[14], [28], [29]
Tuy đã được phát triển từ rất lâu, có rất nhiều ưu điểm, nhưng chi phí cho các thiết bị quang phổ Raman còn rất cao, nên nó rất khó để được sử dụng rộng rãi như một phép phân tích thông thường. Những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến phép đo phổ Raman đó là hiện tượng huỳnh quang, sự nóng lên của mẫu đo, sự hấp thụ phổ Raman bởi nền mẫu hoặc mẫu và ảnh hưởng của độ phân cực.
Nếu nền mẫu đo cho huỳnh quang, tín hiệu của phép đo sẽ có những thành phần huỳnh quang trong đó.
Tín hiệu huỳnh quang xuất hiện khi bước sóng laser kích thích trùng lặp với một dải hấp thụ của mẫu đo. Huỳnh quang thường phủ lên tín hiệu Raman, nó như là một nền dốc khá phẳng, có thể gây ra một đường nền ảo với độ nhiễu thấp và làm giảm tỉ lệ S/N của các tín hiệu Raman. Dải bước sóng và cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào thành phần hóa học của vật liệu phát huỳnh quang. Bởi vì tín hiệu huỳnh quang thường mạnh hơn tín hiệu Raman nên chúng thường bao phủ và làm suy giảm đáng kể tín hiệu Raman. Muốn triệt tiêu hoặc hạn chế huỳnh quang chúng ta thường sử dụng các detector vùng NIR. Tuy nhiên, việc giảm tín hiệu huỳnh quang bằng cách sử dụng nguồn laser kích thích có bước sóng dài một phần nào đó cũng làm giảm cường độ của tín hiệu Raman. Chính vì vậy để tỷ lệ S/N của tín hiệu lớn nhất, chúng ta phải tính toán để cân bằng giữa các yếu tố: loại bỏ huỳnh quang, cường độ phát hiện và sự đáp ứng của detector. Huỳnh quang chất rắn đôi khi được giảm thiểu bằng cách chiếu bức xạ laser vào mẫu đo một khoảng thời gian trước khi đo. Quá trình này được gọi là photobleaching, nó là quá trình làm giảm các loại hấp thụ cao. Photobleaching kém hiệu quả hơn trong chất lỏng, nơi có các mẫu di động.
Quá trình chiếu laser kích thích, có thể làm nóng mẫu và gây ra một loạt các ảnh hưởng như làm thay đổi trạng thái vật lý của mẫu (nóng chảy), chuyển đổi dạng thù hình, đốt cháy hoặc làm phân hủy mẫu. Nguy cơ làm nóng mẫu tăng khi công suất nguồn laser lớn hoặc kích thước của nguồn laser càng nhỏ (độ tụ cao) trong trường hợp sử dụng thấu kính hội tụ. Vấn đề này thường xảy ra với các chất màu, chất hấp thụ ánh sáng tốt hoặc các hạt nhỏ có khả năng truyền nhiệt kém. Những ảnh hưởng của việc làm nóng mẫu lên quá trình thu phổ Raman có thể nhận ra khi quan sát trực tiếp mẫu đo hoặc qua quan sát phổ đồ. Một số cách đơn giản làm giảm sự nóng lên của mẫu đó là giảm thông lượng tia laser, di chuyển mẫu hoặc chùm laser trong quá trình đo, tăng tính truyền nhiệt của mẫu bằng cách cho tiếp xúc với các vật dẫn nhiệt tốt.
Sự hấp thụ các tín hiệu Raman bởi nền mẫu hoặc mẫu đo cũng có thể xảy ra. Tuy việc sử dụng laser NIR để kích thích cùng với hệ thống FT-Raman làm giảm hiện tượng huỳnh quang, nhưng chính việc sử dụng laser NIR lại ảnh hưởng lớn đến sự thu tín hiệu Raman. Các ảnh hưởng này nhiều hay ít phụ thuộc vào hệ quang của máy quang phổ Raman và phụ thuộc vào bản chất của mẫu đo. Tuy nhiên, sự ảnh hưởng này không quá nặng nề như trong việc đo phổ hấp thụ NIR bởi vì với bước sóng dài thì độ xâm nhập vào bên trong mẫu đo của chùm laser là ít, tín hiệu Raman thu được chủ yếu là từ lớp mỏng ngoài cùng và vì lớp này mỏng nên độ hấp thụ tín hiệu Raman là không đáng kể.
Cuối cùng, chúng ta cần phải nhớ rằng bức xạ laser là phân cực, vì vậy phổ Raman của mẫu tinh thể cũng như các mẫu có cấu trúc định hướng có thể khác nhau phụ thuộc vào cách mà chúng được tạo thành.
