Thiết kế t - vector dùng cho tách dòng phân tử bằng phương pháp sử dụng enzyme xcmi

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LƯƠNG THỊ THÚY HẰNG Tên đề tài: “THIẾT KẾ T- VECTOR DÙNG CHO TÁCH DÒNG PHÂN TỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME XcmI” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH & CNTP Lớp : 42 - CNSH Khoá học : 2010 – 2014 Giảng viên hướng dẫn : TS. Dương Văn Cường Khoa CNTP – CNSH - Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận văn: Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy giáo: TS.Dương Văn Cường người đã trực tiếp giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài cũng như trong quá trình hoàn chỉnh luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Ma Thị Trang cùng các cán bộ, các anh chị làm việc tại Viện Khoa Học Sự Sống – Đại Học Thái Nguyên đã giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Xin trân trọng cảm ơn ! Thái nguyên, ngày 05 tháng 06 năm 2014 Sinh viên Lương Thị Thúy Hằng DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Amp : Ampicillin Bp : Base pair- Cặp bazơ nitơ Cs : Cộng sự DNA : Deoxirybonucleic Acid dNTP : Deoxyribonucleotide Triphosphas dATP : DeoxyAdenine Triphosphat dGTP : DeoxyGuanine Triphosphat dCTP : DeoxyCytosine Triphosphat dTTP : DeoxyThymineTtriphosphat E. coli : Escherichia coli IPTG : Isopropyl Thiogalactoside LB : Lauria Broth NIT : Vector NTI Advance 11.5 Kb : Kilo base- Kilo bazo nito PCR : Polymerase Chane Polymerase Chain Reaction X-gal : 5-brome-4chloro-3-indoly-β-D-galactoside DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Mô hình minh họa phương pháp tách dòng TA (Hermosa, Grondona et al. 2001) 7 Hình 2.2: Quy trình tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase 8 Hình 2.3: Thiết kế T-vector sử dụng enzyme Eam1105I 9 Hình 2.4: Trình tự và vị trí cắt của enzyme XcmI 10 Hình 2.5: A- Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối 35 Hình 3.1: Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T 13 Hình 3.2. Quy t thiết kế và kiểm tra T-vector sản phẩm ……………… ….19 Hình 3.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR……………………………… 28 Hình 4.1: A- Kết quả tạo vector pTZ57R/T dạng vòng 31 Hình 4.2. Kết quả thiết kế adapter in silico 32 Hình 4.3: Kết quả tạo adapter 33 Hình 4.4: Cắt mở vòng vector pTZ57R/T 34 Hình 4.6: Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme XcmI 36 Hình 4.7: Kết quả tạo T-vector pTUAF 37 Hình 4.8: A: Kết quả biến nạp gen ech vào T-vector pTUAF B: Kết quả biến nạp gen ech vào T-vector thương mại InsTAclone TM của hãng thermo scientific………………………38 Hình 4.9: Kết quả sàng lọc dòng bằng kích thước 39 Hình 4.10: Kết quả chọn lọc dòng bằng phương pháp PCR 39 Hình 4.11: Kết quả cắt kiểm tra gen ech 40 Hình 4.12: A-thiết kế adapter với hai đầu dính là trình tự nhận biết của enzyme Bam HI 41 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Giá thành bộ sản phẩm TA cloning của các hãng sản xuất 2 Bảng 3.1. Các thành phần của InsTAclone PCR cloning 15 Bảng3.2: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 16 Bảng 3.3: Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 17 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng lai hai đoạn oligonucleotid 20 Bảng 3.5: Chu trình nhiệt lai tạo adapter 21 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt đồng thời hai enzyme giới hạn (tổng thể tích 30 µl) 23 Bảng 3.7:Thành phần phản ứng gắn nối 25 Bảng 3.8: Thành phần phản ứng cắt một enzyme (tổng thể tích 30 µl) 26 Bảng 3.9: Thành phần phản ứng