăng đưòmg huyết do STZ:
Khác với adrenalin, STZ gây tăng đường huyết do tác dụng phá huỷ tế bào bêta của đảo tuỵ, gây thiếu insulin - một trong những nguyên nhân chính của bệnh đái tháo đường typ 1. Và do vậy, hoạt độ enzym GóPase ở lô chứng cao hơn rất nhiều so với lô bình thưòíng 63,7%. Lý do của sự thay đổi này là: ở gan, một trong những cơ chế điều hoà đường huyết của Insulin là ức chế tân tạo đường thông qua một số enzym chủ chốt tham gia vào quá trình này, trong đó có
GóPase. Khi thiếu insulin tức là thiếu yếu tố ức chế nên hoạt độ GóPase tăng cao hơn mức bình thường.
ở mô hình này, glycosid quả Mưófp đắng cũng có tác dụng ức chế hoạt tính enzym GóPase; lô thử giảm 35,7% (p<0,05) so với lô chứng. Như vậy một lần nữa cho thấy tác dụng hạ đường huyết thông qua ức chế hoạt độ enzym GóPase của Mướp đắng,
Tóm iai; Với các kết quả thu được ở trên có thể thấy: glycosid toàn phần từ quả
Mướp đắng gây ức chế hoạt tính enzym GóPase trên cả hai mô hình tăng đường huyết. Tác động ức chế hoạt tính enzym này có thể do tác động trực tiếp lên enzyme hoặc do làm tăng nồng độ insulin trong máu thông qua đó ức chế hoạt tính GóPase. Nhưng theo nghiên cứu của Leatherdale B.A và cộng sự thì cao nước cô đặc của quả một loài Mướp đắng mọc hoang khi được tiêm vào phúc mạc chuột tăng đường huyết do alloxan gây hạ đường huyết 50% sau 5 giờ yà không làm tăng nồng độ insulin huyết thanh. Một nghiên cứu khác của ông và các cộng sự trên 9 bệnh nhân đái tháo đường typ 2 cũng cho thấy cao nước của quả Mướp đắng làm giảm có ý nghĩa đưcmg huyết trong nghiệm pháp gây tăng đường huyết mà không làm thay đổi nồng độ insulin huyết thanh [26], [27]. Do vậy, tác động ức chế GóPase của glycosid Mướp đắng có thể là tác động trực tiếp lên enzym.
So sánh mức độ ức chế hoạt độ enzym GóPase và mức độ hạ đường huyết giữa các mô hình tăng đưòỉng huyết cho thấy: Mức độ giảm của hoạt độ enzym gần tương đương nhau giữa hai mô hình, trong khi mức độ hạ đường huyết ở mô hình dùng STZ là cao hơn (83,6%). Thêm vào đó, từ nghiên cứu của một số tác giả khác (Mei p, Yaniv z (1985), Pushpa Khanna(1981)) về khả năng làm tăng chuyển hoá glucose và giả thuyết về một insulin thực vật của Mướp đắng có thể thấy rằng [5]: tác dụng hạ đường huyết của Mướp đắng không chỉ thông qua ức
chế hoạt tính enzym GổPase mà còn thông qua một số cơ chế khác cần được có thêm nghiên cứu. Điều này cũng phù hợp với xu hướng tác dụng của nhiều dược liệu khác đã được nghiên cứu trên thế giới (Panax ginseng, Tinospora cordiỷolia...). Riêng đối với Mướp đắng, giả thuyết về xu hưóỉng tác dụng hạ đường huyết giống với insulin đã được nhiều tác giả để cập tới. Như đã biết, Glucose trong máu có từ 3 nguồn sau: Glucose từ thức ăn qua đường tiêu hóa được hấp thu vào máu; glucose được sinh tổng hợp từ quá trình tân tạo đường; glycogen thoái hóa ở gan và cơ. Tuỳ thuộc vào nồng độ đường huyết mà glucose được gia nhập vào tế bào cơ và mỡ thông qua GLUT 4 rồi thoái hoá hoặc tổng hợp thành glycogen, Insulin gây hạ đường huyết thông qua nhiều tác động khác nhau. Cụ thể là tăng gia nhập glucose vào mô mỡ và cơ, tăng tổng hợp glycogen ở gan và cơ,...tăng đường phân, ức chế sự tân tạo đường thông qua ức chế tổng hợp cũng như hoạt động của một số enzym xúc tác như: Pyruvat carboxylase, Glucose-6-phosphatase.. .Như vậy, qua nghiên cứu này, chúng ta đã tìm thấy một điểm chung trong cơ chế hạ đường huyết của glycosid Mướp đắng và insulin là làm giảm quá trình tân tạo đường thông qua ức chế hoạt tính enzym G6Pase.
Mặt khác, cũng do insulin điều hoà đường huyết thông qua ức chế hoạt tính enzym GóPase nên trong bệnh đái tháo đường insulin bị thiếu hụt tương đối hoặc tuyệt đối, dẫn đến hoạt độ GóPase tăng cao. Và đây cũng chính là một yếu tố quan trọng làm tăng mức đường huyết ở bệnh nhân đái tháo đường. Do vậy việc tìm ra một thuốc có tác dụng ức chế hoạt độ enzym G6Pase cũng như các enzym khác trong qúa trình tân tạo đường là rất có ý nghĩa trong điều trị đái tháo đường, Đây cũng chính là một hướng mới mà các hãng dược trên phẩm thế giới đang áp dụng để nghiên cứu tìm ra sản phẩm mới trong điều trị đái tháo đường.
PHẨN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 4.1. KẾT LUẢN:
1. Đã khảo sát phưofng pháp xác định hoạt độ enzym GóPase thông qua định lượng lượng phospho vô cơ giải phóng từ cơ chất theo phương pháp Fiske và Subbarow. Tại điều kiện xúc tác: pH = 6,8; T° = 37°c.
- Trong khoảng thời gian 10-20 phút lượng cơ chất được thủy phân tỷ lệ thuận với thời gian.
- Với những lượng enzym 0,2 - 0,5 ml dịch enzym (Ig gan/ 40ml đệm) tham gia xúc tác phản ứng cho cùng một lượng cơ chất 0,2 ml (0,05M), lượng cơ chất được thủy phân cũng tỷ lệ thuận với lượng enzym.
- Phương pháp xác định hoạt độ enzym này có tính ổn định và lặp lại với mức RSD<1 %.
2. Với phương pháp định lượng đã áp dụng, giá trị hoạt độ enzym GóPase trên gan chuột bình thường đã xác định được tương ứng với các mức đường huyết như sau:
Giống đực: 47,0±2,2 (/iiĩiol/phút/g) Chuột nhắt trắng:.
Giống cái: 47,1±2,4 ( ; / mol/phút/g)
< Giống cái: 45,3±2,2 Giống đực: 45,8±1,8 ( / / mol/phút/g)( ụ mol/phút/g)
3. Glycosid quả mướp đắng có tác dụng ức chế đáng kể lên hoạt tính enzym G6Pase của gan chuột tăng đường huyết ở cả hai mô hình dùng adrenalin và STZ.
4.2. ĐỂ XUẤT;
1. Tiếp tục nghiên cứu để tìm hiểu rõ hofn cơ chế hạ đường huyết của glycosid quả Mướp đắng.
2. Xây dựng dạng bào chế thích hợp để đưa glycosid Mướp đắng thành một sản phẩm được sử dụng rộng rãi hiệu quả trong điều trị đái tháo đường. 3. Có thêm các nghiên cứu để tìm thêm các thuốc điều trị đái tháo đường theo
hướng tác động lên những enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa glucid.
TẢI LIẺU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT:
1. Bùi Chí Hiếu, Nguyễn Kim Phi Loan (1985), ‘Tác dụng hạ đường huyết của viên khổ qua trên bệnh đái tháo đường”, Công trình nghiên cứu y dược, nhà xuất bản y học, trl4.
2. Lê Đức Trình, Lưofng Tấn Thành, Phạm Khuê, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Xuân Thiều, Hoàng Văn Sơn (2001), Chẩn đoán sinh học trong một số bệnh nội khoa, nhà xuất bản Y học, tr 114-141.
3. Nguyễn Ngọc Xuân (2004), "’Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb. Smilcaceae) trên súc vật thực nghỉệm’\ Luận án tiến sĩ y học, Trường ĐH Y Hà nội, tr 6-9.
4. Nguyễn Văn Mùi (2002), Xác định hoạt độ enzyme, in lần 1. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, trl67-168.
5. Phạm Văn Thanh (2001). ‘Tác dụng hạ đường huyết của quả cây mướp đắng (Momordica charantiaỴ\ Luận án tiến sỹ dược học tr:
124-133.
6. Phạm Văn Thanh, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Thượng Dong, Vũ Kim Thu, Nguyễn Kim Phượng, Lê Minh Phương (2001),
"'Nghiên cứu thành phần hoá học của cây Mướp đắng và chứng minh tác dụng hạ đường máu của nhóm glycoside trên thỏ gây đái tháo đường'\ tạp chí dược liệu tập 6, số 2,3, tr 48-54.
7. Phùng Thanh Hương, Nguyễn Xuân Thắng (2002), ‘Tữc dụng hạn chế tăng glucose huyết của thân cây mướp đắng (Momordica charantia L. Cucurbitaceae) trên một số mô hình tăng glucose huyết thực nghiệm'\ Tạp chí Dược học, Bộ Y tế, 309(1), tr 22-25.
8. Võ Văn Chi (1977), Từ điển cây thuốc Việt Nam, nhà xuất bản Y học, tr 480.
9. Vũ Đình Vinh, Đặng Hanh Phức, Đỗ Đình Hồ (1974). Kỹ thuật y sinh hoá. Trưòtig đại học Quân y, tr 532-535.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH:
10.Alvin c. p (2001), “Diabetes Mellitus”, Harrison’s Principles of Internal medicine Vol 2, McGraw-Hill Medical publishing division
edition, p 2109-2138.
11.Angelo.B, Rosella.F, Bernard B, Pamela.H, Andrey, (2002) “Histone 2A stimulates glucose-6-phosphatase activity by permeabilization of liver microsomes”, Biochem. J. 367, p 505-510.
12.Doriane.A, Tara.L, Christopher.B, Newgard, Alex.J, (1997), “Stimulation of Glucose-6-phosphatase Gene Expression by Glucose”,
Biological chemistry, p 12854-12861.
IS.Emile.V.S, Gerin.E, (2002), “The glucose-6-phosphatase system”,
Biochem. J. 362, p 513-532.
14.Goorald.W, Lange.A, Christopher.N, Yazhou.L, Alfred.B, (2000) “New lessons in the regulation of glucose metabolism taught by the glucose 6-phosphatase system ”, J. Biochem, p 1533-1549.
15.Jasekaran.R.S., Sivagnanam.K., Ravi.K, Subramanian.S, (2004) “Hypoglycemic effect of Aloe vera Gel on Streptozotocin- induced diabetes in experimental rats” Journal of medical food, p 61-66.
16.Kana B(I985), “Insulin from Momordica charantia”, Japan, Kolai, p 77-84.
IT.Leatherdale B.A, Panesar R.K, Singh G, (1981) “Improvement in glucose tolerance due to Momordica charantia”, Bristish medical journal, p 1823-1823.
18. Mithieux.G, Bordeto.JC, Minassian.C , Ajzannay.A , Mercier.I, Riou.JP, (1993), “Characteristics and specificity of the inhibition of liver glucose-6- phosphatase by arachidonic acid. Lesser inhibitability of the enzyme of diabetic rats”, European Journal of Biochemistry,
Vol 213, 461-466,
19.Peter Natesan Pushparaj, Benny Kwong Huat Tan, Chee Hong Tan, (2001) “The mechanism of hypoglycemic action of the semi-purified fractions of Averrhoa bilimbi in streptozotocin - diabetic rats ”, Life sciences, p 535-547.
20.Rahnam.AU., Zaman K.,(1989), “Medicinal plants with hypoglycemic activity”. Journal of Ethnopharmacology, V.26(l), pl-55.
21.Ramalingam Saravanan, Leelavinothan Pari (2005), "Antihyperlipidemic and peroxidative effect of Diasulin, a polyherbal formulation in alloxan induced hyperglycemic rats”, BMC Complementary and Alternative Medicine , p 5-14.
22.Reinhard.L, DoreenW, (1984) “A problem in the radiochemical assay of glucose-6-phosphatase in muscle”, Biochem. /.2 1 8 , p649-651.
23.Ruxue.Z, Jinhuang.Z, Zhengping.J, Zhang.Y, Guoming.G (2004), “Hypoglycemic effect of Rehmannia glutinöse oligosaccharide in hyperglycemic and alloxan-induced diabetic rats and its mechanism”,
Journal of ethnopharmacology 90, p 39-43.
24.Salgado.M C , Metunr.I, Egea .M, Baanante.I.V, (2004),
promoter by insulin and glucose in the carnivorous fish”, Journal of Molecular Endocrinology, p 783-795.
25.Sarah Wild et al (2004), “Global prevalence of diabetes”, Diabete care Vol 27, No5, p 1047 - 1053.
26. Sekar S. D., Sivagnanam K., Subramanian S. (2005), “Antidiabetic activity of Momordica charantia seeds on streptozocin induced diabetic rats”, Pharmazie 60, p 383-387.
27.Shibib B.A, Khan L.A., Rahmanr.R, (1993), “Hypolyceamic activity of Coccinia indica and Momordica charatia indiabetic rats : depression of the hepatic gluconeogenic enzymes glucose-6-phosphatase and fructose-1,6-diphosphatase and elevation of both liver and red-cell shunt enzyme glucose-6-phosphat dehydrogenase”. Biochemical Journal, May 15, p 267-270.
28.Tomo.J.F, Toshihiro. M, Furuta .K, Atsushi .K (1997), “Hypoglycemic effect of the rhizomes of Smilax glabra in normal and diabetic mice”, Biol. Pharm. Bull. 20(1), p 44-46.
29. Welihinda J, Arvidson G,(1982) “the releasing activity of the tropical plant Momordica charantia”, Acta Bio. Med, p 1229-1240.
30.Welihinda J, Karunanayake.E.H, (1986), “Extra pancreatic effects of Momordica charantia in rats”, J ethnopharmacoL\7(3), p 47-55.
31. Welihinda. J, Sirinanne.S.R, Sinnadorai.G, (1984), “Oral hypoglyceamic activity of sone medicinal plant of SriLanka”
J.Ethnopharmacol Jul,l 1, p 23-31.
32.Yutaka .S, Hiroshi.H (1989), “Mechanism of hypoglycemic Activity of Panaxans A and B, Glycans of Panax ginseng Roots: Effects on the Key Enzymes of Glucose Metabolism in the liver of Mice”,