Cơ sở để phân tích định lượng Raman là cường độ tín hiệu Raman từ mẫu phân tích sẽ tăng tương ứng với sự tăng lên của lượng chất cần thăm dò trong mẫu, trong khi các yếu tố khác không thay đổi (cường độ tăng khi nồng độ chất phân tích tăng lên). Về nguyên tắc, điều này được xác định thông qua tín hiệu tán xạ Raman (trong thí nghiệm) cho bất kỳ thành phần nào của hợp chất và xác định nồng độ thành phần ấy trong mẫu thông qua việc đo tín hiệu Raman của đỉnh đặc trưng cho thành phần ấy [11]. Thật vậy, người ta có thể xác định được nồng độ của mẫu cần đo bằng việc so sánh phổ của chất phân
tích với đường cong tương quan đã được xác định từ trước. Đường cong này được xây dựng bởi việc đo phổ của mẫu chuẩn với các thành phần đã được biết đến. Ví dụ như để định lượng các dạng thù hình của Indomethacin, sử dụng tỷ lệ cường độ đỉnh ở 1698 cm-1(tinh thể) đến 1680 cm-1 (vô định hình) với đường cong tương quan đã được xây dựng từ trước [14].
Bảng 2.1. Tổng quan về một số quy trình định lượng dược phẩm bằng phổ Raman đã được công bố từ năm 2002-2006
Hợp chất Dạng bào chế Quang phổ kế Phân tích dữ liệu TLTK Acetylsalicylic acid, acetaminophen Viên nén FT M [26] Acyclovir Vỉ FT U [25] Ambroxol Viên nén FT M [27]
Ambroxol Viên nén Kỹ thuật
phân tán M [9] Calcitonin Dạng bột Kỹ thuật phân tán U [30] Captopril, prednisolone Viên nén FT M [14] Carbamazepine Vỉ FT M và U [23] Chlorophenicol palmitate Chất rắn (xác định dạng thù hình) FT U [8] Dipyrone Viên nén FT U [10]
Diltiazem hydrochloride Viên nén FT U [31] Indomethacin Viên nén FT M [15] Mannitol Bột FT M [4] Mannitol Bột FT U [22] Nitrofurantonin, theophylline, caffeine, carbamazenine Bột FT M [21] Paracetamol Bột FT U [3] Ranitidine Viên nén FT M [17] 5-p-Fluorobenzoyl- 2- benzimidazolecarb amic acid, methyl
ester
Bột FT M [7]
Trong đó : U và M tương ứng là các dữ liệu phân tích đơn biến và đa biến
Mặc dù về nguyên tắc thì phương pháp định lượng bằng quang phổ Raman không hề phức tạp hơn các phương pháp thông thường khác, nhưng có rất nhiều thách thức về kỹ thuật đo cần được giải quyết. Ví dụ như cường độ tín hiệu thu được có thể thay đổi khi chỉ cần một sự thay đổi nhỏ của một trong nhiều thông số của trang thiết bị đang sử dụng (công suất laser, khoảng cách từ vị trí đặt mẫu tới nguồn laser, …), vì vậy các tín hiệu tuyệt đối từ cùng một mẫu đo trên cùng một thiết bị sẽ thay đổi ít nhất một vài phần trăm
nếu có một bộ phận nào đó được lấy ra và thay thế, thậm chí nếu đo mẫu trong cùng một ngày thì tín hiệu đo của buổi sáng và buổi chiều đã có sự khác nhau mặc dù các yếu tố khác không thay đổi. Vì vậy mà khi có vấn đề về sự lặp lại của phép đo thì người ta rất hiếm khi sử dụng nó trong định lượng. [28] Nhưng vấn đề này được giải quyết dễ dàng bằng cách đo các dải tín hiệu cần thiết cùng với các dải tín hiệu khác trong mẫu, và so sánh tỷ lệ của chúng với nhau vì khi thực hiện như vậy thì các dải sẽ cùng tăng hoặc cùng giảm tín hiệu nhưng tỷ lệ của chúng thì không thay đổi và không làm ảnh hưởng đến kết quả đo. Điều này rất thuận lợi trong phân tích các thành phần trong công thức dược phẩm, thông thường một công thức thành phẩm sẽ gồm nhiều thành phần khác nhau. Ví dụ, khi phân tích quang phổ Raman của viên nén, các tín hiệu Raman của tá dược đều làm ảnh hưởng đến tín hiệu của dược chất trên phổ đồ, vì vậy mà khi định lượng dược chất trong viên, người ta thường chọn dải phổ đặc trưng cho dược chất, sau đó chọn dải phổ đặc trưng cho nền tá dược và cuối cùng so sánh tỷ lệ cường độ của các dải phổ này với nhau để đánh giá hàm lượng thuốc trong viên. Hình 2.1 cho thấy sự thay đổi về tỷ lệ cường độ giữa các dải phổ của manitol và acid salicylic khi thay đổi nồng độ của acid salicylic từ 0% đến 15%. [28]
Hình 2.2. Tỷ lệ cường độ tín hiệu của hợp chất
Trong một vài cách tiếp cận khác, người ta đưa ra phương pháp khác là phương pháp thêm chất phân tích khác (chất chuẩn nội), có cường độ tín hiệu Raman lớn hơn, sắc nét hơn và có dải tín hiệu không ảnh hưởng đến dải phổ của chất phân tích đang xét để thuận tiện cho việc khảo sát. Tuy nhiên điều này là không cần thiết, và nhiều khi nó còn làm ảnh hưởng đến hiệu quả phân tích.
Có hai phương thức tiếp cận để thu được dữ liệu phổ định lượng, đó là phương thức phân tích dữ liệu đơn biến và phân tích dữ liệu đa biến. Trong phương thức thu dữ liệu đơn biến truyền thống, người ta thường đo cả chiều cao và diện tích píc của vùng dữ liệu đặc trưng được quan tâm để so sánh với chiều cao và diện tích píc của chất chuẩn, sau đó tính toán tỉ lệ tương đối của các thành phần để dự đoán và xây dựng cấu trúc của mẫu thử.
Hiện tại, phương pháp này vẫn đang được sử dụng bởi những ưu điểm không thể phủ nhận của nó đó là phép phân tích đơn giản và cho độ chính xác khá cao. Tuy nhiên, ngày nay phương pháp phân tích dữ liệu đa biến được sử dụng rộng rãi hơn. Phương pháp phân tích dữ liệu đa biến giúp ta xác định được những biến đổi trên toàn bộ phổ đồ (hoặc một dải nào đó trong phổ đồ). Kiểu phân tích phổ tổng hợp từ nhiều điểm trên toàn bộ phổ đồ mang lại sự khác biệt cho phương pháp này vì nó làm giảm độ nhạy của tín hiệu nhiễu trên tất cả các điểm. Trong kỹ thuật này, cách thức thu dữ liệu từ quang phổ Raman cũng tương tự với cách thu dữ liệu từ quang phổ NIR. Bên cạnh đó quang phổ NIR đang được phát triển mạnh mẽ, đây là động lực lớn để thúc đẩy kỹ thuật này phát triển để phần mềm xử lý ngày càng tiện dụng hơn cũng như mang lại hiệu quả sử dụng cao hơn. Phương pháp đòi hỏi rất nhiều phép tính toán phức tạp, nhưng sự phát triển của công nghệ thông tin cùng với các tính năng ưu việt của máy tính ngày nay giúp cho việc tính toán trở nên dễ dàng và cho kết quả trong thời gian ngắn đã giải quyết được tất cả các vấn đề trên, chính vì vậy mà nó đã xóa bỏ mọi rào cản trong việc phát triển công nghệ phân tích dữ liệu đa biến.