Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hạt vải (semen litchi)

ĐẶT VẤN ĐỀ Giảo cổ lam là một dược liệu quý, được phát hiện và sử dụng lần đầu ở Nhật Bản với tên gọi cây trường sinh. Năm 1997, GS. TS. Phạm Thanh Kỳ đã phát hiện ra Giảo cổ lam tại Lào Cai – Việt Nam. Thành phần hóa học chính của Giảo cổ lam có saponin, flavonoid và các loại đường 2, 5. Các đặc tính dược lý của Giảo cổ lam hầu hết đều thuộc về saponin, thành phần này đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc 36. GCL được biết đến với rất nhiều tác dụng quý như tác dụng hạ lipid 20, 39, hạ đường huyết 36, ức chế khối u 21, 36, tác dụng tốt trên tim mạch và hệ thần kinh 12, 36…Do vậy, GCL hỗ trợ tốt trong các trường hợp mỡ máu cao, huyết áp cao, đái tháo đường tuýp II… Tuy nhiên, nguồn gốc và thành phần hóa học của GCL khá phức tạp. Saponin trong GCL khác nhau giữa các loài và vùng trồng, thay đổi theo điều kiện thời tiết khí hậu 18. Hơn nữa, hiện chưa xác định được saponin có tác dụng dược lý đặc trưng do vậy việc kiểm soát chất lượng của dược liệu gặp nhiều khó khăn. Các loại kỹ thuật dấu vân tay Fingerprint đã dần dần đi vào thực tế bằng việc xây dựng mô hình sắc ký của các thành phần có hoạt tính dược lý và các đặc tính hóa học của thảo dược. Phương pháp này góp phần xác thực loài, đánh giá chất lượng và đảm bảo sự thống nhất và ổn định, giúp kiểm soát chất lượng thảo dược và các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược. Đây là một xu hướng trong định tính dược liệu và các chế phẩm đông dược. Nhằm hoàn thiện tiêu chuẩn dược liệu Giảo cổ lam, giúp lựa chọn nguồn nguyên liệu ổn định và chất lượng, khóa luận “Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC” đươc thực hiện với 2 mục tiêu sau:

hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn DS Phạm Thị Anh đã hướng dẫn, đóng góp, truyền

đạt những kinh nghiệm quý báu để khóa luận được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược

học cổ truyền, trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ trong suốt thời

gian thực hiện khóa luận

Xin cảm ơn chân thành tới các anh chị khoa Hóa phân tích, Dược lý- Viện

Dược Liệu đã giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian qua

hân d p này t i c ng in gửi ời cảm ơn đ n n giám hiệu c ng toàn thể các thầy c giáo trường ại học ược à i đã dạy dỗ và tạo mọi điều iện thuận ợi cho

t i trong thời gi n t i học tập tại trường

à cuối c ng à ời cảm ơn t i gửi tới gi đình và bạn b đã đ ng vi n, giúp đỡ

t i trong suốt thời gi n thực hiện hó uận

o thời gi n àm thực nghiệm c ng như i n th c c bản thân c n nhiều hạn

ch , hó uận này c n có nhiều thi u sót i rất mong nhận được sự góp ý c các thầy c , bạn b để hó uận được hoàn thiện hơn

i in chân thành cảm ơn

Hà N i ngày 20 tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Hồ Thanh Nga

1.1 THỰC VẬT HỌC 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.1.1 Đặc điểm thực vật của họ Bồ hòn (Sapindaceae) 2

