Định tính và định lượng curcuminoidrất quan trọng để xác định chất lượng của nguyên liệu cũng như các sản phẩm có nguồn gốc từ Nghệ. Có nhiều phương pháp đã được các nhà nghiên cứu sử dụng như phương pháp quang phổ UV-VIS, phương pháp phổ hồng ngoại (IR), phương pháp phân tích dòng chảy, phương pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lớp lỏng hiệu năng cao) và phương pháp điện di mao quản [20].
So với phương pháp quang phổ UV- VIS, phương pháp phổ hồng ngoại (IR) phương pháp chúng tôi xây dựng sử dụng thiết bị HPLC, tuy phức tạp hơn nhưng hệ thống này đã được sử dụng phổ biến ở nhiều nơi, có độ nhạy, độ ổn định và độ chính xác cao hơn cả về mặt định tính và định lượng, đồng thời cho phép định lượng được nhiều chất tại nhiều bước sóng khác nhau mà không cần phân tách trước, phù hợp với nền mẫu phức tạp của mẫu phân tích.
So với phương pháp phân tích dòng chảy, phương pháp điện di mao quảnthì phương pháp HPLC đơn giản, phổ biến, được áp dụng rộng rãi hơn.
Lựa chọn phương pháp HPLC cho nghiên cứu, chúng tôi có những ưu và nhược điểm sau:
So với phương pháp định lượng curcuminoid nêu trong Dược điển Trung Quốc có sự thay đổi về tỷ lệ thành phần pha động, cột C18 khá phổ biến thay cho cột C8, thay đổi về tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu. Mặc dù thay đổi điều kiện và khác nhau về đối tượng phân tích (Dược điển Trung Quốc phân tích mẫu nguyên liệu, còn nghiên cứu của chúng tôi là mẫu thử nano curcumin) nhưng phương pháp vẫn đảm bảo đầy đủ về tính đặc hiệu, độ phù hợp, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và độ chính xác trung gian [18].
So với phương pháp định lượng curcuminoid trong Dược điển Mỹ 32, dung môi sử dụng làm pha động phổ biến và ít độc hại hơn. Để định tính và định lượng Dược điển Mỹ 32 sử dụng ba loại chất chuẩn riêng biệt C, DMC và BDMC, tuy nhiên ở Việt Nam chất chuẩn DMC và BDMC còn chưa phổ biến và giá thành cao nên chúng tôi đã sử dụng chất chuẩn là chuẩn làm việc curcuminoid, chứa cả ba thành phần [24].
Như vậy, phương pháp này khá đơn giản, sử dụng dung môi ACN, A.acetic là những dung môi phổ biến, hay dùng cho HPLC, chương trình chạy sắc ký đẳng dòng thích hợp cho đơn vị máy HPLC không có khả năng chạy gradient dung môi. Phương pháp có thể áp dụng định tính curcuminoid dựa vào thời gian lưu, định lượng curcuminoid trong mẫu thử dựa vào diện tích pic thu được.
Tóm lại, phương pháp phân tích xây dựng được có độ đặc hiệu và độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính phù hợp, độ đúng đảm bảo, lại dễ dàng ứng dụng tại các phòng thí nghiệm, các cơ sở sản xuất sử dụng máy HPLC với thời gian phân tích khoảng 11 phút.
3.6.2. Xác định kích thước tiểu phân nano curcumin
Chỉ tiêu đánh giá kích thước của các tiểu phân nano curcumin là rất quan trọng để đánh giá chất lượng của các sản phẩm đã chế tạo. Chúng tôi sử dụng kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 20 - 800000 lần để xác định kích thước tiểu phân nano curcumin. Phương pháp này có nhiều ưu điểm đó là phổ biến, có tính kinh tế cao, xử lý mẫu đơn giản, nhanh chóng. Tuy nhiên phương pháp cũng tồn tại nhược điểm là đôi khi hình ảnh còn chưa sắc nét. Vì vậy, trong nhiều trường hợp cần tăng độ phân giải cho hình ảnh, khả năng quan sát rõ hơn, có thể sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để đánh giá.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
1. Kết luận
Từ kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi đạt được mục tiêu đề ra và có các kết luận như sau:
Đã xây dựng được phương pháp định tính và định lượng curcuminoidtrongmẫu phân tích nano curcumin chế tạo bằng phương pháp Sol – gel. Phương pháp định tính, định lượng đơn giản, thực hiện nhanh, dung môi không phức tạp.
Điều kiện sắc ký: cột Inertsil C18 (4,6 × 250mm, 5µm), bước sóng 418 nm, pha động làACN:dung dịch A.acetic 4% với tỷ lệ 50:50 (tt/tt), thể tích tiêm 10 µl, tốc độ dòng 1,7 ml/phút, nhiệt độ cột là nhiệt độ phòng thí nghiệm, thời gian phân tích là 11 phút.
Định tính dựa vào thời gian lưu của pic C, DMC, BDMC trong dung dịch mẫu thử tương ứng với thời gian lưu của pic C, DMC, BDMC trong dung dịch mẫu chuẩn. Định lượng curcuminoid của mẫu thử theo phương pháp chuẩn hóa diện tích 1 điểm, dựa vào diện tích pic chất phân tích trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử, nồng độ chất phân tích trong dung dịch mẫu chuẩn tính được nồng độ chất phân tích trong dung dịch mẫu thử.
Phương pháp đã được thẩm định cho độ đặc hiệu cao, khoảng tuyến tính đảm bảo với yêu cầu định lượng curcuminoid trong mẫu thử, độ chính xác và độ đúng cao.