Chương II. ỨNG DỤNG TRONG NGÀNH DƯỢC 2.1. Phân tích định tính [29]
Cũng như quang phổ IR, phổ Raman là phổ dao động phân tử, nó mang thông tin về các nhóm chức của mẫu, vì vậy dựa vào phổ thu được mà người ta xác định được chính xác nhóm chức của chất và từ đó xác định cấu trúc của mẫu. Có các phương pháp định tính hay dùng đó là:
Đo phổ Raman, kết hợp với phổ IR để tìm các nhóm chức đặc trưng, xác định cấu trúc của chất.
Đo phổ Raman, so sánh với phổ chuẩn trên thư viện phổ và kết luận sự có mặt hay không có mặt của chất phân tích.
Hình 2.1. Công thức hóa học và phổ Raman của một số tá dược thường dùng và một số API
2.2. Phân tích định lượng [28]
Cơ sở để phân tích định lượng Raman là cường độ tín hiệu Raman từ mẫu phân tích sẽ tăng tương ứng với sự tăng lên của lượng chất cần thăm dò trong mẫu, trong khi các yếu tố khác không thay đổi (cường độ tăng khi nồng độ chất phân tích tăng lên). Về nguyên tắc, điều này được xác định thông qua tín hiệu tán xạ Raman (trong thí nghiệm) cho bất kỳ thành phần nào của hợp chất và xác định nồng độ thành phần ấy trong mẫu thông qua việc đo tín hiệu Raman của đỉnh đặc trưng cho thành phần ấy [11]. Thật vậy, người ta có thể xác định được nồng độ của mẫu cần đo bằng việc so sánh phổ của chất phân
tích với đường cong tương quan đã được xác định từ trước. Đường cong này được xây dựng bởi việc đo phổ của mẫu chuẩn với các thành phần đã được biết đến. Ví dụ như để định lượng các dạng thù hình của Indomethacin, sử dụng tỷ lệ cường độ đỉnh ở 1698 cm-1(tinh thể) đến 1680 cm-1 (vô định hình) với đường cong tương quan đã được xây dựng từ trước [14].
Bảng 2.1. Tổng quan về một số quy trình định lượng dược phẩm bằng phổ Raman đã được công bố từ năm 2002-2006
Hợp chất Dạng bào chế Quang phổ kế Phân tích dữ liệu TLTK Acetylsalicylic acid, acetaminophen Viên nén FT M [26] Acyclovir Vỉ FT U [25] Ambroxol Viên nén FT M [27]
Ambroxol Viên nén Kỹ thuật
phân tán M [9] Calcitonin Dạng bột Kỹ thuật phân tán U [30] Captopril, prednisolone Viên nén FT M [14] Carbamazepine Vỉ FT M và U [23] Chlorophenicol palmitate Chất rắn (xác định dạng thù hình) FT U [8] Dipyrone Viên nén FT U [10]
Diltiazem hydrochloride Viên nén FT U [31] Indomethacin Viên nén FT M [15] Mannitol Bột FT M [4] Mannitol Bột FT U [22] Nitrofurantonin, theophylline, caffeine, carbamazenine Bột FT M [21] Paracetamol Bột FT U [3] Ranitidine Viên nén FT M [17] 5-p-Fluorobenzoyl- 2- benzimidazolecarb amic acid, methyl
ester
Bột FT M [7]
Trong đó : U và M tương ứng là các dữ liệu phân tích đơn biến và đa biến
Mặc dù về nguyên tắc thì phương pháp định lượng bằng quang phổ Raman không hề phức tạp hơn các phương pháp thông thường khác, nhưng có rất nhiều thách thức về kỹ thuật đo cần được giải quyết. Ví dụ như cường độ tín hiệu thu được có thể thay đổi khi chỉ cần một sự thay đổi nhỏ của một trong nhiều thông số của trang thiết bị đang sử dụng (công suất laser, khoảng cách từ vị trí đặt mẫu tới nguồn laser, …), vì vậy các tín hiệu tuyệt đối từ cùng một mẫu đo trên cùng một thiết bị sẽ thay đổi ít nhất một vài phần trăm
nếu có một bộ phận nào đó được lấy ra và thay thế, thậm chí nếu đo mẫu trong cùng một ngày thì tín hiệu đo của buổi sáng và buổi chiều đã có sự khác nhau mặc dù các yếu tố khác không thay đổi. Vì vậy mà khi có vấn đề về sự lặp lại của phép đo thì người ta rất hiếm khi sử dụng nó trong định lượng. [28] Nhưng vấn đề này được giải quyết dễ dàng bằng cách đo các dải tín hiệu cần thiết cùng với các dải tín hiệu khác trong mẫu, và so sánh tỷ lệ của chúng với nhau vì khi thực hiện như vậy thì các dải sẽ cùng tăng hoặc cùng giảm tín hiệu nhưng tỷ lệ của chúng thì không thay đổi và không làm ảnh hưởng đến kết quả đo. Điều này rất thuận lợi trong phân tích các thành phần trong công thức dược phẩm, thông thường một công thức thành phẩm sẽ gồm nhiều thành phần khác nhau. Ví dụ, khi phân tích quang phổ Raman của viên nén, các tín hiệu Raman của tá dược đều làm ảnh hưởng đến tín hiệu của dược chất trên phổ đồ, vì vậy mà khi định lượng dược chất trong viên, người ta thường chọn dải phổ đặc trưng cho dược chất, sau đó chọn dải phổ đặc trưng cho nền tá dược và cuối cùng so sánh tỷ lệ cường độ của các dải phổ này với nhau để đánh giá hàm lượng thuốc trong viên. Hình 2.1 cho thấy sự thay đổi về tỷ lệ cường độ giữa các dải phổ của manitol và acid salicylic khi thay đổi nồng độ của acid salicylic từ 0% đến 15%. [28]
Hình 2.2. Tỷ lệ cường độ tín hiệu của hợp chất
Trong một vài cách tiếp cận khác, người ta đưa ra phương pháp khác là phương pháp thêm chất phân tích khác (chất chuẩn nội), có cường độ tín hiệu Raman lớn hơn, sắc nét hơn và có dải tín hiệu không ảnh hưởng đến dải phổ của chất phân tích đang xét để thuận tiện cho việc khảo sát. Tuy nhiên điều này là không cần thiết, và nhiều khi nó còn làm ảnh hưởng đến hiệu quả phân tích.
Có hai phương thức tiếp cận để thu được dữ liệu phổ định lượng, đó là phương thức phân tích dữ liệu đơn biến và phân tích dữ liệu đa biến. Trong phương thức thu dữ liệu đơn biến truyền thống, người ta thường đo cả chiều cao và diện tích píc của vùng dữ liệu đặc trưng được quan tâm để so sánh với chiều cao và diện tích píc của chất chuẩn, sau đó tính toán tỉ lệ tương đối của các thành phần để dự đoán và xây dựng cấu trúc của mẫu thử.
Hiện tại, phương pháp này vẫn đang được sử dụng bởi những ưu điểm không thể phủ nhận của nó đó là phép phân tích đơn giản và cho độ chính xác khá cao. Tuy nhiên, ngày nay phương pháp phân tích dữ liệu đa biến được sử dụng rộng rãi hơn. Phương pháp phân tích dữ liệu đa biến giúp ta xác định được những biến đổi trên toàn bộ phổ đồ (hoặc một dải nào đó trong phổ đồ). Kiểu phân tích phổ tổng hợp từ nhiều điểm trên toàn bộ phổ đồ mang lại sự khác biệt cho phương pháp này vì nó làm giảm độ nhạy của tín hiệu nhiễu trên tất cả các điểm. Trong kỹ thuật này, cách thức thu dữ liệu từ quang phổ Raman cũng tương tự với cách thu dữ liệu từ quang phổ NIR. Bên cạnh đó quang phổ NIR đang được phát triển mạnh mẽ, đây là động lực lớn để thúc đẩy kỹ thuật này phát triển để phần mềm xử lý ngày càng tiện dụng hơn cũng như mang lại hiệu quả sử dụng cao hơn. Phương pháp đòi hỏi rất nhiều phép tính toán phức tạp, nhưng sự phát triển của công nghệ thông tin cùng với các tính năng ưu việt của máy tính ngày nay giúp cho việc tính toán trở nên dễ dàng và cho kết quả trong thời gian ngắn đã giải quyết được tất cả các vấn đề trên, chính vì vậy mà nó đã xóa bỏ mọi rào cản trong việc phát triển công nghệ phân tích dữ liệu đa biến.
2.3. Ứng dụng chung của phương pháp phân tích phổ Raman trong ngành dược [19], [28], [31] ngành dược [19], [28], [31]
Từ khi phương pháp Raman xuất hiện, trên lý thuyết người ta đã mong muốn phát triển ứng dụng cho cả định tính và định lượng. Nhưng giai đoạn trước khi có sự xuất hiện của nguồn sáng kích thích laser, thời gian để thu được quang phổ phải tính theo giờ, nên hoàn toàn không thực tế khi sử dụng tán xạ Raman, thay vào đó người ta đã sử dụng các kỹ thuật phân tích thông thường. Với sự phát triển của công nghệ laser và sự ra đời hệ thống quang phổ kế/detector đã giúp thu được tín hiệu của Raman ở dải phổ rộng với độ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhạy và độ chính xác cao. Sau đó công cụ biến đổi Fourier hay quang phố kế đã sử dụng detector đa kênh (chủ yếu dùng CCD) không những giảm đáng kể thời gian ghi lại quang phổ mà còn giúp cho người sử dụng có thể thao tác dữ liệu trên hệ thống kỹ thuật số và làm đơn giản hóa các quá trình loại trừ tín hiệu nhiễu và trừ nền. Ngoài ra kỹ thuật FT còn có thể sử dụng với bước sóng kích thích dài hơn các thiết bị quang phổ kế trước đó nhằm mục đích làm giảm tín hiệu huỳnh quang một cách đáng kể. [28]
Ngoài những ứng dụng rất quan trọng trong định tính, quang phổ Raman cũng được sử dụng trong các kỹ thuật phân tích định lượng dược phẩm và kỹ thuật này đã có những bước thay đổi đáng kể từ một thập kỷ trước. Ngày nay, các thiết bị Raman đã được cải thiện về rất nhiều về tính năng cũng như hình thức để hóa phù hợp để sử dụng trong các lĩnh vực khác nhau, nhất là trong dược phẩm.
Một tính năng hữu ích quan trọng của quang phổ Raman là khả năng đo trực tiếp trên chất rắn. Các thông số ảnh hưởng đến cường độ tín hiệu Raman thu được từ chất rắn là kích thước hạt và mật độ dược chất trong viên. [31]
Quang phổ Raman đang trở nên phổ biến trong các lĩnh vực khác nhau của ngành Dược. Cũng như quang phổ IR, nó cũng cung cấp các thông tin về dải dao động cơ bản (vùng vân tay), cung cấp các phép phân tích định tính với độ chính xác cao. Nó cũng là phương pháp bổ sung cho những phương pháp phân tích hiện có như NMR, MS và các phép phân tích nguyên tố khác. Việc xác định nhanh các hợp chất trong hỗn hợp thuốc, các hoạt chất và tá dược; việc xác định các chất gây ô nhiễm, việc xác định các đặc tính về cấu trúc của nguyên liệu và các thông tin về các thành phần trong các quá trình pha trộn tạo nên công thức thuốc… có thể được làm sáng tỏ thông qua kỹ thuật phổ Raman. Sau đây là một số ứng dụng của quang phổ Raman trong ngành Dược.
Một số dược phẩm đã được nghiên cứu bởi phương pháp quang phổ Raman như Acebutolol, Alprenolol, Acetaminophen, Amilorid, Amoxycillin, Amphetamin và / hoặc các hợp chất liên quan, Amphotericin A / B, Arterenol, Aspirin, Bucindolol, Canxi cacbonat và glycin, Cimetidin, Ciprofloxacin, Cocain, Diclofenac, Fluconazol, Fluocortolon, Ibuprofen, Isosorbid, Nicotinamid, Spironolacton, Strychnin, Sulfamerazin, Sulfadiazin, Triamteren, Trifluoperazin. [19]
Để kiểm soát hoạt động sản xuất dược phẩm đòi hỏi phải biết các tính chất vật lý cũng như tính chất hóa học, công thức bào chế của tất cả các phân đoạn trong quá trình sản xuất. Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu dược phẩm đã thừa nhận các tiện ích không phá hủy mẫu của phương pháp quang phổ Raman và xem nó như một công cụ tiềm năng để ứng dụng trong các quy trình phân tích hiện đại, nhằm mục tiêu xác định thành phần thuốc và giám sát quá trình chuyển đổi đa hình. Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu còn cho thấy quang phổ Raman có thể được sử dụng trong phép định lượng, kiểm tra chất lượng trong dây chuyền sản xuất mà không ảnh hưởng đến quá trình sản xuất cũng như xác định các thành phần dược phẩm trong viên nang xuyên qua màng gelatin mà không cần phải bóc viên. Niemczyk cho thấy quang phổ Raman sử dụng nguồn kích thích laser NIR rất tiềm năng là một phương pháp xác định nhanh các mẫu dược phẩm. Tán xạ Raman xuyên qua lớp vỉ và thu dữ liệu phổ trực tiếp về công thức thuốc từ bên trong viên nang và từ viên nang bên trong vỉ thuốc.
Một điều đáng lưu ý là phương pháp Raman đang được sử dụng là phương pháp phân tích để bổ sung hoặc thay thế, chứ không phải để chống lại các phương pháp quang phổ hiện nay. Và kỹ thuật Raman cũng đang được xem như một phương pháp rất có khả năng thay thế các kỹ thuật phân tích cơ bản.
2.4. Ứng dụng phương pháp quang phổ Raman trong kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc.
Với những lợi thế của mình, phương pháp phân tích quang phổ Raman đã và đang giữ một vai trò to lớn trong công tác kiểm soát, phân tích và phát hiện thuốc giả. Cụ thể như sau: