Nghiên cứu định tính và định lượng curcuminoid toàn phần và xác định kích thước của chế phẩm nano curcumin chế tạo bằng phương pháp sol gel

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG CURCUMINOID TOÀN PHẦN VÀ XÁC ĐỊNH KÍCH THƯỚC CỦA CHẾ PHẨM NANO CURCUMIN CHẾ TẠO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SOL-GEL KH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG CURCUMINOID TOÀN PHẦN

VÀ XÁC ĐỊNH KÍCH THƯỚC CỦA CHẾ PHẨM NANO CURCUMIN CHẾ TẠO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SOL-GEL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2015

PHẠM THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG CURCUMINOIDTOÀN PHẦN

VÀ XÁC ĐỊNH KÍCH THƯỚC CỦA CHẾ PHẨM NANO CURCUMIN CHẾ TẠO BẰNG PHƯƠNG PHÁP SOL-GEL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh

2 PGS.TS Trần Việt Hùng

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Hóa phân tích - Đại học Dược Hà Nội

2 Phòng Thí nghiệm trung tâm - Đại học Dược Hà Nội

3 Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

4 Viện Khoa học Vật liệu

HÀ NỘI – 2015

quan tâm, chỉ bảo, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện

và hoàn thành đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS Trần Việt Hùng, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã luôn dành thời gian giúp đỡ, định hướng, hỗ trợ, quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài

Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, cảm ơn các thầy cô và cán

bộ tại bộ môn Hóa phân tích của trường Đại học Dược Hà Nộivà các cán bộ Phòng Thí nghiệm Trung Tâm của Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện tốt nhất, chỉ bảo hỗ trợ tôi để tôi tiến bộ hơn trong kỹ năng làm thực nghiệm, đồng thời cũng động viên, khích lệ để tôi thêm tin tưởng và quyết tâm

Xin trân trọng cảm ơn ThS Nguyễn Tuấn Anh cùng các cán bộ Khoa Kiểm nghiệm Đông Dược Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và PGS.TS Trần Đại Lâm cùng các cán bộ phòng Vật lý vật liệu từ và siêu dẫn của Viện Khoa học Vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện, hỗ trợ để tôi có cơ hội học hỏi và làm thực nghiệm tại phòng

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã là chỗ dựa tinh thần, luôn bên cạnh động viên, chia sẻ, khuyến khích, giúp đỡ để tôi có thể có kết quả như ngày hôm nay

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2015

Sinh viên Phạm Thị Hiền

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về curcuminoid 2

1.1.1 Công thức và tính chất lý hóa 2

1.1.2 Nano curcumin 4

1.1.3 Tác dụng dược lý 5

1.1.4 Một số nghiên cứu định lượng curcuminoid 6

1.2 Một số phương pháp phân tích dùng trong nghiên cứu 9

1.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 9

1.2.2 Vài nét về kính hiển vi điện tử quét 13

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Xây dựng quy trình định tính và định lượng curcuminoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 15

2.3.2 Xác định kích thước hạt nano curcumin 18

2.4 Phương pháp xử lý kết quả 19

CHƯƠNG III THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Chuẩn bị mẫu 20

3.1.3 Chuẩn bị mẫu trắng 20

3.2 Xây dựng điều kiện phân tích curcuminoid bằng HPLC 21

3.2.1 Khảo sát lựa chọn cột sắc ký 21

3.2.2 Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện 21

3.2.3 Khảo sát lựa chọn tốc độ dòng và pha động 22

3.2.4 Khảo sát lựa chọn thể tích tiêm mẫu 24

3.3 Thẩm định phương pháp định tính và định lượng curcuminoid bằng HPLC 25

3.3.1 Độ thích hợp của hệ thống 25

3.3.2 Tính đặc hiệu 27

3.3.3 Độ tuyến tính và khoảng nồng độ 28

3.3.4 Độ chính xác 30

3.3.5 Độ đúng 32

3.4 Ứng dụng định tính, định lượng curcuminoid trong mẫu nano curcumin 33

3.5 Xác định kích thước tiểu phân nano curcumin 34

3.6 Bàn luận 35

3.6.1 Phương pháp định tính và định lượng curcuminoid 35

3.6.2 Xác định kích thước tiểu phân nano curcumin 36

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

A.acetic Acid acetic

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SEM Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscopy)

TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscopy) tt/tt Thể tích/thể tích

HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở người (Human Immuno-deficiency

Virus)

1 Bảng 1.1 Tính chất vật lý đặc trưng của các curcuminoid 3

2 Bảng 1.2 Một số chế phẩm chứa nano curcumin trên thị trường 6

3 Bảng 1.3 Một số nghiên cứu định lượng curcuminoid bằng

6 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký 25

10 Bảng 3.7 Kết quả định lượng curcuminoid trong mẫu nano

11 Hình 3.8 Sắc ký đồ của mẫu chuẩn nồng độ 0,06 mg/ml 27

12 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn độ tuyến tính và khoảng nồng

13 Hình 3.10 Sắc ký đồ của 5 mẫu xây dựng đường chuẩn 29

14 Hình 3.11 Hình ảnh SEM của tiểu phân nano curcumin 34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Nghệ vàng Curcuma longa L thuộc họ gừng (Zingiberaceae) được

trồng nhiều ở các vùng khí hậu nóng ẩm, trong đó có Việt Nam Từ lâu, cây Nghệ

đã được con người sử dụng làm gia vị, chất bảo quản, chất tạo màu trong chế biến thực phẩm và làm thuốc chữa bệnh Trong những thập kỷ gần đây, các nhà khoa học

đã nghiên cứu sâu hơn và phát hiện thêm nhiều tác dụng quan trọng của cây Nghệ Bên cạnh tác dụng kháng nấm, diệt khuẩn, diệt ký sinh trùng, chống viêm nhiễm, bảo vệ da, cây Nghệ còn được biết đến với tác dụng chống thiếu máu cục bộ, viêm khớp, chống oxi hóa và chống ung thư Đồng thời các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng trong số các thành phần thì curcuminoid chính là nhóm chất chính quyết định những hoạt tính sinh học quan trọng đó

Mặc dù hoạt tính mạnh và đa dạng nhưng hiệu quả trên lâm sàng của curcuminoid lại bị hạn chế do sinh khả dụng thấp Để nâng cao sinh khả dụng của curcuminoid nhiều phương pháp đã được thực hiện với các cách tiếp cận khác nhau, trong đó có việc sử dụng curcuminoid kích thước nano (hay còn gọi là nano curcumin) Có nhiều phương pháp bào chế nano curcumin trong đó có phương pháp Sol-gel đang được Viện Khoa học Vật liệu sử dụng bào chế tạo ra nguyên liệu nano curcumin dạng hỗn dịch trong nước với nồng độ từ 5 - 10%

Nhằm góp phần xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cho nguyên liệu này, chúng

tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu định tính và định lượng curcuminoid

toàn phần và xác định kích thước của chế phẩm nano curcumin chế tạo bằng phương pháp Sol-gel” với các mục tiêu sau:

1 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng curcuminoidtoàn phần bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

2 Xác định kích thước của chế phẩm nano curcumin chế tạo bằng

phương pháp Sol-gel

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về curcuminoid

1.1.1 Công thức và tính chất lý hóa

 Nguồn gốc

Curcuminoid là nhóm chất chính có trong thành phần hóa học của cây Nghệ

vàng (Curcuma longa L.), họ Gừng (Zingiberaceae) Đây là nhóm chất chính quyết

định nhiều tác dụng quan trọng của cây Nghệ

Curcuminoid là dẫn chất của diaryheptan, gồm curcumin, desmethoxycurcumin (DMC) và bis-desmethoxycurcumin (BDMC) Trong đó curcumin là chất chính chiếm khoảng 77%, desmethoxycurcumin chiếm khoảng 17% và bis-desmethoxycurcumin chiếm khoảng 3% Curcumin là một hợp chất polyphenol và chính là chất tạo nên màu vàng của cây Nghệ [25]

 Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của các curcuminoid

Hình dạng Tinh thể hình kim

Màu vàng tươi

Tinh thể hình kim Màu đỏ cam

Tinh thể hình kim Màu vàng cam

Tnc (oC) 179,5 - 183,5 168,5 - 170,2 213,2 - 215,5 λmax UV-Vis

curcuminoid Pothitirat và Gritsanapan (2006) xác định curcuminoid ở bước sóng

420 nm.Trong khi đó, một số nghiên cứu lại lấy bước sóng cực đại là bước sóng nằm trong khoảng 424 đến 430 nm[7],[20]

1.1.2 Nano curcumin

1.1.2.1 Đại cương

Curcumin không tan trong nước, trong môi trường acid hoặc trung tính (độ tan 0,1 mg/ml) nhưng tan trong môi trường kiềm (độ tan 3 mg/ml) Curcumin thường hòa tan trong các dung môi hữu cơ như (aceton 20 mg/ml), ethanol, dimethylsulfoxid, dimethyl formamid và dầu Curcumin không bền và dễ bị phân hủy nhanh trong trong môi trường trung tính hoặc kiềm để tạo thành feruloyl và acid ferulic, nó chỉ ổn định ở pH dưới 6 Các tính chất đó khiến cho việc sử dụng curcumin bị hạn chế, sinh khả dụng khi dùng đường uống thấp Để nâng cao sinh khả dụng của curcumin nhiều phương pháp đã được thực hiện với các cách tiếp cận khác nhau, cụ thể là sử dụng:

 Tá dược như piperin để cản trở quá trình glucuronide hóa

 Curcumin liposomal

 Phức hợp curcumin phospholipid

 Các chất tương tự cấu trúc của curcumin ví dụ EF-24

Trong đó hệ thống phân phối hạt kích thước nano (nanoparticulates) đường uống là một hướng được quan tâm nghiên cứu nhiều Hệ thống phân phối hạt kích thước nano bao gồm polymeric, hạt nano lipid rắn (Solid lipid nanoparticles), liposom, niosomes, micelles, siêu vi nhũ tương (microemulsions),và hạt thuốc kích thước nano Quá trình nano hóa (Nanonization) đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao tính thương mại cho nhiều sản phẩm Nhiều nghiên cứu đã chứng minh quá trình nano hóa giúp cải thiện đáng kể sinh khả dụng của thuốc trong đó có curcuminoid[18]

1.1.2.2 Nano curcumin chế tạo bằng phương pháp Sol-gel

Nano curcumin có thể được chế tạo bằng nhiều phương pháp như sử dụng các polysaccharidcấu trúc nano làm màng bao, sử dụng lực cơ học để làm nhỏ tới kích thước nano Các nhà nghiên cứu ở Viện Khoa học Vật liệu đã lựa chọn phương pháp Sol-gel để chế tạo nano curcumin

Phương pháp hóa học Sol-gel là một kỹ thuật để tạo ra một số sản phẩm cóhình dạng mong muốn ở cấp độ nano Nhờ khả năng trộn lẫn các chất ở quy mô nguyên tử, phương pháp Sol-gel có thể tạo ra các sản phẩm có độ đồng nhất cao, độ tinh khiết hóa học cao và một khả năng quan trọng là có thể khống chế được kích thước, hình dạng của hạt Ngoài ra, đây cũng là một phương pháp đơn giản, phù hợp với điều kiện nghiên cứu tại Việt Nam, có thể điều khiển được các giai đoạn trong quá trình để tạo ra các sản phẩm như mong muốn

Phương pháp Sol-gel là một quá trình hóa học, tổng hợp các phần tử huyền phù dạng keo rắn trong chất lỏng và sau đó tạo thành nguyên liệu lưỡng pha của bộkhung chất rắn, được chứa đầy dung môi cho đến khi xảy ra quá trình chuyển tiếpSol-gel Một cách tổng quát, quá trình Sol-gel là liên quan đến hóa lý của sự chuyển đổi của một hệ thống từ precursor thành pha loãng dạng Sol sau đó tạo thành pha rắn dạng Gel theo mô hình precursor Sol Gel

Trong quá trình Sol-gel, các phần tử trung tâm trải qua 2 phản ứng hóa học cơbản: phản ứng thủy phân và phản ứng ngưng tụ (dưới xúc tác axit hoặc bazơ) đểhình thành một mạng lưới trong toàn dung dịch [11], [5]

1.1.3 Tác dụng dược lý

Từ khoảng năm 1900 trước Công nguyên, Ấn Độ đã sử dụng củ Nghệ trong

y học để chữa trị nhiều bệnh tật Nhưng phải đến cuối thế kỷ 20, các nhà khoa học mới nghiên cứu và xác định được curcuminoid là nhóm chất chính đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính sinh học của củ Nghệ đặc biệt là curcumin [10] Nhiều thử nghiệm lâm sàng ở người đãđược thực hiện để nghiên cứu tác dụng của curcumin trong điều trị các bệnh như: viêm tủy, ung thư tụy, ung thư ruột kết, bệnh Alzheimer [20], bệnh vẩy nến, hội chứng loạn sản tủy Các nghiên cứu cũng cho

thấy curcumin có tính chất chống ung thư [9], [12], chống viêm khớp, chống oxi hóa, chống thiếu máu cục bộ [21] và kháng viêm [23]

Nhờ khả năng vô hiệu hóa tế bào ung thư và ngăn chặn hình thành các tế bào ung thư mới mà không gây hại cho các tế bào lành tính bên cạnh, curcumin giúp phòng ngừa và chống ung thư Năm 2009, một nghiên cứu về tác dụng của curcumin đối với tế bào ung thư đã cho thấy curcumin có thể điều chỉnh quá trình phân chia thường xuyên của tế bào, từ đó tác động tới sự phát triển của các tế bào u, bướu, đồng thời không cho thấy bất kỳ dấu hiệu độc tính nào và ổn định sau khi ủ với protein huyết thanh của con người Các nghiên cứu cũng đã chứng minh curcumin có khả năng kìm hãm sự phát tác của tế bào ung thư da, dạ dày, ruột, vòm họng, dạ con và bàng quang [9]

Nghiên cứu tại Ấn Độ cho thấy, vùng dân ăn nhiều cary có tỷ lệ người mắc bệnh Alzheimer rất thấp Điều đó gợi mở cho khả năng chống bệnh Alzheimer của curcumin Theo các nhà khoa học, curcumin còn có tác dụng tốt cho não, các notron, giảm stress, trầm cảm và trạng thái lo âu [10]

Không chỉ vậy, curcumin còn đang được hi vọng có khả năng điều trị viêm gan B, C và nhiễm HIV Từ năm 1993, các nhà khoa học thuộc ĐH Harvard (Hoa Kỳ) đã công bố curcumin là một trong ba chất có tác dụng kìm hãm tế bào HIV-1, HIV-1-RT [23]

1.1.4 Một số nghiên cứu định lượng curcuminoid

Trên thế giới, nhiều phương pháp đã được xây dựng để định tính và định lượng curcuminoid được tổng hợp ở bảng 1.3sau:

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu định lƣợng curcuminoid bằng HPLC sử

dụng detector PDA và UV-VIS

Hạt curcumin

có kích thước

nano

- A là dung dịch đệm amonium acetate pH 4,5 và

B là ACN

- Điều kiện gradient:

Ban đầu 95% A, tiến tới 55%A ở 20 phút, cuối cùng

là 5%A ở 33 phút

- Bước sóng: 420 nm

- Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)

trietheanolamin 50%, B là ACN (45:55, tt/tt)

