Nghiên cứu đặc điểm vi học, thành phần hóa học của vị thuốc ba chạc (euodia lepta (spreng ) merr , họ cam rutaceae)

ĐẶT VẤN ĐỀNhận thức được giá trị to lớn mà thiên nhiên ban tặng, thời gian gần đây, việcsử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên trong vấn đề chăm sóc sức khỏetrên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng ngày càng phát triển. Hiện nay, rấtnhiều dược liệu và các bài thuốc dân gian đã được nghiên cứu và đưa vào sử dụngtrong điều trị. Việt Nam là một đất nước có truyền thống lâu đời về sử dụng cây cỏlàm thuốc do có một thảm thực vật vô cùng phong phú. Do đó, để bảo tồn và pháttriển nền y học cổ truyền dân tộc thì việc nghiên cứu và khai thác các tài nguyêndược liệu là một vấn đề đã và đang được quan tâm phát triển.Cây Ba chạc là một trong những cây dược liệu khá phổ biến, mọc hoang ởnhiều vùng trên khắp nước ta, được dùng từ lâu trong dân gian với mục đích chữaghẻ, mụn nhọt, lở ngứa, chốc đầu, trị phong thấp, đau nhức gân xương…Trên thếgiới và Việt Nam cũng có một số nghiên cứu về thành phần hóa học lá Ba chạc, còncác bộ phận khác hầu như ít được nghiên cứu. Để góp phần đánh giá đầy đủ về tiềmnăng của cây thuốc này, từ đó có cơ sở khoa học để khai thác sử dụng một cách hợplí, an toàn và hiệu quả, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểmvi học và thành phần hóa học vị thuốc Ba chạc (Euodia lepta (Spreng.) Merr.,họ Cam Rutaceae)”.Với các mục tiêu:1. Nghiên cứu đặc điểm vi học lá, cành non và vỏ thân Ba chạc.2. Nghiên cứu sơ bộ các thành phần hóa học lá, cành non và vỏ thân Ba chạc.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn: PGS.TS Vũ Văn Điền Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền

HÀ NỘI – 2013

Trong thời gian thực hiện khóa luận tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ của

các cán bộ phòng thực vật đặc biệt là ThS Đỗ Văn Hài - Viện sinh thái và Tài

nguyên sinh vật trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, anh

Lê Thanh Sơn cán bộ Viện Dược Liệu, tôi xin chân thành cảm ơn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè tôi - những người đã luôn động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập

Hà Nội, Ngày 20 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Phạm Tiến Bình

MỤC LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật 2

1.1.3 Phân bố và bộ phận dùng 3

1.2 Thành phần hóa học 3

1.2.1 Thành phần hóa học các bộ phận trên mặt đất cây ba chạc nói chung 3

1.2.2 Thành phần hóa học lá cây Ba chạc 5

1.2.3 Thành phần hóa học rễ cây Ba chạc 8

1.3 Tác dụng dược lý 9

1.3.1 Tác dụng kháng khuẩn 9

1.3.2 Tác dụng chống viêm 9

1.3.2 Tác dụng lợi sữa 9

1.3.3 Độc tính cấp 9

1.3.4 Dược lý lâm sàng 9

1.4 Tác dụng theo YHCT 9

1.5 Công dụng 10

1.6 Một số bài thuốc có Ba chạc 10

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 11

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 11

2.1.2 Hóa chất, dung môi nghiên cứu 11

2.1.3 Dụng cụ và trang thiết bị dùng trong nghiên cứu 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học 12

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 12

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học 12

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 13

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 14

Kiểm tra tên khoa học của mẫu nghiên cứu 14

3.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học vỏ thân, lá và cành non cây Ba chạc 14

3.1.1 Đặc điểm vi phẫu 14

3.1.2 Đặc điểm bột dược liệu 17

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học vỏ thân, lá và cành non cây Ba chạc 19

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học 19

3.2.2 Định tính alcaloid toàn phần bằng SKLM 29

3.2.3 Chiết xuất và định tính các phân đoạn bằng SKLM 30

3.2.4 Định lượng tinh dầu có trong lá và cành non cây Ba chạc 38

3.4 Bàn luận 39

3.4.1 Về đặc điểm vi học 39

3.4.2 Về thành phần hóa học 39

KẾT LUẬN 41

ĐỀ XUẤT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Căn E Cắn phân đoạn chiết ethyl acetat

Cắn B Cắn phân đoạn chiết n-butanol bão hòa trong nước

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Công thức các hợp chất 2,2-dimethylchroman 4 Bảng 1.2 Công thức các hợp chất 2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran 6

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong các mẫu

Bảng 3.2 Hàm lượng cắn các phân đoạn thu được từ dược liệu 33 Bảng 3.3 Bảng giá trị Rf các vết trên sắc ký đồ cắn H tại UV366 35 Bảng 3.4 Bảng giá trị Rf các vết trên sắc ký đồ cắn E tại UV366 36 Bảng 3.5 Bảng giá trị Rf các vết trên sắc ký đồ cắn B tại UV366 37

Bảng 3.6 Hàm lượng tinh dầu trong dược liệu lá và cành non cây Ba

Sắc ký đồ cắn alcaloid toàn phần 2 mẫu dược liệu tại

UV366 (a), UV254 (b) và sau khi phun thuốc thử Dragendorff (c)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhận thức được giá trị to lớn mà thiên nhiên ban tặng, thời gian gần đây, việc

sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên trong vấn đề chăm sóc sức khỏe trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng ngày càng phát triển Hiện nay, rất nhiều dược liệu và các bài thuốc dân gian đã được nghiên cứu và đưa vào sử dụng trong điều trị Việt Nam là một đất nước có truyền thống lâu đời về sử dụng cây cỏ làm thuốc do có một thảm thực vật vô cùng phong phú Do đó, để bảo tồn và phát triển nền y học cổ truyền dân tộc thì việc nghiên cứu và khai thác các tài nguyên dược liệu là một vấn đề đã và đang được quan tâm phát triển

Cây Ba chạc là một trong những cây dược liệu khá phổ biến, mọc hoang ở nhiều vùng trên khắp nước ta, được dùng từ lâu trong dân gian với mục đích chữa ghẻ, mụn nhọt, lở ngứa, chốc đầu, trị phong thấp, đau nhức gân xương…Trên thế giới và Việt Nam cũng có một số nghiên cứu về thành phần hóa học lá Ba chạc, còn các bộ phận khác hầu như ít được nghiên cứu Để góp phần đánh giá đầy đủ về tiềm năng của cây thuốc này, từ đó có cơ sở khoa học để khai thác sử dụng một cách hợp

lí, an toàn và hiệu quả, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm

vi học và thành phần hóa học vị thuốc Ba chạc (Euodia lepta (Spreng.) Merr.,

họ Cam Rutaceae)”

Với các mục tiêu:

1 Nghiên cứu đặc điểm vi học lá, cành non và vỏ thân Ba chạc

2 Nghiên cứu sơ bộ các thành phần hóa học lá, cành non và vỏ thân Ba chạc

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố

1.1.1 Vị trí phân loại

Cây Ba chạc có tên khoa học là Euodia lepta (Spreng.) Merr.; vị trí phân loại

được tóm tắt theo sơ đồ sau [1], [2], [9]

Giới thực vật bậc cao

Ngành Ngọc lan (Mangnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoa hồng (Rosidae) Liên bộ Cam (Rutanae)

Bộ Cam (Rutales)

Họ Cam (Rutaceae) Chi Euodia Loài Euodia lepta (Spreng.)Merr

1.1.2 Đặc điểm thực vật

Tên Việt Nam: Ba chạc, chè đắng, cây dầu dấu, chè cỏ, hủ nậm, thùa kheo, bí bái đực, ba gạc tắm ghẻ, bẩu khâm (Tày), co sám véng (Thái) [4]

Tên khoa học: Euodia lepta (Spreng.) Merr

Tên đồng nghĩa: Euodia triphylla Guill on D.C.; Melicope ptelefolia (Cham Ex Benth.) Hartley; Ilex lepta Sprengel; Lepta triphylla Loureiro [4], [18].

Họ Cam (Rutaceae)

Cây nhỏ, cao 1 – 3m, có khi hơn (4 – 5m) Cành non có lông, sau đó nhẵn Lá kép mọc đối, có ba lá chét, mép nguyên, gân phụ 15 – 20 cặp, lá non có lông rất mịn, lá chét hình trái xoan: dài 4,5 – 13cm, rộng 2,5 – 5,5cm, gốc thuôn, đầu nhọn; cuống lá dài có lông, tày ở phần dính vào thân, cuống lá chét không có hoặc rất ngắn Cụm hoa mọc thành xim ở kẽ lá, ngắn hơn lá; lá bắc nhỏ; hoa nhỏ màu trắng;

lá đài hình trái xoan, có lông ở mép; cánh hoa có 4 – 5, dài gấp 3 lần lá đài, hơi khum ở đầu, nhẵn; nhị 4, chỉ nhị bằng hoặc dài hơn cánh hoa; bầu nhụy hình trứng,

có lông, vòi nhụy nhẵn, đầu nhụy có 4 rãnh Quả nang hình trái xoan, khi chín màu

đỏ, chia làm 1– 4 mảnh, vỏ nhẵn (1– 4 hạch nhẵn), phía ngoài nhăn nheo; mỗi ngăn chứa một hạt hình cầu đường kính 2mm, màu đen xanh, bóng Toàn cây có tinh dầu thơm [4], [9], [12]

Mùa hoa tháng 4 – 5, mùa quả tháng 6 – 7 [4], [9]

1.1.3 Phân bố và bộ phận dùng

 Phân bố: Ba chạc là cây bụi ưa sáng, chịu được hạn và có thể sống trên nhiều loại đất khác nhau Trên thế giới, cây Ba chạc phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới, chủ yếu ở các nước như Trung quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Myanmar, Thái Lan, Philippin Ở Việt Nam, cây mọc hoang, rất phổ biến trên khắp nước ta từ miền Bắc đến miền Nam Cây thường được gặp ở các vùng đồi, rừng thứ sinh, rừng thưa, hoặc trong các bụi cây ở vùng đồng bằng [4], [9], [12], [18]

 Bộ phận dùng: Lá thu hái quanh năm dùng tươi hoặc khô (phơi khô trong râm hoặc sấy khô) [4], [9] Thân và rễ rửa sạch thái lát, phơi khô [4], [9], [12]

1.2 Thành phần hóa học

1.2.1 Thành phần hóa học các bộ phận trên mặt đất cây Ba chạc

Li G.L và cộng sự đã nghiên cứu phần trên mặt đất cây Ba chạc Trung Quốc, kết

quả là phân lập được 13 hợp chất 2,2-dimethylchromen: Leptol A (1), Ethylleptol A (2), Lepten A (3) [22]; Methylleptol A (4), Leptonol (5) [25]; Leptol B (6), Ethylleptol B (7), Methylleptol B (8), Lepten B (9), Evodion (10), Isoevodionol (11), Alloevodion (12) [24]; Methylevodionol (13) [23]

OCH3

OH

(6) Leptol B

OOCH3

(11) Isoevodionol

OOH

(13) Methylevodionol

OCH3

OOH

OCH3

Nghiên cứu khác của Li G.L và cộng sự tiếp tục phân lập được tám hợp chất

2,2– dimethylchroman mới là Leptin A, B, C, D, E, F, G, H (14 - 21) [23], [26]

Công thức các chất này được trình bày ở bảng 1.1

Nghiên cứu lá cây Ba chạc của Việt Nam, nhóm tác giả Nguyễn Hồng Vân, Trần

Văn Sung, Adam G và cộng sự đã tách được: 19 hợp chất (25 – 42) là

dimethyl- 2H-1-benzopyran trong đó có 14 hợp chất mới [19]; hai hợp chất

2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran mới là 5,5’-dimetoxy-alloagerasamin (43) và Melifolin (44) [29]; hai bis-quinolion alcaloid mới là Melicobisquinolion A (45) và B (46)

[20] Công thức các hợp chất 2,2-dimethyl- 2H-1-benzopyran được tóm tắt ở bảng 1.2

H3COO

Gần đây, Khoziral S và cộng sự đã phân lập được: một geranylacetophenol mới

là 2,4,6- trihydroxy-3- geranylacetophenol (47) cùng với 2 chất đã được biết đến là acid p-O-geranylcoumaric (48), Kokusaginine (49) và β-sitosterol trong một nghiên

cứu lá cây Ba chạc Malaysia [21], [28]

OHHO

O

(48) p - O - geranylcoumaric

Cành và lá cây Ba chạc Trung Quốc có chứa 0,20 – 0,25% tinh dầu Thành phần

các tinh dầu được xác định: Limonen (49) (27,22%), α-pinen (50) (26,34%), linalool (51) (9,18%), α-coparen (5,18 %), α-thujen (3,20 %), β-thujen (2,70%),

myrcen (2,60%), β-ocimen (2,60%), cedrenol (2,19 %), (E)-β-ocimen (1,59%), γ-muurolen (1,44%), α-terpineol (1,36%), cis-linalool oxit (furanoit) (1,28%), 6-methyl hepten-2-on (1,24%), γ-cadien (1,11%), δ-cadinol (1,01%), p-cymen (0,85%) [30] Dưới đây là công thức một số tinh dầu chính

Rễ Ba chạc có chứa các alcaloid: (-)-edulinine (52), (-)-ribalinine (53) và isoplatydesmine (54) [16], [13]

Ngoài cành, lá cây và vỏ rễ, vỏ quả cũng có tinh dầu mùi thơm nhẹ Trong tinh dầu của cây còn có furfuraldehyd [4], [12]

1.3.2 Tác dụng lợi sữa

Trên mô hình diều chim bồ câu, cao cồn và nước sắc lá, cành non cây Ba chạc, cho uống liều 10g/kg/ngày, làm cho tế bào biểu mô diều chim bồ câu chuyển sang hình đăng ten, trong đó có 1/5 con đã hình thành tuyến sữa, tức là có tác dụng lợi sữa [4]

1.5 Công dụng

 Lá Ba chạc:

+ Dùng ngoài chữa ghẻ, mụn nhọt, lở ngứa, chốc đầu Ở Trung Quốc còn chữa vết thương nhiễm khuẩn, viêm mủ áp xe, eczema Lá tươi nấu nước tắm, rửa hoặc giã đắp[4], [7], [9], [12], [17]

+ Lá dùng dạng nước sắc hoặc nấu cao, ngày 20-40g, chữa trị các chứng nhiệt sinh khát nước, viêm họng, viêm amidan, ho, mắt mờ, trẻ em sốt cao gây co giật, phụ nữ mới đẻ ít sữa kém ăn Ở Trung Quốc còn để phòng bệnh cúm, bệnh truyền nhiễm, viêm não, đột quỵ tim, cảm lạnh, viêm gan [4], [9]

 Rễ và vỏ thân Ba chạc:

Chữa phong thấp, đau nhức gân xương, tê bại, bán thân bất toại, kinh nguyệt không đều Ở Trung Quốc còn chữa ngộ độc lá ngón Ngày 8-24g sắc uống [4], [9] Dùng làm thuốc bổ đắng giúp ăn ngon, dễ tiêu [7], [12]

1.6 Một số bài thuốc có Ba chạc

1 Thuốc bổ đắng (giúp ăn ngon, dễ tiêu) đặc biệt cho phụ nữ sau khi đẻ:

Ngày 8-16g lá hoặc 4-12g rễ, sắc uống [4]

2 Thuốc lợi sữa:

Ngày 8-16g lá, sắc uống nhiều ngày [4]

3 Thuốc điều kinh:

Ngày 4-12g rễ, vỏ thân sắc uống [4]

4 Chữa viêm họng, viêm amidan, ho, viêm loét lưỡi miệng, viêm dạ dày:

Ngày 12-20g lá tươi sắc uống Trường hợp viêm miệng thì ngậm và nuốt dần [4]

5 Chữa sốt, ngộ độc, háo khát, nước tiểu vàng nâu:

Ngày 20g lá khô hoặc 40g lá tươi sắc uống [4]

6 Chữa phong thấp, viêm khớp lưng gối đau nhức, tê bại, đau dây thần kinh hông: Ngày 20-40g rễ Ba chạc sắc uống hoặc bài thuốc: rễ Ba chạc, Dây đau xưởng, Câu đằng, Tầm gửi cây dâu (mỗi vị 20-30g ) sắc uống [4]

7 Thuốc phòng cúm, bệnh truyền nhiễm, viêm não:

Lá Ba chạc 15g, Rau má 30g, Đơn buốt 15g, Cúc chỉ thiên 15g Sắc uống [4],[9]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

Thu hái lá, cành non, vỏ thân và mẫu làm tiêu bản tại xã Đại Phạm, huyện Đoan Hùng, tỉnh Phú Thọ vào tháng 3 năm 2013 Sau khi thu hái về dược liệu được làm sạch, vỏ thân được sấy khô ở nhiệt độ 600C, dược liệu lá và cành non được sấy ở

400C; tất cả đều được bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo

2.1.2 Hóa chất, dung môi nghiên cứu

 Dung môi: ethanol (EtOH), methanol (MeOH), chloroform, n-hexan, n-butanol (BuOH), ethyl acetat, toluen, aceton, acid formic…

Các thuốc thử thường dùng để định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu

2.1.3 Dụng cụ và trang thiết bị dùng trong nghiên cứu

 Dụng cụ, thiết bị dùng cho nghiên cứu đặc điểm vi học và thành phần hóa học: + Phiến kính, lam kính, máy cắt mỏng cầm tay, kính hiển vi, máy ảnh

+ Bản mỏng: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 của hãng Merck

+ Ống nghiệm, cốc có mỏ, bình nón, bình gạn, pipet các loại, máy đo độ ẩm Precisa, máy cất quay BUCHI, máy ly tâm Model: PLC-012E, máy chiết xuất siêu

âm Wise Clean, hệ thống máy sắc ký TLC VISUA LIZER…

+ Bộ dụng cụ xác định hàm ẩm bằng phương pháp cất với dung môi

+ Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến (dựa trên cơ sở dụng cụ theo quy định của Dược điển Việt nam I, 1971), sử dụng ống hứng tinh dầu nhẹ hơn nước

 Một số thiết bị khác: máy xay dược liệu, tủ sấy, tủ hốt Uni-Lab, cân phân tích Sartorius, cân kỹ thuật Precisa…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học

 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu lá và vỏ thân cây Ba chạc

 Nghiên cứu đặc điểm bột vỏ thân; lá và cành non cây Ba chạc

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

 Định tính các nhóm chất hữu cơ trong hai mẫu dược liệu là: vỏ thân; lá và cành

non của cây Ba chạc bằng các phản ứng hóa học

 Định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng

 Chiết xuất phân đoạn dược liệu vỏ thân và định tính các phân đoạn bằng sắc ký

lớp mỏng

 Định lượng tinh dầu trong mẫu lá, cành non cây Ba chạc

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học

2.3.1.1 Đặc điểm vi phẫu

Tiến hành làm tiêu bản vi phẫu theo các bước sau:

- Chọn lá và phần vỏ thân thích hợp

- Cắt tiêu bản bằng máy cắt mỏng cầm tay

- Xử lý lát cắt: Lựa chọn những lát cắt mỏng, tẩy bằng dung dịch nước javen, rửa sạch bằng nước cất, tẩy tiếp bằng dung dịch chloralhydrat, rửa lại bằng nước cất, ngâm 30 phút trong acid acetic 5%, rửa bằng nước cất 3 lần Sau đó tiến hành nhuộm kép với xanh methylen và đỏ son phèn [3]

- Quan sát, mô tả và chụp ảnh: Lên tiêu bản bằng dung dịch glycerin rồi quan sát dưới kính hiển vi, mô tả đặc điểm giải phẫu, chụp ảnh vi phẫu qua kính hiển vi [3], [14]

2.3.1.2 Đặc điểm bột dược liệu

- Quan sát trực tiếp, ngửi, nếm để xác định màu, mùi, vị

- Lên tiêu bản bột dược liệu riêng mỗi mẫu bằng nước cất, quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột trên kính hiển vi bằng máy ảnh cầm tay Ảnh

các đặc điểm bột được chuyển vào máy tính, ghép thành ảnh hoàn chỉnh, rõ nét [14]

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ

- Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong 2 mẫu dược liệu cây Ba chạc: vỏ thân (mẫu 1); lá và cành non (mẫu 2) bằng các phản ứng hóa học thường quy theo các tài liệu hóa thực vật [5]

- Định tính alcaloid toàn phần bằng sắc ký lớp mỏng [5]

2.3.2.2 Định lượng tinh dầu

Xác định hàm lượng tinh dầu trong lá, cành non cây Ba chạc bằng phương pháp cất kéo hơi nước theo tài liệu [5], [8]

2.3.2.3 Chiết, tách và định tính một số phân đoạn bằng SKLM

- Vỏ thân Ba chạc được chiết với dung môi là ethanol 90% bằng phương pháp chiết siêu âm ở 600C Thu hồi dung môi được dịch chiết đậm đặc

- Từ dịch chiết này tiến hành chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, ethyl acetat, n-butanol bão hòa trong nước Sau đó thu hồi các dung môi được cắn các phân đoạn chiết Định tính các cắn này bằng SKLM

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

 Kiểm tra tên khoa học của mẫu nghiên cứu

Do chúng tôi chuẩn bị tiêu bản mẫu cây khô trước đó, mà chưa lấy được mẫu cây tươi vì vậy các chuyên gia thực vật không thể thẩm định tên khoa học trực tiếp được Do đó chúng tôi phải tiến hành đối chiếu mẫu Ba chạc thu hái của chúng tôi với các mẫu tiêu bản lưu tại các trung tâm khoa học lớn về thực vật cây thuốc như Viện sinh thái tài nguyên thực vật Việt Nam (thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam); Viện Dược liệu Việt Nam để xác định tên khoa học mẫu nghiên cứu

Kết quả:

- Viện Dược liệu: mẫu số 1041c (Phụ lục 1)

- Viện sinh thái: mẫu số 3793 (Phụ lục 2), mẫu số 238 (Phụ lục 3)

- Mẫu của chúng tôi hiện đang lưu tại Bộ môn Dược Học Cổ Truyền- Đại học Dược Hà Nội (Phụ lục 4)

Nhận xét: Mẫu của chúng tôi hoàn toàn giống các mẫu đã được kiểm tra về đặc

điểm thực vật Vì vậy mẫu nghiên cứu của chúng tôi là cây Ba chạc có tên khoa học

là Euodia lepta (Spreng.) Merr., họ Cam (Rutaceae)

3.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học vỏ thân, lá và cành non cây Ba chạc

3.1.1 Đặc điểm vi phẫu

3.1.1.1 Đặc điểm vi phẫu lá

Vi phẫu lá cây Ba chạc dưới kính hiển vi có các đặc điểm sau:

 Phần gân chính: Gân lá phía trên lồi ít, phía dưới lồi nhiều, biểu bì trên (1) và

biểu bì dưới (2) thường là một lớp tế bào hình tròn xếp đều đặn Phía ngoài biểu bì

có lông che chở đơn bào nhỏ (3) Mô dày cấu tạo bởi các tế bào hình tròn thành dày, xếp đều đặn (4) Mô mềm gồm các tế bào thành mỏng (5), rải rác có các túi chứa tinh dầu (6), và các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (7) Mô cứng (8) cấu tạo bởi các tế bào có kích thước nhỏ, thành dày hóa gỗ tạo thành cung bao phía ngoài bó libe-gỗ Bó libe (9)-gỗ (10) của gân chính là cung libe-gỗ lớn Trong cùng là mô mềm ruột gồm các tế bào lớn thành mỏng (11) Hình 3.1

6 Túi chứa tinh dầu

7 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai

8 Mô cứng

9 Bó libe

10 Bó gỗ

11 Mô mềm ruột

 Phần phiến lá: Biểu bì (1) gồm một lớp tế bào có hình chữ nhật, kích thước dài

hơn nhiều so với tế bào biểu bì ở gân lá, rải rác có lông che chở Mô giậu (2) gồm 2-3 lớp tế bào thành mỏng, rải rác có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai (3)

Túi tiết tinh dầu lớn (4) nằm trong mô giậu sát lớp biểu bì trên Mô khuyết (5) gồm

các tế bào thành mỏng Rải rác có các bó sợi (6) bắt màu đỏ Hình 3.2

Hình 3.2 Ảnh chụp vi phẫu phiến lá Ba chạc

Chú thích:

1 Biểu bì

2 Mô dậu

3 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai

4 Túi tinh dầu

5 Mô khyết

6 Bó sợi

3.1.1.2 Đặc điểm vi phẫu vỏ thân

Mặt cắt ngang thân thường có hình tròn Cấu tạo của vỏ thân:

Ngoài cùng là lớp bần (1) gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật xếp đồng tâm Tiếp đến là các tế bào mô mềm (2) thành mỏng xếp đều đặn, càng vào sâu phía trong thành các tế bào càng dày hơn, các tế bào xếp lộn xộn hơn, xuất hiện nhiều hơn các tế bào có chứa tinh thể calci oxalat hình cầu gai (3) Rải rác trong mô mềm

có nhiều sợi, bó sợi (4) và tế bào mô cứng, khối mô cứng (5) thành dày hóa gỗ Một

số tia ruột (6) cấu tạo từ một hoặc hai dãy tê bào xuất phát từ phần giữa lớp mô mềm hướng vào trong thân, kích thước các tia bé dần Hình 3.3

Các tinh thể calci oxalat hình cầu gai đứng riêng rẽ, kích thước nhỏ (1) Mảnh

mô mềm gồm các tế bào hình gần tròn, thành mỏng (2) Đặc biệt có nhiều mảnh mô mềm mang các giọt tinh dầu bên trong (3) Có nhiều mảnh mạch xoắn (4) Sợi thường ở dạng các bó sợi (5) Nhiều mảnh phiến lá mang lỗ khí hình song bào rõ (6) Rải rác có các lông che chở đơn bào (7) Hình 3.4

Hình 3.4 Ảnh chụp đặc điểm bột lá và cành non Ba chạc dưới kính hiển vi

Chú thích:

1 Tinh thể calci oxalat hình cầu gai 5 Bó sợi

3 Mảnh mô mềm có chứa tinh dầu 7 Lông che chở đơn bào

4 Mảnh mạch xoắn

3.1.2.2 Đặc điểm bột vỏ thân

Bột có màu vàng xám, có mùi thơm nhẹ, vị đắng chát; quan sát dưới kính hiển vi thấy:

Có nhiều mảnh bần gồm nhiều tế bào hình chữ nhật xếp thành hàng (2) Mảnh

mô mềm gồm các tế bào thành mỏng (3) Rải rác có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai kích thước nhỏ (1) Sợi có thể đứng riêng rẽ hoặc thành bó sợi (4) Tế bào

mô cứng là những tế bào thành dày, khối mô cứng gồm nhiều tế bào trong có chứa tinh thể (5) Đặc biệt có nhiều khối nhựa hình gần tròn màu cam đỏ hay vàng cam đứng riêng biệt hoặc tụ lại thành khối lớn (6) Rải rác có các lông che chở đơn bào (7) Hình 3.5

Hình 3.5 Ảnh chụp đặc điểm bột vỏ thân Ba chạc dưới kính hiển vi

7 Lông che chở đơn bào

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học vỏ thân, lá và cành non cây Ba chạc

3.2.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học

Tiến hành song song các phản ứng hóa học định tính hai mẫu dược liệu riêng biệt: vỏ thân Ba chạc (mẫu 1); lá và cành non Ba chạc (mẫu 2)

 Định tính Alcaloid

 Chiết xuất: Cân khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml dung dịch H2SO4 1N, đun đến sôi, để nguội Lọc lấy dịch lọc vào một bình gạn dung tích 125ml Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch ammoniac đặc (khoảng 6ml) đến phản ứng kiềm (thử bằng giấy quỳ) Sau đó lắc chiết với

chloroform 3 lần, mỗi lần 5ml, gạn lấy lớp chloroform Gộp dịch chiết chloroform, chia đều vào hai ống nghiệm lớn, sau đó bốc hơi cách thủy đến khô thu được cắn Ống 1: thêm vào 6ml dung dịch H2SO4 1N hòa tan cắn dùng để làm phản ứng định tính Ống 2: dùng để định tính bằng SKLM

 Làm phản ứng định tính: Cho dịch chiết ở ống 1 vào 3 ống nghiệm nhỏ ( ống 4,

Để các ống nghiệm qua đêm, hôm sau thấy lượng tủa nhiều hơn

Nhận xét: Sơ bộ kết luận vỏ thân, lá và cành non của cây Ba chạc đều có alcaloid

 Định tính Flavonoid

Cân khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml EtOH 90%, đun cách thủy 15 phút, lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp Dịch lọc được dùng làm các phản ứng :

 Phản ứng Cyanidin:

Cho 2ml dịch lọc vào 1 ống nghiệm, thêm 1 ít bột magie kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt acid HCl đậm đặc vào ống nghiệm Để yên một vài phút (có thể đun cách thủy)

Quan sát thấy dung dịch không chuyển từ vàng sang đỏ ở mẫu 1(phản ứng âm tính), dung dịch chuyển từ màu xanh ánh xanh sang xanh ánh đỏ ở mẫu 2 (phản ứng dương tính)

 Phản ứng với kiềm:

+ Phản ứng với hơi amoniac đặc: Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên 2 vị trí của tờ giấy lọc Để khô, quan sát dưới ánh sáng thường, sau đó hơ một vết lên miệng lọ ammoniac đặc Thấy màu vàng vết hơ trên ammoniac đặc của mẫu 1 không đậm lên

(phản ứng âm tính), màu xanh vết hơ trên ammoniac đặc của mẫu 2 đậm lên (phản ứng dương tính)

+ Phản ứng với NaOH: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Quan sát thấy xuất hiện tủa ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính)

 Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%:

Cho 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều Quan sát thấy: màu dịch lọc đều chuyển thành xanh đen ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính)

Nhận xét: Sơ bộ kết luận vỏ thân Ba chạc không có flavonoid, lá và cành non cây

Ba chạc có flavonoid

 Định tính Coumarin

Cân khoảng 5g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml EtOH 90%, đun cách thủy trong 10 phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng sau:

 Phản ứng mở đóng vòng lacton:

Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch lọc Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên Đun cách thủy cả 2 ống đến sôi, để nguội và quan sát

Thêm từ từ 2ml nước cất vào cả 2 ống nghiệm Lắc đều, quan sát

Acid hóa ống 1 bằng vài giọt acid HCl đặc, quan sát

Kết quả:

+ Mẫu 1: ống 1 có tủa vàng khi kiềm hóa và đun sôi, thêm nước thì tủa tan, acid hóa lại có tủa trắng đục; ống 2 có tủa trắng đục khi thêm nước (phản ứng dương tính)

+ Mẫu 2: ống 1 xuất hiện tủa sau khi kiềm hóa, thêm nước tủa tan và acid hóa thì dung dịch trong suốt; ống 2 dung dịch trong suốt (phản ứng âm tính)