Tổng quan một số ứng dụng của quang phổ raman trong kiểm nghiệm dược phẩm

Vậy nên, những nghiên cứu trong khóa luận này được thực hiện với mong muốn đưa lại một cái nhìn tổng quan về phổ Raman và khả năng ứng dụng trong ngành Dược và đặc biệt trong kiểm nghiệm

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MAI LINH

TỔNG QUAN MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA QUANG PHỔ RAMAN TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MAI LINH

TỔNG QUAN MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA QUANG PHỔ RAMAN TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất

Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến:

ThS Đặng Thị Ngọc Lan

DS Bùi Việt Phương

là thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và chia sẻ cho tôi những kinh nghiệm vô cùng quý báu để tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn những góp ý, chỉnh sửa quý báu và kịp

thời của DS Bùi Văn Trung, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, để hoàn

chỉnh nghiên cứu này một cách tốt nhất

Tôi xin cảm ơn bộ môn Hóa phân tích và Độc chất đã tạo điều kiện cung cấp cho tôi các tài liệu cần thiết để hoàn thành khóa luận này

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo

và cán bộ nhân viên trường đại học Dược Hà Nội – những người đã dạy bảo

và trang bị cho tôi những kiến thức khoa học nền tảng suốt 5 năm học dưới mái trường này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương nhất đến gia đình, bạn

bè, tập thể lớp N1K64 đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Mai Linh

MỤC LỤC

Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các hình vẽ và đồ thị

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ RAMAN 3

1.1 Giới thiệu quang phổ Raman 3

1.1.1 Lịch sử phát triển 3

1.1.2 Một số ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong thực tiễn 4

1.2 Nguyên lý cơ bản của phổ Raman 5

1.2.1 Thuyết cổ điển của hiệu ứng Raman 8

1.2.2 Thuyết lượng tử của hiệu ứng Raman 12

1.3 Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman 13

1.3.1 Nguyên tắc hoạt động 13

1.3.2 Nguyên tắc cấu tạo cơ bản 14

1.4 Ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ Raman 24

1.4.1 Ưu điểm 24

1.4.2 Nhược điểm và các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình đo phổ 27

CHƯƠNG II ỨNG DỤNG TRONG NGÀNH DƯỢC 29

2.1 Phân tích định tính 29

2.2 Phân tích định lượng 30

2.3 Ứng dụng chung của phương pháp phân tích phổ Raman trong ngành dược……… 35

2.4 Ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong kiểm tra, giám sát

chất lượng thuốc 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46

1 Kết luận 46

2 Đề xuất 46

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

API Active Pharmaceutical Ingredients Dược chất có hoạt tính CCD Charge-coupled device Thiết bị tích điện kép

NMR Nuclear magnetic resonance Cộng hưởng từ hạt nhân

S/N Signal-to-noise Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu

UV-VIS Ultraviolet–visible Tử ngoại-khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số loại nguồn laser sử dụng trong công nghệ dược phẩm………16 Bảng 2.1 Tổng quan về một số quy trình định lượng dược phẩm bằng phổ Raman đã được công bố từ năm 2002-2006………31

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 1.1 Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu……… … 6 Hình 1.2 Tán xạ Raman Stokes và anti-Stokes.m, n, r: các mức năng lượng……… …7 Hình 1.3 Tán xạ Stokes và đối Stokes của CCl4……… 10 Hình 1.4 Sự thay đổi của các ellip phân cực trong quá trình dao động của phân tử CO2……….11 Hình 1.5 Sự thay đổi momen lưỡng cực α bởi các kiểu dao động 1, 2, 3

Hình 1.6 Cơ chế thay đổi mức năng lượng của tán xạ Stokes và tán xạ đối Stokes……… 12 Hình 1.7 Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ Raman……….14 Hình 1.8 Đầu đo kéo dài giúp đo mẫu bên trong các bao bì đựng lớn, trong môi trường độc hại……… 17 Hình 1.9 Đầu đo nhanh giúp đo trực tiếp các mẫu đơn giản……… 17 Hình 1.10 Bộ phận đựng mẫu hỗ trợ đo các mẫu dạng lỏng, mẫu viên…….18 Hình 1.11 Sơ đồ một detector CCD……… 20 Hình 1.12 Cấu hình 90o(a) và cấu hình 180o(b)……….21 Hình 1.13.Máy quang phổ Raman để bàn được sản xuất bởi hãng

