Tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn nhưng với thể tích tiêm mẫu thay đổi ở 3 mức 5 µl, 10 µl, 20 µl.
Ở thể tích tiêm 5 µl: chiều cao pic thấp đặc biệt là BDMC.
Ở thể tích tiêm 20 µl: hệ số tách thấp hơn so với tiêm 10 µl, đồng thời thể tích tiêm lớn hơn gây lẫn tạp chất cho cột nhiều hơn.
Nhận xét và kết luận:Thể tích tiêm mẫu là 10µl cho khả năng quan sát pic tốt nhất.Vì vậy, chúng tôi lựa chọn thể tích tiêm mẫu là 10 µl để tiến hành khảo sát tiếp theo.
Kết luận:Từ các kết quả khảo sát trên, điều kiện sắc ký lựa chọn là:
Cột sắc ký: cột Inertsil C18 (4,6 × 250mm, 5µm).
Detector: bước sóng 418 nm.
Pha động: ACN:dung dịch A.acetic 4% với tỷ lệ: 50:50 (tt/tt).
Thể tích tiêm: 10 µl.
Tốc độ dòng: 1,7 ml/phút.
Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng thí nghiệm.
3.3. Thẩm định phƣơng pháp định tính và định lƣợng curcuminoid bằng HPLC
3.3.1. Độ thích hợp của hệ thống
Tiến hành: chuẩn bị mẫu curcuminoid chuẩn nồng độ 0,06 mg/ml như mục
3.1.1. Sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch này theo điều kiện đã chọn. Kết quả được trình
bày ở bảng 3.3 và hình 3.6.
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký STT
Thời gian lƣu (phút) Diện tích pic (mAU.s)
C DMC BDMC C DMC BDMC Tổng 1 8,740 7,884 7,102 1504,8 330,9 75,7 1911,4 2 8,748 7,886 7,106 1504,2 331,2 75,8 1911,2 3 8,729 7,870 7,092 1505,4 330,6 75,8 1907,8 4 8.748 7,886 7,106 1504,2 331,1 75,8 1911,1 5 8,738 7,878 7,101 1503,7 331,1 75,9 1910,7 6 8,771 7,908 7,129 1506,3 331,4 75,8 1913,5 TB 8,747 7,886 7,107 1504,1 331,05 75,8 1910,9 RSD (%) 0,16 0,0016 0,0017 0,0011 0,00083 0,00083 0,096
Hệ số đối xứng Số đĩa lý thuyết
C DMC BDMC C DMC BDMC 1 1,08 1,03 1,01 8939 8750 9107 2 1,08 1,03 1,01 8940 8758 9135 3 1,08 1,03 1,01 8901 9023 9098 4 1,08 1,03 1,01 8940 8758 9135 5 1,08 1,03 1,01 8740 8741 9122 6 1,08 1,03 1,01 8987 8808 9020
Hình 3.6. Sắc ký đồ độ thích hợp của hệ thống
Nhận xét:Kết quả ở bảng cho thấy RSD của thời gian lưu và diện tích pic của curcuminoidcủa 6 phép thử 2%,các giá trị đối xứng nằm trong khoảng cho phép 0,8 ≤ F≤ 1,5 và số đĩa lý thuyết trung bình cao ( N > 5000), RS> 2.Điều này chứng tỏ hệ thống sử dụng là phù hợp và đảm bảo ổn định cho phép phân tích định lượng curcuminoid.
3.3.2. Tính đặc hiệu
Chuẩn bị dung dịch chuẩn curcuminoid nồng độ 0,06 mg/ml như mục 3.1.1., mẫu trắng như mục 3.1.3.
Tiến hành sắc ký với điều kiện đã chọn với 2 mẫu chuẩn bị trên. Kết quả thu được các sắc ký đồ như ở hình 3.7, 3.8.
Hình 3.7. Sắc ký đồ của mẫu placebo
Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn nồng độ 0,06 mg/ml
Nhận xét:Ở hình 3.8 cho thấy pic của C, DMC và BDMC có thời gian lưu
lần lượt là 8,665 phút; 7,803 phút; 7,025 phút,các pic cân đối sắc nét. Trên sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic trong khoảng thời gian phân tích từ 6 - 10 phút. Chứng tỏ phương pháp có tính đặc hiệu cao.
3.3.3. Độ tuyến tính và khoảng nồng độ
Tiến hành: chuẩn bị một dãy chuẩncurcuminoid có nồng độ 0,03 - 0,06 - 0,09 - 0,12 - 0,15 mg/ml như mục 3.1.1., sắc ký theo điều kiện đã chọn. Ghi các giá trị
diện tích pic đo được ứng với các nồng độ của dung dịch trên, thiết lập phương trình hồi quy y= ax +b và hệ số tương quan r.
Kết quả khảo sát độ tuyến tính được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.9.
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ tuyến tính
STT Nồng độ C (mg/ml)
Diện tích pic (mAU.s)
Tổng C DMC BDMC 1 0,0309 685,9 143,7 60,5 890,1 2 0,0618 1471,8 320,6 71,1 1863,5 3 0,0927 2246,4 494,2 108,2 2848,8 4 0,1236 2979,3 660,5 151,4 3791,2 5 0,1545 3703,9 855,1 311,6 4870,6 Kết quả thống kê
Phương trình hồi quy tuyến tính: y=32002x - 113,77
Hệ số tương quan tuyến tính: r =0,9996
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn độ tuyến tính và khoảng nồng độ 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 0 0.05 0.1 0.15 0.2 Diện tích pi c (mAU. s) Nồng độ C (mg/ml)
Hình 3.10. Sắc ký đồ của 5 mẫu xây dựng đƣờng chuẩn
Nhận xét và kết luận: Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy trong khoảng nồng độ đã
khảo sát, diện tích pic thu được đáp ứng trên sắc ký đồ tỷ lệ thuận với nồng độ của chúng trong khoảng khảo sát,sự phụ thuộc thể hiện qua đường thẳng hồi quy tuyến tính (hình 3.9) và hệ số tương quan r= 0,9996. Chứng tỏ phương pháp có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ trong khoảng nồng độ khảo sát 0,03 - 0,15 mg/ml.
3.3.4. Độ chính xác
Độ lặp lại
Chuẩn bị dung dịch thử như mục 3.2.2. làm 6 mẫu. Tiến hành sắc ký, ghi lại sắc ký đồ và tính nồng độ curcuminoid trong các dung dịch thử theo đường chuẩn y= ax + b xây dựng cùng ngày phân tích. Dựa vào khối lượng mẫu thử, độ pha loãng và nồng độ curcuminoid trong dung dịch thử tính hàm lượng curcuminoid trong mẫu thử.
Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp được trình bày ở bảng 3.5.
Độ chính xác trung gian
Phân tích định lượng curcuminoid trong mẫu thử ở ngày tiếp theo. Tiến hành tương tự như độ lặp lại trong ngày: phân tích 6 mẫu thử độc lập. Kết quả xác định hàm lượng curcuminoid trong mẫu phân tích được trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Kết quả xác định độ chính xác
Nhận xét và kết luận:Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy: Với điều kiện đã chọn,
độ lặp lại của các kết quả định lượng trong mỗi ngày phân tích cho RSD đạt được là 1,29 % và 1,91% đều nhỏ hơn 2%. Đánh giá gộp kết quả 2 ngày cho RSD là 1,67 % nhỏ hơn 2%. Chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại trong ngày và độ chính xác trung gian đáp ứng yêu cầu thẩm định.
STT Khối lượng cân (g) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượngcurcuminoid(%) Các giá trị thống kê(%) Độ lặp lại 1 0,5061 1496,5 6,20 TB= 6,29% RSD(%)=1,29 % 2 0,5362 1615,4 6,29 3 0,5014 1509,8 6,31 4 0,5247 1616,2 6,43 5 0,5164 1533,4 6,22 6 0,5183 1559,8 6,29 Độ chính xác trung gian 7 0,5214 1570,9 6,30 TB= 6,36% RSD(%)=1,91% 8 0,5148 1615,9 6,55 9 0,5289 1592,4 6,29 10 0,5192 1605,7 6,46 11 0,5254 1602,4 6,36 12 0,5113 1517,2 6,22 Gộp kết quả 2 ngày (n=12) RSD(%)=1,67%
3.3.5. Độ đúng
Tiến hành:
Pha dung dịch chuẩn có nồng độ 0,75 mg/ml như ở mục 3.1.1.
Mẫu thử: Lắc đều mẫu thử trong 15 phút. Làm đồng nhất mẫu. Cân chính xác khoảng 0,50 g mẫu thử cho vào bình định mức 25 ml. Thêm 4,00 ml dung dịch chuẩncurcuminoid trong MeOH có nồng độ 0,75 mg/ml vào. Thêm khoảng 12 ml MeOH, siêu âm 30 phút ổn định ở nhiệt khoảng 30oC, thỉnh thoảng lắc nhẹ. Để nguội về nhiệt đô phòng, lắc đều rồi thêm vừa đủ MeOH đến vạch, lắc đều. Hút 500 µl cho vào bình định mức 10 ml, thêm vừa đủ MeOH đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Sắc ký theo các điều kiện đã chọn ở trên, tìm độ thu hồi của chuẩn thêm vào. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ đúng
STT Khối lượng mẫu thử
Lượng chuẩn curcuminoid thêm vào (mg) Diện tích pic (mAU.s) Lượng curcuminoid tìm lại % Tìm lại 1 0,5564 3,00 2324,7 3,046 101,53 2 0,5782 3,00 2407,2 2,961 98,70 3 0,5372 3,00 2248,1 3,058 101,93 4 0,5415 3,00 2260,4 2,975 99,32 5 0,5647 3,00 2353,9 2,979 99,17 6 0,5232 3,00 2226,1 3,023 100,77 TB 100,26 RSD (%) 1,33
Nhận xét và kết luận: Kết quả cho thấy độ đúng của phương pháp cho lượng
chuẩn tìm lại sau khi thêm lượng chuẩn đã biết đều nằm trong khoảng 98,0-102,0%. Độ lệch chuẩn tương đối là 1,33% 2%. Chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao.
3.4. Ứng dụng định tính, định lƣợng curcuminoid trong mẫu nano curcumin
Trên cơ sở điều kiện sắc ký đã xây dựng tiến hành định tính, định lượng trong curcuminoid trong mẫu nano curcumin.
Tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch thử như mục 3.1.2.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 14,0mg chuẩn curcuminoid vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml MeOH, siêu âm trong 5 phút, để nguội về nhiệt độ phòng, thêm vừa đủ MeOH, lắc đều được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 0,5 mg/ml. Lấy 1,00 ml dung dịch nồng độ 0,5 mg/ml vào bình định mức 10,0 ml, thêm MeOH tới vạch, lắc đều được dung dịch chuẩn nồng độ 0,05 mg/ml.
Chạy sắc ký các mẫu theo điều kiện đã chọn, ghi pic đáp ứng. Mỗi mẫu thử tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.Hàm lượng curcuminoid trong mẫu thử được tính toán theo công thức ở mục 2.4.
Kết quả: cân lượng chuẩn mC = 14,65 mg cho tổng diện tích của 3 pic = 1518,4. Kết quả định tính và định lượng được trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả định lƣợng curcuminoid trong mẫu nano curcumin
STT Khối lượng cân (g) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượngcurcuminoid( %) 1 0,5061 1496,5 6,22 2 0,5362 1615,4 6,34 3 0,5014 1509,8 6,34 TB ± SD 6,30 ± 0,067
Kết luận:thời gian lưu của C, DMC, BDMC trong mẫu thử tương ứng với thời gian lưu của C, DMC, BDMC trong mẫu chuẩn chứng tỏ pic trên sắc ký đồ
định lượng là của C, DMC và BDMC. Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy hàm lượng curcuminoid trong mẫu phân tích là 6,30 ± 0,067(%).
3.5. Xác định kích thƣớc tiểu phân nano curcumin
Sau khi xử lý mẫu và tiến hành đo như mục 2.3.2., chúng tôi thu được hình
Hình 3.11. Hình ảnh SEM của tiểu phân nano curcumin
Từ phân tích SEM cho thấy các phân tử nano curcumin có kích thước dao động trong khoảng 250 - 550 nm.
3.6. Bàn luận
3.6.1. Phương pháp định tính và định lượng curcuminoid
Định tính và định lượng curcuminoidrất quan trọng để xác định chất lượng của nguyên liệu cũng như các sản phẩm có nguồn gốc từ Nghệ. Có nhiều phương pháp đã được các nhà nghiên cứu sử dụng như phương pháp quang phổ UV-VIS, phương pháp phổ hồng ngoại (IR), phương pháp phân tích dòng chảy, phương pháp sắc ký (sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng hiệu năng cao, sắc ký lớp lỏng hiệu năng cao) và phương pháp điện di mao quản [20].
So với phương pháp quang phổ UV- VIS, phương pháp phổ hồng ngoại (IR) phương pháp chúng tôi xây dựng sử dụng thiết bị HPLC, tuy phức tạp hơn nhưng hệ thống này đã được sử dụng phổ biến ở nhiều nơi, có độ nhạy, độ ổn định và độ chính xác cao hơn cả về mặt định tính và định lượng, đồng thời cho phép định lượng được nhiều chất tại nhiều bước sóng khác nhau mà không cần phân tách trước, phù hợp với nền mẫu phức tạp của mẫu phân tích.
So với phương pháp phân tích dòng chảy, phương pháp điện di mao quảnthì phương pháp HPLC đơn giản, phổ biến, được áp dụng rộng rãi hơn.
Lựa chọn phương pháp HPLC cho nghiên cứu, chúng tôi có những ưu và nhược điểm sau:
So với phương pháp định lượng curcuminoid nêu trong Dược điển Trung Quốc có sự thay đổi về tỷ lệ thành phần pha động, cột C18 khá phổ biến thay cho cột C8, thay đổi về tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu. Mặc dù thay đổi điều kiện và khác nhau về đối tượng phân tích (Dược điển Trung Quốc phân tích mẫu nguyên liệu, còn nghiên cứu của chúng tôi là mẫu thử nano curcumin) nhưng phương pháp vẫn đảm bảo đầy đủ về tính đặc hiệu, độ phù hợp, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và độ chính xác trung gian [18].
So với phương pháp định lượng curcuminoid trong Dược điển Mỹ 32, dung môi sử dụng làm pha động phổ biến và ít độc hại hơn. Để định tính và định lượng Dược điển Mỹ 32 sử dụng ba loại chất chuẩn riêng biệt C, DMC và BDMC, tuy nhiên ở Việt Nam chất chuẩn DMC và BDMC còn chưa phổ biến và giá thành cao nên chúng tôi đã sử dụng chất chuẩn là chuẩn làm việc curcuminoid, chứa cả ba thành phần [24].
Như vậy, phương pháp này khá đơn giản, sử dụng dung môi ACN, A.acetic là những dung môi phổ biến, hay dùng cho HPLC, chương trình chạy sắc ký đẳng dòng thích hợp cho đơn vị máy HPLC không có khả năng chạy gradient dung môi. Phương pháp có thể áp dụng định tính curcuminoid dựa vào thời gian lưu, định lượng curcuminoid trong mẫu thử dựa vào diện tích pic thu được.
Tóm lại, phương pháp phân tích xây dựng được có độ đặc hiệu và độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính phù hợp, độ đúng đảm bảo, lại dễ dàng ứng dụng tại các phòng thí nghiệm, các cơ sở sản xuất sử dụng máy HPLC với thời gian phân tích khoảng 11 phút.
3.6.2. Xác định kích thước tiểu phân nano curcumin
Chỉ tiêu đánh giá kích thước của các tiểu phân nano curcumin là rất quan trọng để đánh giá chất lượng của các sản phẩm đã chế tạo. Chúng tôi sử dụng kính hiển vi điện tử quét với độ phóng đại 20 - 800000 lần để xác định kích thước tiểu phân nano curcumin. Phương pháp này có nhiều ưu điểm đó là phổ biến, có tính kinh tế cao, xử lý mẫu đơn giản, nhanh chóng. Tuy nhiên phương pháp cũng tồn tại nhược điểm là đôi khi hình ảnh còn chưa sắc nét. Vì vậy, trong nhiều trường hợp cần tăng độ phân giải cho hình ảnh, khả năng quan sát rõ hơn, có thể sử dụng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) để đánh giá.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
1. Kết luận
Từ kết quả thực nghiệm thu được, chúng tôi đạt được mục tiêu đề ra và có các kết luận như sau:
Đã xây dựng được phương pháp định tính và định lượng curcuminoidtrongmẫu phân tích nano curcumin chế tạo bằng phương pháp Sol – gel. Phương pháp định tính, định lượng đơn giản, thực hiện nhanh, dung môi không phức tạp.
Điều kiện sắc ký: cột Inertsil C18 (4,6 × 250mm, 5µm), bước sóng 418 nm, pha động làACN:dung dịch A.acetic 4% với tỷ lệ 50:50 (tt/tt), thể tích tiêm 10 µl, tốc độ dòng 1,7 ml/phút, nhiệt độ cột là nhiệt độ phòng thí nghiệm, thời gian phân tích là 11 phút.
Định tính dựa vào thời gian lưu của pic C, DMC, BDMC trong dung dịch mẫu thử tương ứng với thời gian lưu của pic C, DMC, BDMC trong dung dịch mẫu chuẩn. Định lượng curcuminoid của mẫu thử theo phương pháp chuẩn hóa diện tích 1 điểm, dựa vào diện tích pic chất phân tích trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử, nồng độ chất phân tích trong dung dịch mẫu chuẩn tính được nồng độ chất phân tích trong dung dịch mẫu thử.
Phương pháp đã được thẩm định cho độ đặc hiệu cao, khoảng tuyến tính đảm bảo với yêu cầu định lượng curcuminoid trong mẫu thử, độ chính xác và độ đúng cao.
Ứng dụng định tính, định lượng curcuminoid trong mẫu thử nano curcumin cho kết quả: thời gian lưu của 3 pic C, DMC, BDMC trong dung dịch thử tương ứng với thời gian lưu của 3 pic C, DMC và BDMC trong dung dịch chuẩn và hàm lượng curcuminoid trong mẫu phân tích là 6,30 ± 0,067 (%).
Đã xác định được kích thước tiểu phân nano curcumin bằng kính hiển vi điện tử quét. Kết quả trên mẫu phân tích, kích thước của các tiểu phân nano dao động trong khoảng 250 - 550 nm.
2. Đề xuất
Với những kết quả đã đạt được từ khóa luận, chúng tôi đề xuất như sau:
Tiếp tục nghiên cứu áp dụng quy trình trên vào việc định tính, định lượng, xác định kích thước của chế phẩm có thành phần là nano curcumin điều chế bằng phương pháp Sol-gel.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Bộ Y tế, Hà Nội.
2. Bộ Y tế (2007), Hóa Phân Tích II, NXB Y học, Hà Nội, tr.168-186.
3. Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn Asean về thẩm định quy trình phân tích. Phụ lục 7- Thông tư 22/2009/TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc.
4. Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học, Hà Nội.
5. Huỳnh Đăng Chính (2003), Tổng hợp, cấu trúc và các tính chất điện - từ của một số Perovskite bằng phương pháp Sol-Gel, Luận án tiến sĩ hóa học, Trường Đại