Cắt mở vòng vector pTZ57R/T bằng enzyme giới hạn
Vector pPTZ57R/T là vector tách dòng TA, mạch thẳng có kích thước
2886 bp có chứa vị trí cắt của enzyme giới hạn EcoRI và BamHI. Trong
nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pPTZ57R/T để thiết kế T-vector bằng enzyme XcmI. Để thu được vector pTZ57R/T tự đóng vòng, chúng tôi tiến hành tách dòng với một sản phẩm PCR đang được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử và thu lại các khuẩn lạc xanh chính là vector pTZ57R/T tự đóng vòng nhằm phục vụ cho nghiên cứu. Để thiết kế T-vector từ vector pTZ57R/T chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid từ khuẩn lạc xanh thu được. Phương pháp tách chiết plasmid được thực hiện bằng phương pháp ankaline lysis và sử dụng kit tách plasmid thương mại của hãng thermo scientific.
a) Phương pháp tách chiết plasmid
• Plasmid được tách chiết bằng phương pháp ankaline lysis
Quy trình tách chiết plasmid:
- Bổ sung 200µl solution I, đảo trộn cho tan hết cặn tế bào. - Bổ sung 250µl solution II, đảo nhẹ 4-6 lần.
- Bổ sung 350 slution III, đảo nhẹ 4-6 lần.
- Ly tâm 10000v/p trong 10 phút, thu dịch lỏng chuyển sang ống eppendorf mới.
- Bổ sung 700µl dung dịch CIAA(chloroform:isoamyalcohol). - Ly tâm 10000v/ trong 10 phút.
- Thu dịch pha trên sang ống eppendorf mới, bổ sung 1000µl cồn 70o để rửa tủa .
- Ly tâm 1000v/p trong 2 phút, bỏ dịch, thu cặn, để khô tự nhiên. - Bổ sung 50µl đệm TE 1X , trộn đều
- Điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết
• Tách chiết plasmid bằng kit GeneJET plasmid Miniprep của hãng Thermo Scientific.
Quy trình tách chiết plasmid bằng kit:
- Ly tâm thu cặn khuẩn 5000v/p trong 5 phút. Thực hiện ly tâm thu cặn 3 lần
- Bổ sung 250µl Resuspension Solution vào ống tế bào , vortex cho đến khi căn khuẩn tan hoàn toàn.
- Bổ sung 250µl Lysis Solution, đảo nhẹ 4-6 lần.
- Bổ sung 350µl Neutralization Solution, mix nhẹ 4-6 lần.
- Ly tâm 1000v/p trong 10 phút, hút phần dịch lỏng sang cột lọc của bộ kit.
- Ly tâm 1000v/p trong 1 phút, loại bỏ phần dịch phía dưới cột lọc.
- Thêm 500µl Wash Solution, ly tâm 1000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch phía dưới cột lọc ( lặp lại 2 lần).
- Chuyển cột ở phía trên cột lọc sang ống eppendorf 1,5ml, thêm 50µl Elution Solution, để 2 phút ở nhiệt độ phòng sau đó ly tâm 1000v/p trong 2 phút.
- Bỏ cột lọc và bảo quản plasmid ở 20o C
b) Cắt mở vòng vector pTZ57R/T bằng enzyme giới hạn
• Phản ứng cắt enzyme giới hạn
Để phục vụ cho mục đích gắn đoạn adapter vào vector pTZ57R/T chúng tôi tiến hành cắt đồng thời hai enzyme giới hạn là EcoRI và BamHI đối với vector pTZ57R/T để tạo ra vector pTZ57R/T mở vòng. Thành phần phản ứng cắt như sau:
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng cắt đồng thời hai enzyme giới hạn (tổng thể tích 30 µl) Thành phần Thể tích(µl) Vector pTZ57R/T 5 Buffer tago 2x 6 Enzyme EcoRI 3 Enzyme BamHI 3 H2O 13
Phản ứng cắt của vector pTZ57R/T với enzyme EcoRI và BamHI được ủ ở 37oC trong 1 giờ, Sau đó sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả cắt và thu lại vector pTZ57R/T đã mở vòng bằng phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose.
• Kĩ thuật điện di trên gel Agarose
Các bước của phương pháp điện di được thực hiện như sau:
Chuẩn bị gel
- Cân 1 gam agarose cho vào 100ml dung dịch TAE 1X, đun sôi trong lò vi sóng khoảng 2-3 phút cho agarose tan hoàn toàn.
- Để gel nguội đến 50o
C-60oC, đổ gel vào khuân gel đã cài lược và để cho đến khi gel đông lại( khoảng 30-40 phút).
- Đặt bản gel vào bể điện di, đổ dung dich TAE 1X vào bể điện di sao cho ngập bản gel, sau đó rút lược ra khỏi bản gel.
Tra mẫu điện di
- Tỷ lệ tra: Trộn 1µl loading buffer với 5µl mẫu và tra vào giếng.
- Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 100V, khi vị trí của vạch màu chạy đến 2/3 bản gel thì dừng quá trình điện di.
Nhuộm gel
- Bản gel được lấy ra khỏi khay điện di và nhuộm với ethidium bromide(nồng độ 30µl/l) trong 15 phút.
- Soi và chụp ảnh bản gel bằng máy chụp ảnh gel
c) Thu nhận DNA từ gel agarose
Phương pháp thu nhận DNA trên gel làm theo hướng dẫn của bộ kit GeneJET gel Extraction bao gồm các bước sau:
- Cắt gel: Đưa bản gel điện di lên máy soi và cắt lấy băng DNA mong muốn, sau đó cho vào ống eppendorf.
- Bổ sung Binding Buffer theo tỉ lệ 1:1 với khối lượng của gel (100µl Binding buffer cho 100mg gel agarose).
- Ủ ở 55oC trong 10 phút, 2-3 phút đảo nhẹ 1 lần.
- Hút toàn bộ dung dịch gel tan ra cho vào cột lọc, ly tâm 13000v/p trong 1 phút, đổ bỏ phần dịch lỏng.
- Bổ sung 700µl Washing buffer, ly tâm 10000v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5ml, bổ sung 25µl Elution buffer vào ống eppendorf chứa cột lọc, ly tâm 10000v/p trong 1 phút, bỏ cột lọc phía trên và thu dịch phía dưới đáy ống eppendof, bảo quản ở -20o
C. - Điện di để kiểm tra sản phẩm thôi gel.
Phản ứng nối adapter với vector pTZ57R/T
• Nối đoạn adapter với vector pTZ57R/T đã được mở vòng
Phản ứng nối được thực hiện bởi T4 DNA ligase, một loại enzyme có nguồn gốc từ phage T4 , enzyme này có khả năng xúc tác phản ứng gắn nối cho cả đầu bằng và đầu dính. Thành phần phản ứng với tổng thể tích là 30µl như sau: Bảng 3.7:Thành phần phản ứng gắn nối Thành phần Thể tích(µl) Vector pTZ57R/T 5 Adapter 5 Buffer ligation 3 T4 ligase 3 H2O 14
Phản ứng nối được ủ ở 22oC trong 1 giờ sau đó sản phẩm gắn nối được biến nạp vào tế bào khả biến DH5α.
• Chọn dòng DNA tái tổ hợp bằng enzyme XcmI
Sau khi gắn nối đoạn adapter vào pTZ57R/T, tiến hành kiểm tra kết quả gắn nối xem đoạn adapter đã được gắn vào vector pTZ57R/T hay chưa bằng
enzyme XcmI. Sau đó cắt với số lượng lớn để thu T-vector sản phẩm. Thành
phần cho phản ứng cắt kiểm tra sản phẩm xen đoạn adapter vào vector pTZ57R/T bằng enzyme XcmI như sau (bảng 3.8).
Bảng 3.8: Thành phần phản ứng cắt một enzyme (tổng thể tích 30 µl) Thành phần Thể tích (µl) pTZ-adapter 5 Buffer 3 XcmI 3 H2O 13
Phản ứng cắt được ủ ở 37oC trong 1 giờ. Sau đó được điện di và phân tích kết