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Litchi Sonn 3

1.1.1.3 Đặc điểm thực vật của cây vải Litchi chinensis Sonn 3

1.1.2 Phân bố của cây vải Litchi chinensis Sonn 3

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 4

1.2.1 Thành phần hóa học 4

1.2.2 Tác dụng sinh học trong y học cổ truyền 4

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HẠT VẢI HIỆN NAY 5

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 5

1.3.1.1 Thành phần hóa học 5

1.3.1.2 Tác dụng sinh học 6

1.4.1.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 7

1.4.1.1 Tác dụng hạ đường huyết 7

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9

2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 9

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 9

2.1.2 Trang thiết bị 9

2.1.3 Hóa chất, dung môi 10

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 10

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học 10

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 10

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học 11

2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học 11

2.3.3.1 Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải 11

2.3.3.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt vải 12

2.3.4 Nghiên cứu tác dụng sinh học 14

2.3.4.1 Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH 14

2.3.4.2 Thử nghiệm dọn gốc tự do superoxid 15

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 17

3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VI HỌC 17

3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC 18

3.2.1 Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải 18

3.2.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt Vải 25

3.2.2.1 Xác định độ ẩm 25

3.2.2.2 Chiết xuất 25

3.2.2.3 Định lượng các phân đoạn bằng phương pháp cân 26

3.2.2.4 Định tính các phân đoạn 27

3.3 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG SINH HỌC 32

3.3.1 Chuẩn bị cao ethanol toàn phần 32

3.3.2.Thử nghiệm dọn gốc DPPH 32

3.3.2.1 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm 32

3.3.2.2 Chuẩn bị dung dịch DPPH 32

3.3.2.3 Tiến hành 32

3.3.3 Thử nghiệm dọn gốc superoxid 34

3.3.3.1 Chuẩn bị mẫu thí nghiệm 34

3.3.3.3 Tiến hành 34

3.4 BÀN LUẬN 36

3.4.1 Đặc điểm vi học 36

BuOH n- butanol

Bảng 3.2 Kết quả xác định độ ẩm hạt Vải 25

Bảng 3.3 Kết quả định lượng các phân đoạn 27

Bảng 3.4 Kết quả định tính cắn các phân đoạn bằng phản ứng hóa học 28

Bảng 3.5 Bảng giá trị Rf của các vết ở phân đoạn n-hexan 30

Bảng 3.6 Bảng giá trị Rf tương ứng của các vết ở phân đoạn ethyl acetat 31

Bảng 3.7 Bảng giá trị Rf tương ứng của các vết ở phân đoạn n-butanol 32

Bảng 3.8 Hỗn hợp phản ứng 33

Bảng 3.9 Kết quả hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của dịch chiết hạt Vải, quercetin 33

Bảng 3.10 Hỗn hợp phản ứng 35

Bảng 3.11 Kết quả hoạt tính dọn gốc tự do superoxid của dịch chiết hạt Vải và superoxid dismutase 35

Hình 2.1 Hình ảnh hạt Vải 9

Hình 3.1 Ảnh chụp các đặc điểm bột hạt Vải dưới kính hiển vi 17

Hình 3.2 Tinh thể hình kim 21

Hình 3.3.Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn dịch chiết hạt Vải 26

Hình 3.4 Sắc ký đồ của phân đoạn n-hexan 29

Hình 3.5 Sắc ký đồ của phân đoạn ethyl acetat 30

Hình 3.6 Sắc ký đồ của phân đoạn n-butanol 31

Hình 3.7 Biểu đồ hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của dịch chiết hạt Vải và quercetin 34 Hình 3.8: Biểu đồ hoạt tính dọn gốc tự do superoxid của dịch chiết hạt vải (A) và superoxid dismutase (B) 36

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các nhà khoa học đã chứng minh sự có mặt của gốc tự do trong hệ thống sinh học [23] Các gốc tự do sinh ra trong cơ thể gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng như gây ra các bệnh: ung thư, bệnh tim mạch, tiểu đường, các bệnh thoái hóa thần kinh, viêm khớp dạng thấp, lão hóa [25], [32], [43] Chính vì vậy, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát hiện các chất có khả năng phân hủy, loại bỏ các gốc tự do, chúng được gọi là các chất chống oxy hóa như: các enzym (superoxid dismutase, glutathione peroxidase, catalase…), acid ascorbic, α-tocopherol, glutathione, carotenoid, flavonid,…

Theo hướng nghiên cứu đó, hiện nay đã có nhiều công bố về tác dụng chống ung thư, chống oxy hóa, tác dụng hạ đường huyết [39], [41] của dược liệu hạt

Vải (Semen Litchi) Trong y học cổ truyền Việt Nam, hạt Vải đã được sử dụng để

điều trị nhiều chứng bệnh như: chữa đau dạ dày, chữa răng sưng đau có sâu…Tuy nhiên, các đề tài nghiên cứu về dược liệu hạt Vải ở Việt Nam còn hạn chế Để góp phần tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc của Việt Nam, chúng tôi

thực hiện đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hạt

Vải ( Semen Litchi ) với 2 mục tiêu:

1 Nghiên cứu thành phần hóa học hạt Vải (Semen Litchi)

2 Khảo sát tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết toàn phần hạt Vải trên

in vitro

Phân lớp hoa hồng (Rosidae)

Liên bộ cam (Rutanae)

Bộ bồ hòn (Sapindales)

Họ bồ hòn (Sapindaceae)

Chi Litchi Sonn

1.1.1.1 Đặc điểm thực vật của họ Bồ hòn (Sapindaceae)

Cây gỗ hoặc cây bụi Lá thường kép lông chim, mọc so le hoặc lá kép hình chân vịt, hiếm khi là lá đơn Phần lớn không có lá kèm Lá chét mọc so le hoặc mọc đối [1], [2], [20] Mép lá có răng cưa hoặc nếp cuộn Hoa nhỏ, tập hợp thành cụm hoa hình chùy, mọc ở kẽ lá bắc Hoa đơn tính, hiếm khi lưỡng tính, đối xứng hai bên hoặc đối xứng tỏa tròn Đài hoa 4, 5 hoặc 6, kích thước đồng đều hoặc không đồng đều, dính liền hoặc tách rời Tràng 4, 5 hoặc 6, tách rời hoặc dính liền nhau, mặt trong cánh hoa thường có những vẩy hoặc chùm lông, dính với đĩa mật, đôi khi hoa không có cánh Đĩa mật hình vòng khuyên, ở bên ngoài vòng nhị Nhị hoa 5-10 thường là 8, dính vào đế hoa, nhị thò ra ngoài, tách rời hoặc dính liền, bao phấn đính liền nứt dọc Bộ nhụy 1, 3 hoặc 4 lá noãn, mỗi lá noãn chứa 1, 2 hoặc một số noãn, kiểu đính noãn trung trụ; bầu có 1-4 ô, chỉ có một ô phát triển Quả nang chia ngăn hoặc quả mọng hoặc quả hạch Hạt có 1, 2 hoặc nhiều hơn tách rời nhau, vỏ ngoài hạt màu đen hoặc nâu, phôi cong uốn nếp, không có nội nhũ 2n = 20 - 36, giàu tinh bột, lipid, có hoặc không có áo hạt [20]

Họ Bồ hòn (Sapindacae) có 135 chi, 1500 loài phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt ở nhiệt đới Đông Nam Á [20] Ở Việt Nam có

70 loài, thuộc 25 chi: Allophylus, Amesiodendron, Aryteta, Blighia, Cardiospermum, Delavaya, Dimocarpus, Dodonaea, Glennila, Guioa, Hurpullia, Koelreuteria, Lepisanthes, Litchi, Mischocarpus, Nephelium, Paranephelium, Pavieasia, Pometia, Sapindus, Scheleichera, Sinoradlkofera, Sisyrolepis, Xerospermum, Zollingerio [1] 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Litchi Sonn

Cây gỗ Lá kép lông chim mọc so le Cụm hoa hình chùy Hoa đơn tính cùng gốc, mọc ở kẽ lá bắc, đối xứng tỏa tròn Đài 4-5 thùy, mở nắp, không có cánh hoa Nhị 6-8 có lông, chỉ nhị thò ra ngoài Bộ nhụy có 2- 3 lá noãn, mỗi lá noãn chứa 1 noãn, bầu nhụy hình tim ngược Quả đơn có áo hạt hình trứng hoặc gần hình cầu, vỏ quả mỏng, có vết rạn, đôi khi gần như trơn Hạt hình trứng, vỏ hạt màu nâu, phôi

thẳng 2n = 28 hoặc 30 [20] Chi Litchi Sonn chỉ có một loài trên thế giới là Litchi chinensis Sonn [20], [12], với 3 loài phụ [8]:

- ssp chinensis : Được trồng nhiều ở Việt Nam và Nam Trung Quốc

- ssp philippinensis: Mọc hoang dại ở Philippin

- ssp javensis: Chỉ mới thấy trồng ở phía tây đảo Java (Indonesia) và Nam

Đông Dương (Campuchia và Nam Việt Nam) [12]

1.1.1.3 Đặc điểm thực vật của cây vải Litchi chinensis Sonn

Cây nhỡ hoặc cây to, cao khoảng 8-15 m, vỏ màu xám đen Cành tròn, vỏ màu nâu sẫm, tán lá rộng Lá kép lông chim, mọc so le, cuống lá dài 10-15 cm Lá chét dày 2, 3, hoặc 4 cặp, cuống lá chét dài 7-8 mm, phiến lá hình mũi mác hoặc hình trứng mác, gốc tròn, đầu nhọn [20] Hoa xếp thành hình chùy ở ngọn cành, 5 lá đài đính nhau, có lông [12], [14], [20] Hoa không có tràng Nhị 6-7 đôi khi là 8, dài 4mm [20] Bộ nhụy có 2 lá noãn, mỗi lá chứa 1 noãn, bầu 2 ô [8], nhụy có lông [20] Quả màu đỏ nâu, hình cầu hoặc gần hình cầu Hạt màu nâu, hình cầu [20] Mùa hoa: tháng 3-4, mùa quả: tháng 5-6 [20]

1.1.2 Phân bố của cây vải Litchi chinensis Sonn

Bản địa: Trung Quốc, Malaysia, Việt Nam

Di thực: Úc, Brazil, Honduras, Hong Kong, Ấn Độ, Israel, Madagascar, Mauritius, Mexico, Myanmar, New Zealand, Reunion, Bắc Châu Phi, Đài Loan, Tỉnh thuộc Trung Quốc, Thái Lan, Zanzibar [34]

Hình 1.1 Bản đồ phân bố cây Vải (Litchi chinensis) trên thế giới

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC

1.2.1 Thành phần hóa học

Hạt Vải (lệ chi hạch) chứa tanin, chất béo, saponosid, α- metylen cyclopropyglycin [8], [12], [14]

1.2.2 Tác dụng sinh học trong y học cổ truyền

Theo y học cổ truyền, hạt Vải có vị ngọt chát, tính ôn, quy kinh can thận, có tác dụng ôn trung lý khí, chỉ thống [8], [12], [14] Công dụng chữa đau dạ dày, thoát

vị bẹn, đau kinh, tinh hoàn sưng đau Liều dùng 3-6g/ ngày, thường dùng phối hợp với trần bì, mộc hương [14]

Một số bài thuốc có hạt Vải:

Bài 1: Bài thuốc chữa tinh hoàn sưng đau [12], [14]

Cách dùng: dùng rượu chiêu thuốc, lúc nào đau uống 9 viên

Bài 2: Bài thuốc chữa đau bụng kinh hoặc sau khi đẻ [8]

Cách dùng: Uống với nước, ngày 3 thang

Bài 4: Bài thuốc chữa răng sưng đau có sâu [8]

Hạt vải sấy khô, tán bột, xát vào răng bị đau nhiều lần trong ngày

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HẠT VẢI HIỆN NAY

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

1.3.1.1 Thành phần hóa học

Từ dịch chiết ethanol 95%, đã phân lập 7 flavonoid glycoside: Litchioside D,

pinocembrin 7-O-neohesperidoside, pinocembrin 7-O-rutinoside , taxifolin

40-O-β-D-glucopyranoside , kaempferol 7-O-neohesperidoside, tamarixetin 3-O-rutinoside, phlorizin [42] và 4 chất sesquiterpene glucosides: Litchiosides A, litchiosides B, pumilaside A, funingensin A [41] Một nghiên cứu khác phân lập được một số

anthocyanidin: 2α,epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-(4β-8-catechin); 2α, epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-(4β-8-epicatechin); 2β,3β-epoxy-5,7,30,40-tetra- hydroxyflavan-(4α-8-epicatechin) và một số acid hữu cơ: 2,5-dihydroxy-hexanoic

3α-acid; coumaric acid, protocatechui acid [30]

Từ dịch chiết ethanol 50% của hạt vải, đã phân lập 5 hợp chất phenolic: gallic acid, procyanidin B2, α-gallocatechin , α-epicatechin, α-epicatechin-3-gallate [27]

1.3.1.2 Tác dụng sinh học

Tác dụng chống oxy hóa

Từ dịch chiết ethanol 95% của hạt Vải, đã phân lập được một số

anthocyanidin, sau đó thử tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH, TEAC Kết quả cho thấy 3 chất: 2α,3α-epoxy-5,7,30,40- tetrahydroxyflavan-(4β-8-catechin); 2α, 3α-epoxy-5,7,30,40-tetrahydroxyflavan-(4β-8- epicatechin); 2β,3β-epoxy-5,7,30,40-tetra-hydroxyflavan-(4α-8-epicatechin) có tác

dụng chống oxy hóa ở mức độ trung bình [30]

Một nghiên cứu khác thử tác dụng chống oxy hóa trên in vitro với thử nghiệm

dọn gốc tự do DPPH, ức chế lipid peroxydation, đối với các dịch chiết hạt Vải: ethanol 90%, ethanol 50%, methanol, methanol 50%, nước Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol 50% có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất [27]

Tác dụng chống ung thư

Từ dịch chiết ethanol 95% của hạt Vải, đã phân lập được: Litchioside D (1),

taxifolin-4-O-β-glucopyranoside (2), kaemferol 7-neohesperidoside (3), pulmilaside

A (4) Sau đó thử tác dụng gây độc trên in vitro đối với các dòng tế bào A549, LAC,

Hep-G2, HeLa bằng thử nghiệm đo màu MTT ở bước sóng 570nm, chất đối chiếu admycin Kết quả cho thấy chất (1), (2), (3), (4) đều có tác dụng ức chế các dòng tế bào thử nghiệm [41], [42]

Tác dụng hạ đường huyết

Từ dịch chiết ethanol 50% của hạt Vải, chiết phân đoạn với chloroform, butanol; phần n-butanol chia thành 2 phần: phần tan trong nước (WS), phần không

n-tan trong nước (WI) Sau đó thử nghiệm tác dụng ức chế α-glucosidase trên in vitro

đối với dịch chiết ethanol 50%, các phân đoạn, phần WS, WI Kết quả cho thấy: dịch chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh, phân đoạn n-butanol có tác dụng mạnh nhất so với các phân đoạn, WI tác dụng mạnh hơn WS [39]

Từ dịch chiết ethanol 70% của hạt Vải, đã phân lập được α- (methylenecyclopropyl) glycine, sau đó thử tác dụng trên chuột thấy có tác dụng hạ đường huyết, giảm nồng độ glycogen ở gan [19]

Tác dụng ức chế tyrosinase

Thử nghiệm tác dụng ức chế tyrosinase trên in vitro đối với các dịch chiết từ hạt Vải: ethanol, ethanol 50%, methanol, methanol 50%, nước Kết quả cho thấy dịch chiết ethanol 50% có tác dụng mạnh nhất [27]

1.4.1.Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

1.4.1.1 Tác dụng hạ đường huyết

Từ cao chiết ethanol 50% của hạt Vải, thử tác dụng hạ đường huyết trên mô hình gây tăng đường huyết bằng alloxan ở chuột nhắt trắng với liều uống 1,5g và 3g

cao/ kg thể trọng/ ngày (tương đương với 10g và 20g dược liệu khô), trong 8 ngày liên tục, tác dụng hạ đường huyết ở liều 1,5g cao/ kg thể trọng/ ngày có tác dụng mạnh hơn [10]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Hạt của cây Vải Thiều (Hình 2.1) được thu hái ở Thanh Hà - Hải Dương vào tháng 5 - 6 năm 2012 Mẫu cây được TS Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật,

Trường Đại học Dược Hà Nội, giám định tên khoa học là: Litchi chinensis Sonn.,

Họ Bồ hòn (Sapindaceae) Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội Mã tiêu bản: HNIP/17853/13 (Phụ lục 1)

Dược liệu sau khi làm sạch, được phơi khô, bảo quản trong túi nilon kín để nơi khô ráo

Hình 2.1 Hình ảnh hạt Vải 2.1.2 Trang thiết bị

- Bếp cách thủy Memmert

- Cân phân tích Precisa, cân kỹ thuật Sartorius

- Tủ sấy Memmert, Shellab

- Máy cô quay chân không Buchi R – 200

- Hệ thống chấm mẫu Linomat 5, đèn soi tử ngoại 2 bước sóng 254 nm và 365

nm (CAMAG)

- Máy siêu âm Wise clean (Hàn Quốc)

- Máy li tâm PLC-012E

- Máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems (Đức)

- Kính hiển vi

- Máy chụp ảnh kỹ thuật số 10.0 mega pixels (Panasonic)

- Thuyền tán

- Các dụng cụ thông thường ở phòng thí nghiệm

2.1.3 Hóa chất, dung môi

 Hóa chất sử dụng cho chiết xuất, nghiên cứu hóa học

- Chloroform, ethanol, ethylacetat, n-hexan, n-butanol, methanol, aceton, toluen, acid formic, acid acetic, acid sulfuric,…được mua tại các công ty hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích

- Cồn 96% thực phẩm (Việt Nam)

- Bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 của hãng Merck

- Các hóa chất, thuốc thử dùng cho định tính sơ bộ thành phần hóa học được pha chế theo Dược Điển Việt Nam IV (các chuyên luận thuốc thử)

 Hóa chất sử dụng cho thử nghiệm sinh học

- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) của hãng Sigma (Mỹ)

- Quercetin của hãng Sigma (Mỹ)

- Superoxid dismutase của hãng Sigma (Mỹ)

- Phenazine methosufate (PMS)

- Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)

- Nitroblue tetrazolium (NBT)

- Các hóa chất thông thường khác đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học

Nghiên cứu đặc điểm bột hạt Vải

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

Định tính xác định các nhóm hợp chất trong hạt Vải

Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt Vải

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng sinh học

Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro của dịch chiết toàn phần hạt Vải

 Mẫu dƣợc liệu dùng để nghiên cứu đặc điểm vi học

Hạt Vải sấy ở 600C, để nguội, tán nhỏ bằng thuyền tán, rây qua rây số 125, phần trên rây được tán nhỏ và rây tiếp, lặp lại vài lần cho đến khi toàn bộ dược liệu thành bột mịn [4] Bột mịn được cho vào lọ, dán nhãn dùng để soi bột

 Mẫu dƣợc liệu dùng để nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh

học

Hạt Vải sấy ở 600C, để nguội, xay thành bột thô (1400/355), cho vào túi nilon bảo quản nơi khô ráo

2.3.2 Nghiên cứu đặc điểm vi học

Mỗi dược liệu có những mô học đặc trưng, được thể hiện một phần ở đặc điểm bột dược liệu Nghiên cứu vi học bằng cảm quan và kính hiển vi nhằm tìm ra một số đặc điểm đặc trưng nhằm định danh, xác định độ tinh khiết của dược liệu

- Quan sát cảm quan: Nhận định màu sắc, mùi, vị,

- Quan sát bằng kính hiển vi:

+ Quan sát mô tả đặc điểm điển hình (vỏ hạt, phôi, nội nhũ,…)

+ Chọn chất lỏng lên tiêu bản nhằm làm cho đối tượng nghiên cứu trở nên sáng hơn, rõ hơn [4], [13]

2.3.3 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.3.1 Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải

a Nguyên tắc

Chiết xuất: Sử dụng các quy trình chiết chuyên biệt dựa vào độ tan của các chất trong dung môi khác nhau để loại bỏ các yếu tố cản trở phản ứng, che lấp màu phản ứng, giúp nhận định kết quả [4], [9]

Phản ứng định tính:

- Chọn phản ứng đặc trưng thường là phản ứng màu, phản ứng kết tủa

- Chọn thuốc thử trong định tính nhóm hợp chất phải đặc hiệu, nhạy, dễ phát hiện [4], [9]

b Tiến hành

Định tính xác định một số nhóm hợp chất phổ biến: Alcaloid, glycosid tim, flavonoid, coumarin, anthranoid, saponin, tanin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử, polysaccharid, chất béo, sterol, caroten [3], [5], [6]

- Alcaloid: Phản ứng với thuốc thử Bouchardat, Dragendorff, Mayer

- Glycosid tim: Phản ứng Liberman - Burchardt, Keller - Kiliani, Baljet, Legal

- Flavonoid: Phản ứng Cyanidin, với kiềm, FeCl3 5%, thuốc thử diazo

- Coumarin: Phản ứng đóng mở vòng lacton, phản ứng với thuốc thử diazo

- Anthranoid: Phản ứng Borntrager, vi thăng hoa

- Saponin: Hiện tượng tạo bọt, phản ứng Salkowski

- Tanin: Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%, chì acetat 10%, gelatin 1%

- Acid hữu cơ: Phản ứng với natri carbonat

- Acid amin: Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin 3%

- Đường khử: Phản ứng với thuốc thử Felling

- Polysaccharid: Phản ứng với dung dịch Lugol

- Chất béo: Hiện tượng vết mờ trên giấy lọc

- Sterol: Phản ứng Liberman - Bouchardt

- Caroten: Phản ứng với acid sulfuric đặc

2.3.3.2 Phân tích sơ bộ thành phần hóa học hạt vải

a Nguyên tắc

Hạt Vải được chiết bằng dung môi hòa tan nhiều nhóm hợp chất nhất (methanol, ethanol 90%, ethanol 80%) thu được cao tổng Từ cao tổng, dựa vào độ

tan của các hợp chất trong dung môi có độ phân cực khác nhau: n-hexan, ethyl acetat, n-butanol Sau đó xác định các nhóm hợp chất bằng phản ứng đặc hiệu

 Định lượng các cắn phân đoạn bằng phương pháp cân

Cắn các phân đoạn đem sấy ở nhiệt độ 600C tới khối lượng không đổi Xác định hàm lượng cắn các phân đoạn bằng phương pháp cân

- Định tính các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng

Mẫu thử được chấm lên pha tĩnh là bản mỏng có tráng chất hấp phụ, sau đó pha động (dung môi khai triển) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử với vận tốc khác nhau tạo thành sắc ký đồ với Rf tương ứng (Dược điển Việt Nam IV- phụ lục 5.4) [7]

Pha tĩnh: Bản mỏng tráng sẵn silica gel 60 F254 của hãng Merck được hoạt hóa

ở nhiệt độ 1050C- 1100C trong 1 giờ

Pha động: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để tách tốt nhất Pha dung môi theo đúng tỷ lệ, lót giấy lọc bên trong thành bình, đổ hệ dung môi vào bình chạy sắc

ký sao cho bề mặt dung môi cách vết chấm 0,8 cm Bão hòa dung môi trong bình chạy sắc ký, đậy kín để yên trong 1 giờ

Chấm sắc ký: Hoà tan cắn trong methanol, chấm với 1 lượng dịch phù hợp Vết cách mép dưới bản mỏng 1,5 cm, cách bờ ít nhất 1cm

Triển khai sắc ký: Đặt bản mỏng trong bình sắc ký, đậy kín, để yên Khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng khoảng 2 cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi, để bay hơi dung môi trong tủ hốt

Phát hiện vết: Quan sát UV 254 nm và 366nm, sau đo dùng thuốc thử hiện màu

2.3.4 Nghiên cứu tác dụng sinh học

2.3.4.1 Thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH

Phương pháp được thực hiện theo Blois (1958) [36]

 Nguyên tắc của phương pháp

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do dùng để thực hiện phản ứng mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của hầu hết dược liệu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng λ= 517nm [15]

 Cơ chế dọn gốc tự do DPPH

Là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxy hóa bằng sự chuyển gốc tự do sang trạng thái ổn định Như vậy khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ khử gốc tự

do DPPH làm cho dung dịch giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ giảm [36]

 Tiến hành:

Mẫu thí nghiệm gồm: Cao hạt Vải toàn phần, Quercetin (chất đối chiếu) Hỗn hợp phản ứng:

90 μl DPPH 150 μM (pha trong methanol)

10 μl Mẫu thí nghiệm (pha trong methanol)

Để trong bóng tối 30 phút ở 30oC Sau đó đo giá trị mật độ quang (OD) bằng máy đọc ELISA của hãng Labsystems tại bước sóng 517nm

Mẫu thử: Mẫu thí nghiệm pha trong methanol + DPPH

Mẫu trắng: Mẫu thí nghiệm pha trong methanol

Mẫu chứng DPPH : DPPH pha trong methanol

1ml NBT 100 μM(pha trong đệm phosphat pH 7,4)

1ml NADH 468 μM (pha trong đệm phosphat pH 7,4)

Mẫu chứng: methanol+ hỗn hợp phản ứng chứa NBT, NADH, PMS

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VI HỌC

Bột mịn hạt Vải trộn đều trước khi lên tiêu bản

Dung dịch lên tiêu bản: glycerin 5% trong nước làm sáng tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dịch soi lên lam kính, cho 1 ít bột hạt Vải lên giọt dung dịch đó, dùng kim mũi mác dàn đều, sau đó đậy lamen Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính có độ phóng đại 40 lần, chụp ảnh, mô tả các đặc điểm

Kết quả:

Cảm quan: Bột màu nâu, mùi hắc, vị hơi chát đắng

Quan sát bằng kính hiển vi (Hình 3.1): Mảnh vỏ hạt màu nâu vàng là các tế bào có kích thước không đều nhau, hình đa giác có đỉnh tù (5) Mảnh mô mềm đặc chứa tinh bột (7) Tế bào mô cứng thành dày, có ống trao đổi rõ (4), thể cứng hình sao (3) Có nhiều hạt tinh bột hình tròn hoặc hình thuôn dài kích thước khác nhau, rốn phân nhánh, vân không rõ, đứng riêng lẻ hoặc kép đôi hoặc tụ lại thành đám (1) Mảnh mạch xoắn, mảnh mạch vòng (2) Tế bào chứa chất béo có hình tròn, to (6)

Hình 3.1 Ảnh chụp các đặc điểm bột hạt Vải dưới kính hiển vi

6 Tế bào chứa chất béo

7 Mảnh mô mềm chứa tinh bột

3.2 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

3.2.1 Định tính xác định nhóm hợp chất trong hạt Vải

 Định tính alcaloid

Cho 10 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch amoniac đặc, đậy bình kín trong 30 phút Cho thêm 20 ml chloroform, lắc đều ngâm trong 24 giờ Lọc lấy dịch chiết cho bình gạn Lắc dịch chiết chloroform với dung dịch acid sulfuric 1N 2 lần, mỗi lần 10 ml Để phân lớp, gạn lấy dịch chiết acid cho vào 3 ống nghiệm để làm phản ứng

- Ống 1: Cho 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa nâu đến đỏ nâu

- Ống 2: Cho 2-3 giọt Dragendorff Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa từ vàng cam đến đỏ

- Ống 3: cho 2-3 giọt thuốc thử Mayer Phản ứng dương tính khi xuất hiện tủa trắng đến vàng,

Kết quả: Cả 3 ống không có tủa

Sơ bộ kết luận: Hạt Vải không có alcaloid

 Định tính flavonoid

Lấy 5 g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 100ml có nút mài, thêm 20ml ethanol 90% Đun cách thủy 10 phút Lọc nóng qua giấy lọc gấp nếp Dùng dịch lọc để làm các phản ứng:

- Phản ứng Cyanidin