Ứng dụng định tính, định lượng curcuminoid trong mẫu thử nano curcumin cho kết quả: thời gian lưu của 3 pic C, DMC, BDMC trong dung dịch thử tương ứng với thời gian lưu của 3 pic C, DMC và BDMC trong dung dịch chuẩn và hàm lượng curcuminoid trong mẫu phân tích là 6,30 ± 0,067 (%).
Đã xác định được kích thước tiểu phân nano curcumin bằng kính hiển vi điện tử quét. Kết quả trên mẫu phân tích, kích thước của các tiểu phân nano dao động trong khoảng 250 - 550 nm.
2. Đề xuất
Với những kết quả đã đạt được từ khóa luận, chúng tôi đề xuất như sau:
Tiếp tục nghiên cứu áp dụng quy trình trên vào việc định tính, định lượng, xác định kích thước của chế phẩm có thành phần là nano curcumin điều chế bằng phương pháp Sol-gel.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Bộ Y tế, Hà Nội.
2. Bộ Y tế (2007), Hóa Phân Tích II, NXB Y học, Hà Nội, tr.168-186.
3. Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn Asean về thẩm định quy trình phân tích. Phụ lục 7- Thông tư 22/2009/TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc.
4. Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội.
5. Huỳnh Đăng Chính (2003), Tổng hợp, cấu trúc và các tính chất điện - từ của một số Perovskite bằng phương pháp Sol-Gel, Luận án tiến sĩ hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội.
6. Nguyễn Kim Giao (2004), Hiển vi điện tử trong khoa học sự sống, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia.
7. Phan Thi ̣ Hoàng Anh (2013), Nghiên cứu quy trình tách chiết , tổng hợp dẫn xuất và xác đi ̣nh tín h chất, hoạt tính của tinh dầu và curcumin từ cây nghệ vàn g (Curcuma Long L .) Bình Dương, Luận án Tiến sĩ , Trường Đại học Bách Khoa – ĐHQG TP.HCM, TP.HCM.
8. Thái Phan Quỳnh Như (2007), “Kiểm nghiệm thuốc bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Bộ Y tế-Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương-Tài liệu đào tạo: Đảm bảo chất lượng thuốc và 1 số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr.230-250.
Tài liệu Tiếng Anh
9. Aggarwal, B. B., Shishodia S. (2006), “Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer”,Biochemical Pharmacology (Elsevier) 71 (10): pp.1397-1421.
10. Aggarwal, B. B., Sundaram C., Malani N., Ichikawa H. (2007), “Curcumin: the Indian Solid gold”, Adv. Exp. Med. Biol. 595: pp. 1–75.
11. Jeffrey Brinker. C, George W. Scherer (1990), Sol-gel science -The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing, Boston San Diego New York.
12. Choi, Hyunsung (2006), “Curcumin Inhibits Hypoxia-Inducible Factor-1 by Degrading Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator: A Mechanism of Tumor Growth Inhibition”,Molecular Pharmacology (American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics) 70: pp. 1664-1671.
13. Gugulothu DB, Patravale VB (2012), “A New Stability-Indicating HPLC Method for Simultaneous Determination of Curcumin and Celecoxib at Single Wavelength: an Application to Nanoparticulate Formulation”, Pharmaceut Anal Acta 3: pp. 157.
14. Hatcher H., Planalp R., Cho J., Torti F. M., Torti S. V. (2008), “Curcumin: from ancient medicine to current clinical trials”,Cell. Mol. Life Sci. 65 (11): pp.1631.
15. C. Moorthi, K. Kathiresan (2013), “Simultaneous estimation of curcumin and silibinin using validated RP-HPLC-PDA method and its application in pharmaceutical nanoformulationon”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, pp. 475-478.
16. Mulik, R.; Mahadik, M.; Paradkar (2009), “A. Development of curcuminoids loaded poly(butyl) cyanoacrylate nanoparticles: Physicochemical characterization and stability study”, Eur. J. Pharm. Sci., 37, pp. 395–404.
17. Do Nascimento et al. (2012), “Development and Validation of an HPLC Method Using Fluorescence Detection for the Quantitative Determination of Curcumin in PLGA and PLGA-PEG Nanoparticles”, Current Pharmaceutical Analysis,8, pp. 324-333.
18. Pharmacopoeia of the people’s republic of china (2010), Volume 1, pp.139. 19. R.Ravichandran (2012), “Studies on DisSolution Behaviour of Nanoparticulate Curcumin Formulation”, Advances in Nanoparticles, 2, pp.51-59.
20. Abdul Rohman (2012), “Mini Review Analysis of curcuminoids in food and pharmaceutical products”, International Food Research Journal 19(1): pp.19-27.
21. Shukla P. K., Khanna V. K., Ali M. M., Khan M. Y., Srimal R. C. (2008), “Anti-ischemic effect of curcumin in rat brain”, Neurochem Res., 33(6):1036-43, PMID: 18204970.
22. Srivastava, K. C.; Bordia A.; Verma S. K. (1995), “Curcumin, a major component of the food spice turmeric (Curcuma longa), inhibits aggregation and alters eicosanoid metabolism in human blood platelets”, Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids52 (4): pp.223-227.
23. Stix, Gary (2007). “Spice Healer”,Scientific American.
24. The United States Pharmacopeia 32 (2009), Volume 2, pp.2346-2350.
25. Wu N.C (2003), Safety and anti - inflammatory activity of curcumin: A component of tumeric (Curcuma longa)”, The Journal of alternative and complementary medicine, 9(1), pp. 161-168.