-aBước sóng: 254 nm

- Cột Agilent RP C18 XDB (150 x 4.6 mm, 5µm)

(tt/tt) : ACN (1:1, tt/tt) (Điều chỉnh đến pH 3.0 với amoniac)

- Bước sóng: 420nm

- Cột C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm)

- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

[16]

Bột thân rễ

Dung dịch acid citric trong nước (1g trong 1000 ml nước): tetrahydrofuran (6:4, tt/tt)

- Bước sóng: 420 nm

- Cột C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm)

[18]

Bột thân rễ của

cây Nghệ

Dung dịch A.acetic : MeOH (15:85, tt/tt)

-aBước sóng: 420 nm

- Cột Kromasil C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)

[20]

Một số loài

Curcuma

Hỗn hợp MeOH - H2O (chứa dung dịch acid trifluoroacetic 0.1%) – ACN (39.5:350:468, tt/tt/tt)

-aBước sóng: 425 nm

- Cột C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)

• Gradient khai triển:

Thời gian Tỷ lệ 0-3 phút 10% B

cấu trúc nano

Acid ortho phosphoric 0,1% : ACN = 50:50,tt/tt

-Bước sóng: 292 nm

-aCột C18 (pha đảo, 150x4,6 mm, 5µm)

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

[15]

[20]

1.2 Một số phương pháp phân tích dùng trong nghiên cứu

1.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.2.1.1 Nguyên tắc phương pháp HPLC

HPLC là quá trình tách trong đó các chất tan được vận chuyển và phân bố giữa pha động và pha tĩnh Mẫu phân tích ở dạng dung dịch sau khi chuyển lên cột tách, sẽ được hấp phụhay liên kết với pha tĩnh Pha động dịch chuyển qua cột sắc ký với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất trong mẫu phân tích ra khỏi cột Tùy thuộc vào bản chất của pha động, bản chất của pha tĩnh và bản chất của các chất trong mẫu phân tích mà quá trình rửa giải sẽ tách các chất trong mẫu phân tích ra khỏi nhau Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và chuyển tín hiệu tới bộ xử lý kết quả Kết quả cuối cùng thu được sẽ được hiển thị trên máy tính hoặc đưa ra máy in Nếu mẫu phân tích là hỗn hợp nhiều thành phần thì sau quá trình tách sắc ký ta sẽ thu được một sắc ký đồ gồm nhiều pic [2], [4], [8]

1.2.1.2 Một số thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

 Thời gian lưu t R (Retention time)

Thời gian lưu là khoảng thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu, qua cột sắc ký tới detector và cho pic trên sắc ký đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện đỉnh của pic) Thời gian lưu của mỗi chất là hằng định Tùy vào điều kiện phân tích cụ thể, các chất khác nhau thì thời gian lưu sẽ khác nhau Vì vậy thời gian lưu

là đại lượng để định tính các chất

Thời gian lưu phụ thuộc vào các yếu tố:

 Bản chất, thành phần, tốc độ pha động

 Bản chất sắc ký của pha tĩnh, kích thước, độ xốp, cấu trúc xốp của pha tĩnh

 Cấu tạo và bản chất của phân tử chất tan, các nhóm thế

 Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH pha động, nồng độ chất tạophức, nếu các yếu tố này có ảnh hưởng đến các cân bằng động trong quá trình sắc ký

Trong một phép phân tích nếu tR quá nhỏ thì sự tách kém, còn tR quá lớn (tR>

20 phút) thì pic bị doãn, độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài[2], [4], [8]

 Hệ số dung lƣợng k’(Thừa số khối lƣợng)

Hệ số dung lượng k’ là tỷ số lượng chất tan trong pha tĩnh và trong pha động Chọn cột, pha động… sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1≤ k’ ≤8

QS: Lượng chất trong pha tĩnh Qm: Lượng chất trong pha động

 Hệ số đối xứng của pic F

F= 𝑊

2×𝑎

Trong đó:

W: Chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic

a: Khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh đến mép đường cong phía trước tại

vị trí 1/20 chiều cao pic

Theo lý thuyết yêu cầu F phải nằm trong khoảng 0,9 - 1,1 Tuy nhiên tùy theo phép phân tích có yêu cầu khác nhau với F, thông thường yêu cầu F nằm trong khoảng 0,7 - 2,0

 Số đĩa lý thuyết N

Trong đó:

W: Chiều rộng đo đáy pic

W1/2: Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Số đĩa lý thuyết để đánh giá hiệu lực cột sắc ký Tùy phép phân tích mà yêu cầu N khác nhau, thông thường N > 3000/cột

tRB, tRA: Thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (B và A)

WB, WA: Độ rộng pic ở các đáy pic

W1/2B, W1/2A: Độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic

Các giá trị tRB, tRA, WB, WA, W1/2B, W1/2A tính theo cùng một đơn vị

Yêu cầu: RS>1, phép định lượng yêu cầu RS ≥ 2

1.2.1.3 Ứng dụng định lượng của HPLC

Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độcủa chất phân tích tỷ lệ với diện tích pic hay chiều cao pic của nó

Có 4 phương pháp định lượng sử dụng trong sắc ký:

Trong khuôn khổ của khóa luận, tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp chuẩn ngoại - chuẩn hóa một điểm và chuẩn hóa nhiều điểm

 Chuẩn hóa một điểm: chọn nồng độ chất phân tích trong mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ chất phân tích trong mẫu thử Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:

Cx=Cs×𝑆𝑥

𝑆𝑠

Ở đây:

Cx: Nồng độ mẫu thử Sx: Diện tích của pic mẫu thử

 Chuẩn hóa nhiều điểm: chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn (C)

Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định Có thể tính toán theo 2 cách:

 Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy ra nồng độ của nó

 Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính, mô tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao) của pic với nồng độ của chất cần xác định

Y=a+ b × 𝐶𝑥Trong đó:

a: Giao điểm của đường chuẩn Cx: Nồng độ phân tích trong dung dịch mẫu thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử:

𝐶𝑥=𝑌−𝑎

𝑏

1.2.2.Vài nét về kính hiển vi điện tử quét

Kích thước hạt nano có thể được xác định bằng máy đo kích thước hạt Zetasizer Nano, kính hiển vi điện tử bao gồm kính hiển vi điện tử quét (TEM), kính hiển vi điện tử truyền qua (SEM), kính hiển vi điện tử quét truyền qua (STEM) [6] Hiện nay có hai loại kính hiển vi điện tử chủ yếu đó là kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) và kính hiển vi điện tử quét (SEM), ngoài ra còn có loại kết hợp tính năng của hai loại kính trên là hiển vi điện tử quét truyền qua (STEM)

Kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope, SEM), là một loại kính hiển vi điện tử sử dụng chùm điện tử (chùm các electron) hẹp quét trên bề mặt mẫu, các bức xạ phát ra từ tương tác của chùm điện tử với bề mặt mẫu sẽ được ghi nhận, phân tích để tạo ra ảnh của bề mặt mẫu vật có độ phân giải cao

Cấu tạo chính của SEM gồm cột kính (súng điện tử, tụ kính, vật kính), buồng mẫu, đầu dò tín hiệu điện tử, hệ thống bơm chân không[6]

Hình 1.3.Kính hiển vi điện tử quét FESEM Hitachi S - 4800

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

 Mẫu thử: Nano curcumin được điều chế bằng phương pháp Sol – gel gồm curcumin kích thước nano, nước và các chất phụ gia khác

 Mẫu thử và mẫu placebo (thành phần giống mẫu thử nhưng không chứa curcuminoid do Viện Khoa học Vật liệu cung cấp)

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

 Dung môi, hóa chất

 Chất chuẩn: chuẩn làm việccurcuminoid (hàm lượng 90,0%, độ ẩm 3,0%)