Renishaw……….22 Hình 1.14 Máy quang phổ Raman cầm tay hãng NanoRam®………23

Hình 1.15 Máy quang phổ Raman cầm tay TruScan RM của hãng Thermo

Scientific……….23

Hình 1.16 Kết quả định tính của một mẫu từ máy Raman cầm tay……… 24

Hình 2.1 Công thức hóa học và phổ Raman của một số tá dược thường dùng, và một số API……… 30

Hình 2.2 Tỷ lệ cường độ tín hiệu của hợp chất……… 34

Hình 2.3 Phổ Raman shift Ibuprofen chuẩn……… 40

Hình 2.4 Phổ Raman Shift Ibuprofen mẫu thử……… 41

Hình 2.5 Sự chồng phổ mẫu chuẩn và phổ của một chế phẩm Ibuprofen trên thị trường……….………42

Hình 2.6 Phổ Raman shift Sildenafil chuẩn……… 43

Hình 2.7 Phổ Raman Shift Sildenafil mẫu thử……… 44

Hình 2.8 Sự chồng phổ mẫu chuẩn và phổ của một chế phẩm Sildenafil trên thị trường……….45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bên cạnh các phương pháp phân tích quang phổ thông thường được sử dụng như phổ UV - VIS, phổ IR, khối phổ có một phương pháp phân tích quang phổ còn khá mới mẻ trong ngành Dược, đó là quang phổ Raman Quang phổ Raman được ra đời từ những năm 30 của thế kỷ trước, nhưng do hạn chế về khoa học kỹ thuật mà nó phát triển khá chậm Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhất là kỹ thuật laser, quang phổ Raman đang ngày càng phát triển và cho thấy nhiều ưu thế Trên thế giới, phương pháp phân tích phổ Raman được áp dụng một cách hiệu quả trong nhiều lĩnh vực khác nhau như hải quan, pháp y, khảo cổ học… trong đó có trong ngành Dược Với ưu điểm nổi bật là phân tích nhanh, không làm hỏng mẫu, kỹ thuật đơn giản, dễ sử dụng đã mang lại nhiều tiềm năng lớn để khai thác kỹ thuật phổ này trong công tác phân tích, kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc và công tác phòng chống thuốc giả với độ an toàn và hiệu quả cao

Vậy nên, những nghiên cứu trong khóa luận này được thực hiện với mong muốn đưa lại một cái nhìn tổng quan về phổ Raman và khả năng ứng dụng trong ngành Dược và đặc biệt trong kiểm nghiệm Dược phẩm, nhằm tạo một nền tảng cơ bản cho việc ứng dụng của quang phổ Raman trong điều kiện thực tế tại Việt Nam

Mục tiêu của khóa luận:

1 Tìm hiểu nguyên lý tổng quan về quang phổ Raman, nguyên tắc hoạt động, nguyên tắc cấu tạo và các bộ phận chính của máy quang phổ Raman

2 Phân tích ưu nhược điểm của phương pháp quang phổ Raman so với các phương pháp phân tích quang phổ khác

3 Phân tích khả năng ứng dụng thực tế của quang phổ Raman trong ngành Dược và khả năng áp dụng phương pháp quang phổ này trong công tác kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc

Chương I TỔNG QUAN VỀ QUANG PHỔ RAMAN

1.1 Giới thiệu quang phổ Raman

Theo thời gian, đã có những bước cải tiến trong các bộ phận của thiết bị

đo đạc tán xạ Raman Những nghiên cứu đầu tiên được tập trung phát triển là nguồn ánh sáng kích thích Các loại đèn từ các nguyên tố khác nhau được nghiên cứu (như heli, chì, kẽm) nhưng không đạt yêu cầu bởi vì cường độ ánh sáng tán xạ thu được vẫn rất yếu Nhiều năm sau đó, người ta nghiên cứu áp dụng và phát triển nguồn kích thích bằng đèn thủy ngân, nhưng nó vẫn không mang lại hiệu quả như mong muốn Cho tới tận năm 1962, đã có bước ngoặt lớn trong công nghệ Raman, đó là người ta đã đưa laser vào làm nguồn kích thích cho tán xạ Raman Các loại nguồn Laser sử dụng phổ biến thời đó chủ yếu là laser thuộc vùng UV-VIS như Laser Ar+ (351,1-514,5nm); Kr (337,4-674,4nm) và cho đến gần đây các nguồn laser IR và NIR được đưa vào sử dụng làm hạn chế rất nhiều hiện tượng huỳnh quang (một hiện tượng tác động mạnh đến việc thu phổ Raman) [28]

Nhưng vẫn có nhiều hạn chế khiến cho quang phổ Raman phát triển tương đối chậm Đầu tiên là khó khăn trong việc điều khiển hệ thống quang học Thứ hai là huỳnh quang trong chất mẫu ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát

hiện Raman Thứ ba, tán xạ Raman là tán xạ yếu, tản mát, muốn ghi được chính xác phổ của nó thì cần phải chiếu xạ laser kích thích trong một thời gian dài, điều này dẫn đến sự phân hủy và biến tính của mẫu Vậy nên, mặc dù bản chất là một phương pháp phân tích không phá hủy mẫu, nhưng một vài trường hợp, phổ Raman lại được nhận định là một phương pháp phá hủy mẫu chất [28]

Những năm 1900, đã có một cuộc cách mạng mới trong quang phổ Raman Nhờ sự phát triển của một loạt các bộ phận như nguồn laser, sự tiến

bộ về công nghệ của detector, sự phát triển vượt bậc của các bộ lọc quang, sự cải tiến đáng kể về công nghệ phần mềm và ứng dụng của nó trong các phương pháp phân tích dữ liệu … mà quang phổ Raman được ứng dụng rộng rãi hơn Đặc biệt, với sự phát triển công nghệ nano, ngoài máy quang phổ Raman để bàn với hiệu lực phân tích rất cao, máy quang phổ Raman cầm tay

đã ra đời và rất thuận tiện cho việc phân tích nhanh, đánh giá sơ bộ, khảo sát tại thực địa các mẫu cần phân tích

1.1.2 Một số ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong thực tiễn

Với sự phát triển mạnh mẽ như vậy, ngày nay quang phổ Raman không chỉ còn là phương pháp phân tích cơ bản sử dụng trong phòng thí nghiệm mà còn được ứng dụng trong nhiều ngành khoa học khác nhau Trong khoa học vật liệu, quang phổ Raman giúp xác định cấu trúc vật liệu, xác định thành phần cấu tạo trong hỗn hợp rắn Trong pháp y, người ta sử dụng quang phổ Raman như một công cụ hiệu quả để tìm ra các chất độc hại, gây tử vong hoặc dùng phương pháp phổ Raman để bổ sung khẳng định kết luận pháp y Trong khảo cổ học, người ta dùng phổ Raman để tìm ra các kim loại, đá quý, xác định nguồn gốc các cổ vật Trong hải quan, phổ Raman dùng để kiểm tra nhanh phát hiện các chất cấm như ma túy, chất gây nghiện, hướng thần, chất

kích thích…Và đặc biệt trong ngành Dược có rất nhiều ứng dụng quan trọng

sẽ được đề cập đến ở phần sau

1.2 Nguyên lý cơ bản của phổ Raman [1], [11], [28]

Trong khi quang phổ hồng ngoại dựa trên sự hấp thụ, phản xạ và phát xạ ánh sáng, thì quang phổ Raman dựa trên hiện tượng tán xạ Tán xạ này xảy ra

do va chạm giữa các photon và các phân tử Ánh sáng tới với tần số 0 trên một phân tử nhất định mang một lượng các photon với năng lượng E=h 0 Ví

dụ nguồn laser có bước sóng 500 nm và công suất 1W chứa khoảng 2,5x1018 photon trong một giây Các photon này gồm cả các photon tương tác cũng như những photon truyền qua mà không tương tác với các phân tử

Hầu hết các photon trong số này va chạm đàn hồi với phân tử và không thay đổi năng lượng sau khi va chạm, các bức xạ phát ra sau đó được gọi là tán xạ Rayleigh Vì vậy, tán xạ Rayleigh gồm những photon có cùng tần số với ánh sáng tới

Một số lượng rất nhỏ của photon va chạm không đàn hồi với các phân tử

và trao đổi năng lượng sau va chạm Nếu phân tử nhận năng lượng h từ photon tới thì năng lượng của photon tán xạ sẽ giảm còn h( 0 – ), và tần số của photon tán xạ khi đó là 0 – Ngược lại, khi photon tới nhận năng lượng

h từ phân tử, các năng lượng của các photon tán xạ tăng lên thành h( 0 + )

và tần số của photon tán xạ là 0 + Tán xạ mà có sự trao đổi năng lượng của photon với một phân tử như trên được gọi là tán xạ Raman Và các tán xạ

có tần số 0 – và có tần số 0 + được gọi tương ứng là “tán xạ Stokes” và

“tán xạ đối Stokes”

Hình 1.1 Các thành phần thu được sau khi cho ánh sáng kích thích đến mẫu

Khi chiếu bức xạ điện từ h vào một phân tử, năng lượng có thể bị hấp thu hoặc phát xạ

 Tán xạ Rayleigh xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với nguyên

tử

 Tán xạ Raman xuất hiện là do tương tác của ánh sáng tới với liên kết trong phân tử

Cũng như các phép đo quang phổ khác, khi đo tán xạ Raman, ta khảo sát

sự thay đổi các mức năng lượng trong phân tử Quá trình trao đổi năng lượng

có thể xảy ra giữa các mức năng lượng của điện tử, các mức năng lượng của dao động hoặc quay, nhưng khi khảo sát quang phổ Raman chúng ta chỉ khảo

sát năng lượng dao động phân tử, cụ thể hơn đó là dao động dọc theo trục của các liên kết

Hình 1.2 minh họa tán xạ Stokes và đối Stokes Tán xạ Stokes xảy ra khi một photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng cơ bản, còn tán

xạ đối Stokes xảy ra khi photon tương tác với một phân tử ở trạng thái năng lượng kích thích Ở điều kiện thường, hầu hết các phân tử đều ở trạng thái năng lượng cơ bản, nên tán xạ Stokes dễ xảy ra hơn và chiếm đa số Vì vậy, trong các phép đo phổ Raman, người ta thường đo tán xạ Stokes

Hình 1.2 Tán xạ Raman Stokes và anti-Stokes.m, n, r: các mức năng

lượng

Một đại lượng quan trọng trong quang phổ Raman đặc trưng cho sự thay đổi tần số trong hiệu ứng Raman được gọi là “Raman shift” Đối với một chất, cường độ của các bức xạ tương ứng trên Raman shift là khác nhau, chúng tạo nên phổ Raman đặc trưng và duy nhất cho chất đó, đồng thời mỗi nhóm chức thì cho đỉnh phổ ở các số sóng đặc trưng khác nhau Vì vậy, phân tích phổ Raman, chúng ta có thể xác định được chính xác một chất và nghiên cứu cấu trúc của chất ấy

1.2.1 Thuyết cổ điển của hiệu ứng Raman [1], [11]

Khi một phân tử nào đó được đặt trong điện trường E của bức xạ điện từ

có tần số 0, dưới tác dụng của điện trường có sự phân bố lại electron trong phân tử và làm xuất hiện momen lưỡng cực P Khi điện trường E đủ nhỏ, độ lớn của momen lưỡng cực P và của E tỷ lệ thuận với nhau và được biểu diễn bởi công thức sau

Trong đó, α là hệ số phân cực

Trạng thái phân cực có thể tạo thành dễ dàng như là khi một đám mây electron nào đó biến dạng Trong hệ tọa độ không gian Oxyz, phương trình (1.1) được viết lại như sau

(1.2)

Để đơn giản, chúng ta giả sử P và E là các giá trị trong cùng một trục tọa

độ Thay E = E0 cos 2πv0t vào phương trình (1.1) ta được:

P = α E0 cos 2πv0t (1.3)

Hệ số phân cực α không phải là một hằng số mà nó có thể thay đổi trong suốt quá trình dao động của phân tử Chúng ta có thể chia hệ số phân cực này thành hai thành phần, thành phần α0 không đổi khi phân tử không dao động và một thành phần Q (Q = Q0 cos 2πv0t) Khi đó ta có:

α = α0 + ( )0 Q = α0 + ( )0 Q0 cos 2πvt (1.4)

Thay (1.4) vào (1.3) ta được

Phương trình trên chỉ ra momen lưỡng cực P gồm có ba tần số dao động là

0, 0 – và 0+ Số hạng đầu tiên chỉ ra tán xạ cùng tần số 0 với ánh sáng tới, đó là tán xạ Rayleigh Số hạng thứ hai biểu thị sự thay đổi tần số so với ánh sáng tới và như được biết đó là tán xạ Stokes và đối Stokes (tán xạ Raman)

Phương trình (1.5) chỉ ra điều kiện tiên quyết để có tán xạ Raman là yếu tố(∂α/∂Q)0Q0E0 không thể là 0 Tức là Q0 hay E0 đều không thể là 0, điều kiện quan trọng là (∂α/∂Q)0 ≠ 0 Theo phương trình trên, hoạt động Raman chỉ là những dao động mà có sự thay đổi độ phân cực kết hợp với dao động trong phân tử

Hai số hạng trong phương trình (1.5) cho ta thấy sự liên quan giữa các tán

xạ Raman (tán xạ Stokes và đối Stokes) và tỷ lệ giữa tán xạ Raman với tán xạ Rayleigh Bởi vì cường độ của tán xạ đối Stokes phụ thuộc vào số lượng của những phân tử ở trạng thái kích thích ban đầu, mặt khác các phân tử này ở trạng thái kích thích thường có nhiệt độ cao mà phân bố Boltzmann lại giảm khi nhiệt độ của chất tăng Chính vì vậy, tán xạ đối Stokes là ít hơn, khó thu thập hơn và có cường độ nhỏ hơn tán xạ Stokes Phương trình (1.5) không chỉ

ra tỷ lệ giữa ba loại tán xạ này, nhưng thực nghiệm cho thấy cả hai loại tán xạ Raman này đều yếu hơn tán xạ Rayleigh (thường là nhỏ hơn 0,1%)

Hình 1.3 Tán xạ Stokes và đối Stokes của CCl 4

Để minh họa cho các hoạt động Raman, chúng ta cùng tìm hiểu về các trạng thái dao động của phân tử CO2 Hình 1.4 miêu tả ba trạng thái dao động của phân tử CO2 và hình 1.5 chỉ ra sự thay đổi độ phân cực α theo các trạng thái dao động 1, 2, 3 Trong quá trình dao động IR, độ phân cực của phân

tử là không đổi, còn theo phương trình (1.5) để có hoạt động Raman thì tỷ số (∂α/∂Q)0 ≠ 0 (độ phân cực thay đổi) nên trạng thái dao động 1 là dao động Raman, còn trạng thái dao động 2 và 3 là dao động IR [28]

Hình 1.4.Sự thay đổi của các ellip phân cực trong quá trình dao động của

phân tử CO 2

Hình 1.5 Sự thay đổi momen lưỡng cực α bởi các kiểu dao động 1 , 2 , 3

trong phân tử CO 2

Ví dụ trên minh họa mối quan hệ loại trừ lẫn nhau giữa các dao động IR

và Raman trong các phân tử, tuy nhiên, vẫn có sự chồng chéo giữa phổ IR và phổ Raman Vì vậy việc lựa chọn dải phổ đặc trưng cho các loại dao động này

là rất quan trọng

Tóm lại dao động đối xứng kéo dài hoặc thu hẹp của các đám mây điện tử

là dao động Raman mà không phải IR Còn các dao động uốn, rung động

không đối xứng (kể cả thay đổi momen lưỡng cực mà không kèm theo sự thay đổi lớn trong các điện tử) thì hoạt động IR rất mạnh nhưng Raman lại yếu Cả hai loại phổ này được đặc trưng bởi các đỉnh sắc nét, rõ ràng trên phổ đồ

1.2.2 Thuyết lượng tử của hiệu ứng Raman [28]

Mặc dù thuyết cổ điển giúp chúng ta dễ hình dung về hiệu ứng Raman nhưng có vài yếu tố mà một mình thuyết cổ điển không thể giải thích được; chỉ thông qua thuyết lượng tử chúng ta mới có thể giải thích hoàn toàn hiện tượng này Ví dụ, thuyết cổ điển không giải thích được sự khác nhau giữa năng lượng photon trong tán xạ Stokes và photon trong tán xạ đối Stokes Để làm rõ hiệu ứng Raman bằng thuyết lượng tử, chúng ta hãy theo dõi sự thay đổi các mức năng lượng của phân tử như trên hình 1.6

Hình 1.6 Cơ chế thay đổi mức năng lượng của tán xạ Stokes

và tán xạ đối Stokes

Khi ánh sáng tới tương tác với phân tử, từ các mức năng lượng ban đầu (m hoặc n), phân tử bị kích thích lên mức năng lượng cao hơn là r (trạng thái kích thích này chỉ là trạng thái kích thích các dao động trong phân tử hoặc thay đổi hình dạng các đám mây electron mà không làm thay đổi vị trí của chúng như phổ UV-VIS) Tiếp theo, phân tử sẽ bức xạ ra các photon để chuyển năng lượng về trạng thái n hoặc m tương ứng (nếu ban đầu nó ở trạng thái m thì sẽ chuyển sang trạng thái n và ngược lại)

Theo công thức lượng tử hóa học thì tổng cường độ ánh sáng Imn của tán

xạ Raman tương ứng với sự chuyển mức năng lượng từ trạng thái m sang trạng thái n mà người ta biểu diễn ở phương trình sau:

Imn = ( i ± mn)4I i α pσ 2

(1.6) Trong công thức trên Ii là cường độ của ánh sáng tới (có tần số dao động

i); αpσ là hệ số phân cực của thành phần σ Công thức trên diễn tả diễn tả cường độ tán xạ Raman tỷ lệ thuận với cường độ ánh sáng tới Ii, tỷ lệ lũy thừa bậc bốn của hiệu tần số i ± mn và bình phương của hệ số phân cực αpσ

Hệ số (αpσ)mn được tính theo công thức

(1.7)

Trong công thức trên, r bao gồm tất cả các giá trị lượng tử riêng của phân tử; vrm là tần số chuyển tiếp từ m đến n; <m|µα |r>, <r|µ p |n>,… là các thành

phần của momen lưỡng cực điện; µ p là một momen lưỡng cực điển p, Γ là

năng lượng giảm từ trạng thái r Phương trình này là một công thức quan trọng để giải thích tán xạ Raman và nó được biết như là “phương trình của tán sắc Kramers-Heisenberg-Dirac”

1.3 Nguyên tắc cấu tạo của thiết bị quang phổ Raman

Detector ghi lại các tín hiệu Raman, sau đó thông qua bộ phận xử số liệu, các tín hiệu quang được biến đổi thành tín hiệu điện tử và cho ta phổ Raman của mẫu phân tích

1.3.2 Nguyên tắc cấu tạo cơ bản

Máy quang phổ Raman được phát triển bởi nhiều công ty, nhiều hãng sản xuất khác nhau Nhưng về cơ bản nó bao gồm năm bộ phận sau: Nguồn laser,

bộ phận đựng mẫu, quang phổ kế, detector, hệ quang Hình 1.9 mô tả các bộ phận cơ bản của máy quang phổ Raman

Hình 1.7: Sơ đồ cấu tạo máy quang phổ Raman 1.3.2.1 Nguồn laser [11], [28]

Khi sử dụng nguồn laser kích thích, vấn đề quan trọng nhất được đặt ra đó

là nó có gây ra hiện tượng huỳnh quang đối với mẫu phân tích hay không Trong trường hợp khả năng xảy ra huỳnh quang cao thì laser NIR sẽ là sự lựa chọn thích hợp Có nhiều loại laser với bước sóng đủ cao để giảm bớt hiện tượng huỳnh quang nhưng nguồn laser hay được dùng nhất là nguồn laser xung quang vùng 780 nm Đây là loại laser được tạo ra dựa trên sự phát

quang từ các nút bán dẫn Loại nguồn laser này thường được thiết kế nhỏ gọn, giá thành rẻ và có khả năng kích thích được cho nhiều loại mẫu khác nhau Vì vậy mà loại laser này ngày càng được phổ biến trong các máy quang phổ Raman, nhất là trong các máy quang phổ Raman cầm tay Một loại laser khác được sử dụng đó là laser Nd: YAG (Neodymium-YAG), nguồn laser này cho bước sóng 1064 nm và thường được sử dụng trong các máy FT-Raman [11], [28]

Đối với những mẫu phát huỳnh quang yếu thì người ta sử dụng các nguồn laser với bước sóng khoảng 470-650 nm Các nguồn laser này thường dựa trên ion Ar+ Có một số loại khác được dùng đó là laser He-Ne hoặc Kr+ Tất

cả các loại này đều có thể cung cấp một nguồn laser với công suất lớn, dễ xảy

ra hiện tượng phá hủy mẫu khi đo [11]

Các tính năng chính của hai nhóm laser trên đó là: Nguồn laser với bước sóng kích thích trong vùng nhìn thấy thường cho tín hiệu tốt hơn (hệ số signal-to-noise: S/N cao hơn), do đó tín hiệu dễ phát hiện hơn bởi vì dòng photon Raman mạnh, nhờ thế mà detector đi cùng với nó thường đơn giản và

có giá thành rẻ Tuy nhiên, sử dụng nguồn laser này có một số nhược điểm là

có thể xảy ra hiện tượng huỳnh quang làm che phủ tín hiệu Raman và vì năng lượng lớn nên mẫu phân tích dễ bị phá hủy Đối với nguồn laser kích thích trong vùng NIR thì cho tín hiệu Raman thấp hơn trên Detector vì vậy mà detector cần phải tinh vi và được tối ưu hóa Các thiết bị sử dụng với nguồn laser này ít nhạy hơn các thiết bị sử dụng với laser trong vùng nhìn thấy Nhưng bù lại, tín hiệu đường nền có xu hướng thấp hơn, vì vậy việc ghi tín hiệu Raman dễ dàng hơn [28]

Với những phân tích trên, laser NIR thường được dùng cho các mẫu sinh học Bởi vì các thành phần của mẫu thường phát huỳnh quang và nó làm giảm nguy cơ phá hủy mẫu Ngược lại, do có độ nhạy cao hơn với trang thiết bị đơn

giản hơn, laser với nguồn kích thích trong vùng nhìn thấy được sử dụng để phân tích các nguyên vật liệu không có bản chất sinh học, nhất là công nghệ dược phẩm và trong các điều kiện sản xuất đặc biệt, thực phẩm chức năng Ngoài hiệu quả sử dụng, các vấn đề an toàn cho người sử dụng đang được quan tâm và nó định hướng cho sự phát triển của các loại nguồn laser hiện đại

Bảng 1.1 Một số loại nguồn laser sử dụng trong công nghệ dược phẩm [29]

632.8 He-Ne Tới 500 mW 637-781 Nguy cơ huỳnh quang thấp

(Nd:YAG)

Tới 1 W 535-632.8 Nguy cơ huỳnh quang cao

488-632.8 Ar+ Tới 1 W 490-572 Nguy cơ huỳnh quang cao

1.3.2.2 Thiết bị đựng mẫu [29]

Phương pháp phân tích quang phổ Raman được xem như là một phương pháp phân tích nhanh, không cần chuẩn bị mẫu Nên có thể thu phổ Raman trực tiếp trên bề mặt mẫu qua đầu đo nhanh, đo mẫu bên trong các bao bì lớn thông qua các đầu dò quang học; đo mẫu lỏng bằng curvet; đo mẫu rắn, mẫu viên bằng thiết bị giữ mẫu… Việc lựa chọn các thiết bị lấy mẫu thường được quyết định bởi bản chất của mẫu phân tích Tuy nhiên, khi lấy mẫu cần phải cân nhắc khối lượng mẫu, tốc độ đo, độ an toàn của nguồn laser, độ tái lặp của phép đo để tối ưu hóa các thiết bị lấy mẫu nhằm thu được tín hiệu Raman tốt nhất.[29]

Có một số thiết bị hỗ trợ đo mẫu đi kèm với máy quang phổ Raman như sau:

Hình 1.8 Đầu đo kéo dài giúp đo mẫu bên trong các bao bì đựng lớn,

trong môi trường độc hại

Hình 1.9 Đầu đo nhanh giúp đo trực tiếp các mẫu đơn giản

Hình 1.10 Bộ phận đựng mẫu hỗ trợ đo các mẫu dạng lỏng, mẫu viên 1.3.2.3 Quang phổ kế [11], [28]

Cũng như các loại quang phổ kế khác, quang phổ kế trong máy Raman có chức năng chính là phân tách ánh sáng dựa theo bước sóng (hoặc số sóng) được thể hiện trên phổ đồ Raman Có hai loại quang phổ kế đó là: quang phổ

kế phân tán và quang phổ kế không phân tán

Quang phổ kế phân tán dựa trên sự nhiễu xạ của các bức xạ tán xạ thông qua hệ cách tử Các quang phổ kế này được sử dụng cùng với các nguồn laser kích thích từ vùng VIS đến 785 nm Đặc điểm chính của loại quang phổ kế này là rất nhạy (tỷ lệ S/N cao), vì thế thiết bị không cần sử dụng nguồn laser

có năng lượng cao và các bộ phận của nó không cần phải di chuyển trong quá trình đo Tuy nhiên, thiết bị này có hạn chế là độ phân giải ở các vùng khác nhau trên phổ đồ không đồng đều Các loại quang phổ kế này khá phổ biến và được sử dụng rộng rãi, chúng được sản xuất theo một vài cách đơn giản và mang lại hiệu quả cao Vấn đề lớn của các quang phổ kế này làm ảnh hưởng đến hiệu quả của máy quang phổ đó là ánh sáng lạc Phần lớn bắt nguồn từ ánh sáng laser của nguồn kích thích truyền đến hệ thống quang học Khi cường độ nguồn mạnh hơn nhiều so với tán xạ Raman thì chúng ta không thể phát hiện được tín hiệu Raman Để loại bỏ tín hiệu này, người ta phải sử dụng

nhiều hệ thống lọc khác nhau để không cho ánh sáng kích thích truyền đến detector [11]

Hiệu năng của quang phổ kế phân tán được quyết định bởi độ phân giải của máy và các đại lượng: độ rộng dải phổ, tần số f, khả năng truyền tải và hiệu quả loại bỏ ánh sáng lạc (nó đặc biệt quan trọng trong việc phân tích ở vùng có số sóng thấp < 200 cm-1) [28]

Quang phổ kế không phân tán hầu hết được kết hợp với thiết bị biến điệu

FT (Fourier transform) của tín hiệu và nó cần phân tách số sóng bằng phương pháp vật lý Các quang phổ kế này thường được sử dụng trong các thiết bị FT-Raman với bước sóng kích thích ở 1064 nm Lợi thế lớn nhất của thiết bị này

là các số sóng có độ chính xác cao trên phạm vi rộng Vì vậy, các thiết bị thường được sử dụng để định tính các chất hoặc để phát hiện các thay đổi nhỏ trên Raman shift Tuy nhiên, thiết bị này có độ nhạy tương đối thấp so với quang phổ kế phân tán [28]

1.3.2.4 Detector

Trong quá trình phát triển của công nghệ Raman, đã có một số loại detector được đưa vào sử dụng như máy đếm photon, photodiode array, nhưng detector CCD được sử dụng rộng rãi nhất trong các thiết bị Raman hiện đại Vì vậy, chúng ta sẽ tập trung tìm hiểu về detector CCD

CCD có bản chất là một chất bán dẫn silicon, được sắp xếp như một dải các yếu tố cảm quang Nó tạo ra các quang điện tử, mỗi quang điện tử như một tải nhỏ để lưu giữ tín hiệu quang truyền đến Các tải quang được lưu trữ trên các pixel ảnh riêng biệt, theo đó, các tải này từ mỗi hàng được di chuyển lên hàng cao hơn Các tải trên các pixel ở hàng trên cùng được chuyển từ trái sang phải và được đọc bởi bộ chuyển đổi từ tín hiệu quang sang tín hiệu số Quá trình chuyển đổi như vậy là quá trình thu các tín hiệu tự do và hầu hết tất

cả các tín hiệu này được tập trung lại tạo nên tín hiệu được đọc bởi CCD ở

đầu ra Để đọc được toàn bộ các tín hiệu trên toàn vùng, hàng trên cùng được đọc trước bằng cách di chuyển từng vị trí từ trái sang phải, sau khi đọc xong hàng đó, hàng dưới lại được chuyển lên và quá trình trên được lặp lại [11]

Hình 1.11 Sơ đồ một detector CCD

Các CCD hiện nay thường được có định dạng nhiều hơn 1024 x 1024 pixel, với tổng diện tích lên tới 25 mm2 Ưu điểm chính của CCD so với các detector đa kênh khác là độ nhiễu thấp, hiệu suất lượng tử cao và độ nhạy trong phạm vi bước sóng rộng (120-1000 nm) Detector CCD thường sử dụng cùng với nguồn kích thích là laser NIR trong các thiết bị FT-Raman [5]

1.3.2.5 Hệ quang

Tùy thuộc vào cách kích thích ánh sáng và cách thu tín hiệu từ mẫu mà hệ quang có các cấu hình 1800, 900 hoặc có thể sử dụng sợi quang để kích thích

và thu tín hiệu Raman [11], [28]

Trong cấu hình 1800, các chùm tia laser và chùm ánh sáng tán xạ nằm trên cùng một trục Có nhiều cách kết hợp gương và thấu kính để tạo thành hệ

thống này Cấu hình này đang được sử dụng rộng rãi bởi vì không cần thiết phải điều chỉnh thêm chùm laser và bộ phận thu tín hiệu quang Cấu hình 900tạo ra một góc giữa chùm kích thích và chùm tán xạ thu được Cấu hình này không có nhiều ý nghĩa thực tế [28]

Hình 1.12 Cấu hình 90 o (a) và cấu hình 180 o (b)

Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ cáp quang từ những năm 1990 trở lại đây, đã mang lại nhiều lựa chọn trong việc cung cấp và thu thập ánh sáng Tín hiệu Raman hoặc tín hiệu laser trong khoảng từ 500-1000 nm rất phù hợp và hoàn toàn có thể ứng dụng các sợi quang cho phản xạ toàn phần giữa lõi và lớp vỏ của nó Điều này làm giảm thiểu sự hấp thu trong quá trình truyền ánh sáng ngay cả trong sợi quang rất dài Trên thực tế, người ta thường

sử dụng sợi quang đa chế độ, loại sợi này tuy khá cồng kềnh với đường kính

từ 50-600 µm nhưng lại rất thuận tiện để kết hợp tia laser với thiết bị thu thập tán xạ Khi sử dụng thiết bị này, chúng ta đồng thời phải thực hiện hai việc: