3.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học
Tiến hành song song các phản ứng hóa học định tính hai mẫu dược liệu riêng biệt: vỏ thân Ba chạc (mẫu 1); lá và cành non Ba chạc (mẫu 2).
Định tính Alcaloid
Chiết xuất: Cân khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml dung dịch H2SO4 1N, đun đến sôi, để nguội. Lọc lấy dịch lọc vào một bình gạn dung tích 125ml. Kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch ammoniac đặc (khoảng 6ml) đến phản ứng kiềm (thử bằng giấy quỳ). Sau đó lắc chiết với
chloroform 3 lần, mỗi lần 5ml, gạn lấy lớp chloroform. Gộp dịch chiết chloroform, chia đều vào hai ống nghiệm lớn, sau đó bốc hơi cách thủy đến khô thu được cắn. Ống 1: thêm vào 6ml dung dịch H2SO4 1N hòa tan cắn dùng để làm phản ứng định tính. Ống 2: dùng để định tính bằng SKLM.
Làm phản ứng định tính: Cho dịch chiết ở ống 1 vào 3 ống nghiệm nhỏ ( ống 4, 5, 6), mỗi ống 1ml để làm các phản ứng định tính:
- Ống 4: cho vào 2-3 giọt thuốc thử Mayer, thấy xuất hiện kết tủa trắng ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
- Ống 5: cho vào 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff, thấy xuất hiện tủa màu đỏ cam ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
- Ống 6: cho vào 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat, thấy xuất hiện kết tủa màu nâu ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
Để các ống nghiệm qua đêm, hôm sau thấy lượng tủa nhiều hơn.
Nhận xét: Sơ bộ kết luận vỏ thân, lá và cành non của cây Ba chạc đều có alcaloid.
Định tính Flavonoid
Cân khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml EtOH 90%, đun cách thủy 15 phút, lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp. Dịch lọc được dùng làm các phản ứng :
Phản ứng Cyanidin:
Cho 2ml dịch lọc vào 1 ống nghiệm, thêm 1 ít bột magie kim loại rồi nhỏ từ từ vài giọt acid HCl đậm đặc vào ống nghiệm. Để yên một vài phút (có thể đun cách thủy).
Quan sát thấy dung dịch không chuyển từ vàng sang đỏ ở mẫu 1(phản ứng âm tính), dung dịch chuyển từ màu xanh ánh xanh sang xanh ánh đỏ ở mẫu 2 (phản ứng dương tính).
Phản ứng với kiềm:
+ Phản ứng với hơi amoniac đặc: Nhỏ 2 giọt dịch chiết lên 2 vị trí của tờ giấy lọc. Để khô, quan sát dưới ánh sáng thường, sau đó hơ một vết lên miệng lọ ammoniac đặc. Thấy màu vàng vết hơ trên ammoniac đặc của mẫu 1 không đậm lên
(phản ứng âm tính), màu xanh vết hơ trên ammoniac đặc của mẫu 2 đậm lên (phản ứng dương tính).
+ Phản ứng với NaOH: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch lọc, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%. Quan sát thấy xuất hiện tủa ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%:
Cho 1ml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều. Quan sát thấy: màu dịch lọc đều chuyển thành xanh đen ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Sơ bộ kết luận vỏ thân Ba chạc không có flavonoid, lá và cành non cây Ba chạc có flavonoid.
Định tính Coumarin
Cân khoảng 5g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml EtOH 90%, đun cách thủy trong 10 phút, lọc nóng qua giấy lọc. Dịch lọc thu được dùng làm các phản ứng sau:
Phản ứng mở đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1ml dịch lọc. Ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên. Đun cách thủy cả 2 ống đến sôi, để nguội và quan sát.
Thêm từ từ 2ml nước cất vào cả 2 ống nghiệm. Lắc đều, quan sát. Acid hóa ống 1 bằng vài giọt acid HCl đặc, quan sát.
Kết quả:
+ Mẫu 1: ống 1 có tủa vàng khi kiềm hóa và đun sôi, thêm nước thì tủa tan, acid hóa lại có tủa trắng đục; ống 2 có tủa trắng đục khi thêm nước (phản ứng dương tính).
+ Mẫu 2: ống 1 xuất hiện tủa sau khi kiềm hóa, thêm nước tủa tan và acid hóa thì dung dịch trong suốt; ống 2 dung dịch trong suốt (phản ứng âm tính).
Phản ứng diazo hóa:
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch lọc, thêm vào 2ml dung dịch NaOH 10%, đun cách thủy đến sôi, để nguội. Nhỏ vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều.
Quan sát thấy: Dịch chiết vỏ thân cho phản ứng xuất hiện màu đỏ (phản ứng dương tính). Dịch chiết lá, cành non chuyển từ xanh ánh xanh sang xanh ánh đỏ (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Sơ bộ kết luận vỏ thân cây Ba chạc có coumarin, lá và cành non cây Ba chạc không có coumarin.
Định tính Anthranoid
Phản ứng Borntraeger:
Cân khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml dung dịch H2SO4 1N, đun sôi cách thủy trong 15 phút. Để nguội, lọc lấy dịch lọc vào bình gạn dung tích 60ml qua giấy lọc gấp nếp. Lắc chiết với 5ml chloroform. Gạn lấy lớp chloroform để làm phản ứng.
Lấy 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1ml NH4OH 10%, lắc đều không xuất hiện màu hồng ở lớp nước phía trên. Tiếp tục thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% vào, lắc nhẹ, không thấy lớp nước có màu hồng ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng âm tính).
Vi thăng hoa:
Đặt một ít bột dược liệu vào một nắp nhôm. Hơ nhẹ trên nguồn nhiệt 1-2 phút. Đặt lên miệng nắp nhôm một lam kính, trên lam kính có để một miếng bông tẩm nước lạnh.Tiếp tục đốt nắp nhôm trên nguồn nhiệt. Sau 5-10 phút lấy lam kính ra để nguội rồi soi dưới kính hiển vi.
Quan sát dưới kính hiển vi không thấy có các tinh thể hình kim ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng âm tính).
Định tính Saponin
Quan sát hiện tượng tạo bọt:
Cho vào ống nghiệm to 3g bột dược liệu, thêm 20ml nước cất. Đun cách thủy sôi nhẹ, lọc nóng, thu được dịch lọc. Lấy 5ml dịch lọc cho vào ống nghiệm to (phần dịch lọc còn lại để làm phản ứng xác định loại saponin nếu có), thêm 5ml nước cất, lắc mạnh ống theo chiều dọc trong 5 phút. Để yên.
Quan sát thấy trong ống nghiệm có cột bọt xuất hiện và bền vững sau 15 phút ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
Phản ứng Salkowski:
Cho vào ống nghiệm to 2g bột dược liệu, thêm vào 10ml EtOH 90%, đun sôi cách thủy, lọc lấy dịch lọc. Lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm sạch. Để ống nghiêng 450, cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml acid H2SO4 đặc, không làm xáo trộn chất lỏng trong ống.
Quan sát ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu nâu đỏ ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
Xác định loại saponin:
Lấy 2 ống nghiệm giống nhau dung tích 20ml, ống 1 cho 5ml NaOH 0,1N vào, ống 2 cho 5ml HCl 0,1N. Cho vào mỗi ống 2-3 giọt dịch chiết nước (dịch lọc ở mục tạo bọt). Lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 3 phút. Để yên.
Quan sát thấy: ống 1 có cột bọt cao hơn và bền vững sau 15 phút ở cả 2 mẫu định tính.
Nhận xét: Sơ bộ kết luận vỏ thân, lá và cành non của cây Ba chạc đều có saponin steroid.
Định tính Glycosid tim
Chiết xuất: Cân khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón có nút mài dung tích 100ml, thêm 50ml ethanol 25%, lắc đều, ngâm 24h. Gạn lấy dịch chiết vào một cốc có mỏ dung tích 100ml . Thêm khoảng 3ml chì acetat 30%, khuấy đều, lọc qua giấy lọc gấp nếp vào một cốc có mỏ dung tích 100ml. Nhỏ vài giọt dịch lọc đầu tiên vào một ống nghiệm, thêm 1 giọt chì acetat. Nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm 1ml
chì acetat 30% vào dịch chiết, khuấy đều, lọc lại. Tiếp tục thử đến khi dịch chiết không còn tủa với chì acetat. Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn dung tích 100ml. Lắc kỹ 2 lần với chloroform, mỗi lần 8ml. Gạn lấy lớp chloroform vào một cốc có mỏ đã rửa sạch, sấy khô. Gộp các dịch chiết chloroform lại, loại nước bằng natrisulfat khan. Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm đã được sấy khô. Đặt các ống nghiệm vào nồi cách thủy bốc hơi đến cắn. Cắn thu được đem tiến hành làm các phản ứng định tính:
Phản ứng Liebermann – Burchardt:
Cho vào ống nghiệm chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc cho cắn tan hết. Đặt nghiêng ống nghiệm một góc 450. Thêm từ từ 1ml acid H2SO4 đặc theo thành ống để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành 2 lớp.
Quan sát mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng không thấy xuất hiện vòng tím đỏ ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng âm tính).
Phản ứng Baljet:
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc cho cắn tan hết. Thêm từng giọt thuốc thử Baljet mới pha (gồm 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%).
Quan sát không thấy xuất hiện màu đỏ cam ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng âm tính).
Phản ứng Legal:
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml EtOH 90%, lắc cho cắn tan hết. Thêm 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 1% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc đều.
Quan sát không thấy xuất hiện màu đỏ cam ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng âm tính).
Phản ứng Keller- Kiliani:
Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, lắc cho cắn tan hết. Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% pha trong acid acetic. Lắc đều. Nghiêng ống 450. Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống.
Quan sát mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng không thấy xuất hiện vòng tím đỏ ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Vỏ thân, lá và cành non của cây Ba chạc không chứa glycosid tim.
Định tính Tannin
Cân khoảng 5g bột dược liệu, cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 30ml nước cất, đun sôi trong 5 phút. Để nguội, lọc lấy dịch lọc qua giấy lọc gấp nếp. Lấy 3 ống nghiệm nhỏ, cho vào mỗi ống 2ml dịch lọc để làm các phản ứng sau:
+ Ống 1: thêm 2 giọt FeCl3 5%. Quan sát thấy xuất hiện tủa màu xanh đen ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
+ Ống 2: thêm vài giọt chì acetat 10%. Quan sát thấy xuất hiện tủa bông ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
+ Ống 3: thêm vài giọt gelatin 1% mới pha. Quan sát thấy xuất hiện tủa bông trắng ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Sơ bộ kết luận cả vỏ thân, lá và cành non của cây Ba chạc đều có tanin.
Định tính chất béo, Sterol, Caroten
Cho 10g bột dược liệu vào bình nón có nút mài dung tích 100ml, thêm ether dầu hỏa đến ngập dược liệu, ngâm qua đêm. Lọc lấy dịch chiết để làm các phản ứng sau:
Phản ứng định tính chất béo:
Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ nóng cho bay hết dung môi.
Quan sát thấy có vết mờ trên giấy lọc ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Vỏ thân, lá và cành non cây Ba chạc đều có chất béo.
Phản ứng định tính Sterol: phản ứng Liebermann – Burchardt
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết ether dầu hỏa. Bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn. Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydride acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn. Nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ 1ml acid H2SO4 đặc theo thành ống nghiệm.
Quan sát thấy ở mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng: có màu tím đỏ đối với mẫu 1, có màu xanh tím đối với mẫu 2 (phản ứng dương tính).
Phản ứng định tính Caroten:
Lấy 5ml dịch chiết ether dầu hỏa cho vào ống nghiệm, bốc hơi trên nồi cách thủy đến khô. Thêm vào ống nghiệm 2-3 giọt acid H2SO4 đặc, lắc đều.
Quan sát dịch lỏng không có màu xanh ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Vỏ thân, lá và cành non cây Ba chạc đều không có Caroten.
Định tính acid amin, acid hữu cơ, đường khử, polysaccarid
Cân khoảng 5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml, thêm 40ml nước cất. Đun sôi cách thủy 10 phút. Lọc qua giấy lọc thu lấy dịch lọc làm các phản ứng định tính sau:
Phản ứng định tính acid amin:
Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun sôi cách thủy 10 phút.
Quan sát thấy dung dịch chuyển sang màu tím đối với cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Vỏ thân, lá và cành non cây Ba chạc đều có acid amin.
Phản ứng định tính acid hữu cơ:
Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm.Thêm vào ống nghiệm 1 ít tinh thể Na2CO3.
Quan sát thấy có bọt khí nổi lên ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
Nhận xét: Vỏ thân, lá và cành non cây Ba chạc đều có acid hữu cơ.
Phản ứng định tính đường khử:
Thêm 1ml thuốc thử Fehling A và 1ml thuốc thử Fehling B vào ống nghiệm chứa 2ml dịch lọc. Đun cách thủy sôi 10 phút.
Quan sát thấy xuất hiện tủa đỏ gạch ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng dương tính).
Phản ứng định tính polysaccarid:
+ Ống nghiệm 1: 4ml dịch lọc + 5 giọt dung dịch Lugol. + Ống nghiệm 2: 4ml nước cất + 5 giọt dung dịch Lugol.
Quan sát thấy: ống 1 đậm màu hơn ống 2 ở cả 2 mẫu định tính (phản ứng âm tính).
Nhận xét: Vỏ thân, lá và cành non cây Ba chạc đều không có polysaccarid.
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ có trong 2 mẫu dược liệu: mẫu 1 là vỏ thân cây Ba chạc, mẫu 2 là lá và cành non cây Ba chạc được trình bày tóm tắt ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong các mẫu dược liệu.
STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Kết luận Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 1 Mẫu 2 1 Alcaloid
Pư. với TT Mayer ++ ++
Có Có
Pư. với TT Dragendorff ++ ++ Pư. với TT Bouchardat ++ ++
2 Flavonoid
Pư. Cyanidin - ++
Không
có Có
Pư. với kiềm -/+ ++
Pư. với dd FeCl3 5% + ++
3 Coumarin
Pư. mở đóng vòng
lacton +++ - Có Không
có
Pư. diazo hóa ++ -
4 Anthranoid Pư. Borntraeger - - Không có
Không có
Vi thăng hoa - -
5 Saponin
Hiện tượng tạo bọt +++ ++
Có Có
Pư. Salkowski +++ ++ Xác định loại Saponin S. Steroid
6 Glycosid tim Pư. Liebermann- Burchardt - - Không có Không có Pư. Baljet - - Pư. Legal - - Pư. Keller-Kiliani - - 7 Tanin
Pư. với dd FeCl3 5% ++ +++
Có Có
Pư. với chì acetat 10% +++ +++ Pư. với dd gelatin 1% +++ ++
8 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc ++ +++ Có Có
9 Sterol Pư. Liebermann-
Burchardt ++ ++ Có Có
10 Caroten Pư. với dd H2SO4 đặc - - Không có
Không có
11 Acid amin Pư. với TT Ninhydrin
nồng độ 3% +++ +++ Có Có
12 Acid hữu cơ Pư. với Na2CO3 ++ + Có Có 13 Đường khử Pư. với TT Fehling + ++ Có Có 14 Polysaccarid Pư. với TT Lugol - - Không
có Không có Ghi chú: +++ : Rất rõ ++ : Rõ + : Mờ - : Âm tính
3.2.2. Định tính alcaloid toàn phần bằng SKLM
- Chuẩn bị bản mỏng: Bản mỏng silicagel GF254 của hãng Merck, hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ.
- Chuẩn bị dịch chấm sắc ký: Hòa tan cắn 2 mẫu định tính đã chuẩn bị ở mục định tính alcaloid (trong mục 3.2.1) bằng 1ml chloroform để chấm sắc ký.
- Dung môi khai triển: Tiến hành khảo sát trên một số hệ dung môi. Nhận thấy hệ dung môi chloroform – aceton – acid formic (9 : 2,75 : 1,5) tách tốt hơn cả. Khai triển sắc ký với hệ dung môi này.
- Sau khi triển khai sắc ký, thu được hình ảnh sắc ký đồ như hình 3.6.
Hình 3.6. Sắc ký đồ cắn alcaloid toàn phần 2 mẫu dược liệu tại UV366 (a), UV254 (b) và sau khi phun thuốc thử Dragendorff (c).
Nhận xét: Sắc ký đồ dịch chiết chloroform thể hiện sự có mặt của nhiều vết chất .