 ACN, MeOH dùng cho HPLC của Merck - Đức

 Acid acetic băng dùng cho HPLC của Merck - Đức

 Nước cất dùng cho HPLC (nước cất 2 lần)

 Thiết bị, dụng cụ

 Hệ thống máy HPLC Agilent Technologies 1260 Infinitive, Mỹ

 Kính hiển vi điện tử quét FESEM Hitachi S - 4800

 Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức

 Cân phân tích có độ chính xác ± 0,1 mg

 Phễu lọc Buchner, bộ lọc dung môi, màng lọc mẫu với màng lọc 0,45μm

 Chày, cối, bình định mức, vial, cốc có mỏ, pipet, đũa thủy tinh, lọ đựng mẫu

và các dụng cụ thủy tinh có độ chính xác phù hợp

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích (điều kiện sắc ký)

 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng (độ thích hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, độ tuyến tính, độ chính xác và độ đúng)

 Ứng dụng định tính và định lượng curcuminoid trong nano curcumin chế tạo bằng phương pháp Sol-gel

 Đo kích thước nano curcuminbằng kính hiển vi điện tử quét

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.Xây dựng quy trình định tính và định lượng curcuminoid bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

2.3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

Xây dựng chương trình sắc ký định tính và định lượng curcuminoid trong mẫu thử bao gồm:

 Lựa chọn cột sắc ký: trên cộtInertsil ODS - 3 C18 (4,6 × 250 mm, 5µm), Zorbax C18 SB (150 x 4,6 mm, 5µm) và cột Hypersil ODS (4,6 × 250 mm, 5µm), chọn cột có khả năng tách tốt và chọn lọc

 Lựa chọn bước sóng thích hợp: Chuẩn bị dung dịch chuẩn curcuminoid có nồng độ 0,06 mg/ml trong MeOH, quét phổ từ bước sóng 200 nm - 750 nm, chọn bước sóng mà tại đó đáp ứng của BDMC là cực đại nhưng ảnh hưởng của nền mẫu

là ít nhất

 Lựa chọn pha động và tốc độ dòng: pha động ACN : dung dịch A.acetic 4% với các tỷ lệ lần lượt 40:60, 50:50, 60:40 và tốc độ dòng với các mức 1,0 ml/phút, 1,3 ml/phút, 1,5 ml/phút, 1,7 ml/phút và 1,9 ml/phút Lựa chọn pha động và tốc độ dòng cho thời gian lưu vừa phải, pic của chất phân tích cân đối, sắc nét, các thành phần của curcuminoid tách tốt, hệ số đối xứng phù hợp mà áp suất cột không quá cao

 Lựa chọn thể tích tiêm: với 3 mức 5 µl, 10 µl, 20µl, lựa chọn thể tích tiêm cho pic gọn đẹp, không xen phủ pic khác

2.3.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Theo hướng dẫn chung thẩm định quy trình phân tích HPLC định tính, định lượng hoạt chất trong chế phẩm [3], [8] chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp phân tích curcuminoid trong mẫu phân tích với các chỉ tiêu:

và diện tích pic đáp ứng qua các lần sắc ký

 Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic và thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu, biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) không lớn hơn 2%

 Tính chọn lọc (độ đặc hiệu)

 Chuẩn bị mẫu trắng với các thành phần tá dược tương tự như trong mẫu thử nhưng không có curcuminoid và mẫu curcumin chuẩn trong MeOH So sánh sắc ký

đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên

 Yêu cầu: Khi chạy mẫu trắng, tại vị trí tương ứng với tR của C, DMC,

BDMC không xuất hiện pic

 Độ tuyến tính và khoảng nồng độ

 Xác lập mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độcurcuminoid Chuẩn bị một dãy curcuminoid chuẩn trong pha động có nồng độ như sau: 0,03 - 0,06 - 0,09 - 0,12 - 0,16 mg/ml Sắc ký trong cùng điều kiện, xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r

 Yêu cầu: Đường hồi quy có dạng đường thẳng và giá trị hệ số tương quan r

>0,995 [7]