gắn nối (tổng thể tích 30 µl) 26 Bảng 3.10: Thành phần phản ứng PCR 28 Bảng 3.11: thành phần phản ứng cắt đồng thời với SacI và EcoRI 29 Bảng 4.1: So sánh quy trình tạo T-vector 43 MỤC LỤC PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3. Mục đích nghiên cứu 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3 1.4.1. Ý nghĩa khoa học 3 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Cơ sở khoa học 4 2.1.1. Tách dòng gene từ sản phẩm PCR 4 2.1.1.1. Phương pháp tách dòng đầu bằng 4 2.1.1.2. Phương pháp tách dòng đầu dính 5 2.1.1.3. Phương pháp tách dòng sử dụng T-vector 6 2.1.2. Các phương pháp tạo T-vector 7 2.1.2.1. Phương pháp tạo T-vector sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase. 7 2.1.2.2. Phương pháp tạo T-vector sử dụng enzyme giới hạn Eam1105I 9 2.1.2.3. Phương pháp tạo T-vector mang vị trí của enzyme XcmI 9 2.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 10 2.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 10 2.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 11 Hình 2.4: Kết quả tạo adapter (Aranishi and Okimoto 2004) 11 CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 3.1. Đối tượng nghiên cứu 13 3.2. Nội dung nghiên cứu 18 3.2.1. Nội dung 1: Thiết kế T-vector pTUAF 18 3.2.2. Nội dung 2: Ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAclone TM của hãng Thermo scientific. . 18 3.3. Phương pháp nghiên cứu 19 Hình 3.2. Quy trình thiết kế và kiểm tra T-vector sản phẩm 19 3.3.1. Thiết kế T-vector pTUAF 20 3.3.1.1. Thiết kế adapter 20 3.3.1.2. Gắn đoạn adapter vào vector pTZ57R/T 21 3.3.2. Ứng dụng T–vector pTUAF trong tách dòng TA và đánh giá hiệu quả tách dòng 26 3.3.2.1. Thực hiện phản ứng TA cloning 26 3.3.2.2. Phương pháp biến nạp sản phẩm gắn nối vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt. 27 3.3.2.3. Đánh giá hiệu quả tách dòng 27 Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1. Kết quả 30 4.1.1. Kết quả thiết kế T-vector pTUAF 30 4.1.1.1. Kết quả lựa chọn và kiểm tra vector làm vật liệu nghiên cứu 30 4.1.1.4. Kết quả gắn adapter vào vector PTZ57R/T tạo ra T-vector pTUAF . 33 4.1.2. Kết quả ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAclone TM . 37 4.1.2.1. Kết quả gắn nối đoạn xen vào T-vector pTUAF và chọn lọc dòng 37 4.1.2.3. Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp PCR 39 4.1.2.4. Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp lập bản đồ giới hạn 40 4.2. Thảo luận 41 4.2.1. Khả năng tự đóng vòng của vector khi thiết kế 2 đầu sử dụng cùng một enzyme giới hạn. 41 4.2.2. So sánh quy trình tạo T-vector bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI và phương pháp sử dụng hoạt tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase. 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 1. Kết luận 45 2. Kiến nghị 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 1. Tài liệu trong nước. 46 2. Tài liệu nước ngoài 46 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Tách dòng gene là một phương pháp phổ biến trong công nghệ DNA tái tổ hợp. Phương pháp tách dòng phổ biến nhất là sử dụng enzyme DNA ligase để tạo liên kết hóa trị giữa các đầu tương thích của đoạn DNA cần tách dòng và vector plasmid. Polymerase Chain Reaction (PCR) là một phản ứng khuếch đại một trình tự DNA đặc hiệu từ một lượng nhỏ DNA khuôn ban đầu. Kĩ thuật này được phát minh cách đây hơn một thập kỉ và cho đến nay đã trở thành kĩ thuật nền tảng căn bản cho tất cả các phòng thí nghiệm Sinh học phân tử trên toàn thế giới (Kolmodin and Birch 2002). Mặc dù sản phẩm PCR có thể sử dụng trực tiếp trong nhiều ứng dụng, nhưng một số ứng dụng yêu cầu sản phẩm PCR phải được tách dòng và duy trì trong một vector (Kolmodin and Birch 2002). Vì hầu hết sản phẩm PCR đều có gốc Adenine ở 2 đầu 3’ bởi hoạt tính Terminal transferase của enzyme Taq polymerase nên T-vector được thiết kế có thymidine ở 2 đầu 3’ của T-vector và Adenosine ở đầu 3’ của sản phẩm PCR được gọi là “ TA cloning” (Vries 1998). Do hiệu quả của tách dòng TA cao, phương pháp này đã được thương mại hóa dưới dạng các bộ KIT. Mỗi bộ KIT tách dòng bao gồm 2 thành phần chính đó là T-vector và enzyme T4 DNA ligase, trong đó thành phần thứ 2 có thể được mua riêng biệt với giá rẻ hơn đáng kể. Vì vậy, giá trị của bộ KIT tách dòng TA thực chất nằm ở T-vector. Trong thực tiễn nghiên cứu tại Việt nam các nguồn vật liệu dùng trong tách dòng gen chủ yếu là sản phẩm thương mại. T-vector thương mại thường được sử dụng tại các phòng thí nghiệm cho hiệu quả tách dòng cao nhưng chi phí cũng cao (bảng 1.1). 2 Bảng 1.1: Giá thành bộ sản phẩm TA cloning của các hãng sản xuất Tên hãng Số phản ứng Chi phí (VND) Thermo scientific ( Mỹ) 10 3.200.000 30 4.500.000 Qiagene ( Đức) 10 3.400.000 40 5.700.000 Invitrogen ( Mỹ) 20 4000.000 40 5.800.000 Bioneer (Hàn Quốc) 20 3.500.000 40 5.600.000 Hiện nay T-vector được tạo ra bằng một số phương pháp bao gồm terminal trasferase và dùng enzyme giới hạn như EcoRV, Eam1105I (Chen, Songkumarn et al. 2009), XcmI (Borovkov and Rivkin 1997) (Testori, Listowsky et al. 1994). Trong đó phương pháp sử dụng enzyme XcmI để tạo T-vector là phương pháp đơn giản nhưng hiệu quả tách dòng cao (93%) (Arashi-Heese, Miwa et al. 1999). Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Thiết kế T- vector dùng cho tách dòng phân tử bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI” với mục tiêu tự tạo ra T-vector để chủ động trong việc tách dòng phân tử nói riêng và góp phần làm giảm chi phí cho những nghiên cứu Sinh học phân tử nói chung. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Tạo được T-vector pTUAF - Ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng phân tử 1.3. Mục đích nghiên cứu Thiết kế thành công T-vector pTUAF bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI phục vụ cho tách dòng phân tử. [...]... chèn trình t nhận bi t enzyme này vào vùng MCS của vector mà vẫn duy trì ho t động của m t T -vector bình thường Hình 2.4: Trình t và vị trí c t của enzyme XcmI Theo cách này có thể thi t kế m t T -vector bằng cách chèn m t đoạn oligonucleotid ngắn chứa hai vị trí c t của enzyme XcmI Khi đưa vào trong vector, vị trí này cho phép có thể thi t kế T- vector khi c t với XcmI Trình t nhận bi t của enzyme XcmI. .. kế pTUAF dựa trên vector pTZ57R /T thương mại của hãng Thermo Scientific Vector pPTZ57R /T là vector t ch dòng TA, mạch thẳng có kích thước 2886 bp được thi t kế có đầu dính là m t nucleotide Thymine sử dụng để t ch dòng gene trực tiếp t phản ứng PCR Hình 3.1: Cấu trúc vector t ch dòng pTZ57R /T Trong cấu trúc của vector t ch dòng pTZ57R /T có hai hệ thống chọn lọc, hệ thống chọn lọc thứ nh t là gene kháng... T- vector pTUAF trong t ch dòng TA và so sánh hiệu su t tách dòng với bộ KIT InsTAcloneTM của hãng Thermo scientific - PCR gen ech - Gắn nối gen ech vào T- vector pTUAF và chọn lọc dòng - Kiểm tra bằng phương pháp sàng lọc kích thước - Kiểm tra bằng phương pháp PCR - Kiểm tra bằng c t enzyme giới hạn 19 3.3 Phương pháp nghiên cứu Để thi t kế và kiểm tra thành công T- vector t o được, phải trải qua quy trình... phục vụ cho nghiên cứu Để thi t kế T- vector t vector pTZ57R /T chúng t i tiến hành t ch chi t plasmid t khuẩn lạc xanh thu được Phương pháp t ch chi t plasmid được thực hiện bằng phương pháp ankaline lysis và sử dụng kit t ch plasmid thương mại của hãng thermo scientific a) Phương pháp t ch chi t plasmid • Plasmid được t ch chi t bằng phương pháp ankaline lysis Quy trình t ch chi t plasmid: - Ly t m 3ml... T i vị trí đa t ch dòng, vị trí của enzyme giới hạn được quan t m trong đề t i này là enzyme EcoRI và BamHI, hai enzyme này được sử dụng để c t mở vòng vector pTZ57R /T phục vụ cho việc t o T- vector Ngoài ra vị trí của enzyme XcmI trên vector 15 pTZ57R /T được quan t m nh t bởi nó liên quan đến khả năng sử dụng vector thích hợp cho việc t o T- vector bằng enzyme XcmI Nếu trên vector có chứa vị trí c t. .. pháp t o T- vector sử dụng ho t tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase Dựa vào ho t tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase gắn thêm m t trong 4 loại nucleotid vào đầu 3’-OH cuối cùng của sản phẩm PCR, m t phương pháp thi t kế T- vector được t o ra sử dụng enzyme c t đầu bằng k t hợp với ho t tính terminal transferase Vector được c t với enzyme giới hạn t o đầu bằng EcoRV... enzyme Eam1105I t o ra Tvector với sự thò ra của nucleotide T ở hai đầu phục vụ cho t ch dòng sản phẩm PCR (Ido and Hayami 1997) K t quả thi t kế adapter được thể hiện ở hình 2.3 Hình 2.3: Thi t kế T- vector sử dụng enzyme Eam1105I 2.1.2.3 Phương pháp t o T- vector mang vị trí của enzyme XcmI Cũng giống như enzyme Eam1105, khi c t tại vị trí nhận bi t enzyme XcmI t o ra 1 nucleotid thymidine đơn thò ra ở đầu... Oligonucleotide 1 Oligonucleotide 2 pTZ57R /T dạng vòng C t EcoRI, BamHI Lai Adapter pTZ57R /T mở vòng Gắn nối T- vector C t XcmI, thôi gel Thử nghiệm Gen đích T- vector sản phẩm Gắn nối, biến nạp, t ch plasmid Tvector - gen đích Điện di so sánh kích thước Pcr khuếch đại gen đích C t enzyme 2 đầu gen Hình 3.2 Quy trình thi t kế và kiểm tra T- vector sản phẩm 20 3.3.1 Thi t kế T- vector pTUAF Chú giải: T n gọi pTUAF... oligonucleotid này đươc đưa vào vector pGEMTA c t mở vòng bằng EcoRI Sử dụng T- vector t o ra t ch dòng sản phẩm PCR, hiệu su t tách dòng đ t hơn 90% (Arashi-Heese, Miwa et al 1999) Năm 2001, Chulman Jo và Sanngmee Ahn Jo đã thi t kế thành công Tvector với đoạn chèn được thi t kế đầu dính là vị trí nhận bi t của enzyme BamHI và NcoI, chứa hai vị trí c t của enzyme XcmI được đưa vào vector pNB -T ph t triển t vector. .. được sử dụng cho t ch dòng sản phẩm PCR (Hong, Choi et al 2009) C t mở vòngvector bằng EcoRV dTTP, Taq và thu nhận T- vector Hình 2.2: Quy trình t o T- vector sử dụng ho t tính terminal transferase Sản phẩm PCR được tinh sạch t gel và được nối với T- vector ở 14oC Vector và sản phẩm PCR được nối với nhau bởi liên k t phosphodiester giữa đầu 5’-P của vector và nhóm 3’-OH của sản phẩm PCR Phương pháp này . chúng t i thực hiện đề t i Thi t kế T- vector dùng cho t ch dòng phân t bằng phương pháp sử dụng enzyme XcmI với mục tiêu t t o ra T- vector để chủ động trong việc t ch dòng phân t nói riêng. 5 2.1.1.3. Phương pháp t ch dòng sử dụng T- vector 6 2.1.2. Các phương pháp t o T- vector 7 2.1.2.1. Phương pháp t o T- vector sử dụng ho t tính terminal transferase của enzyme Taq DNA polymerase HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LƯƠNG THỊ THÚY HẰNG T n đề t i: “THI T KẾ T- VECTOR DÙNG CHO T CH DÒNG PHÂN T BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME XcmI KHÓA LUẬN T T