Để thiết kế pTUAF chúng tôi dựa trên một loại T-vector thương mại. pTZ57R/T được lựa chọn làm vector nền tảng vì vector này nhỏ gọn (2886 bp) và có đầy đủ các tính chất đặc trưng của T-vector dùng trong tách dòng TA.
Vì chúng tôi dự kiến sử dụng enzyme XcmI để tạo đầu T, do đó pTZ57R/T được kiểm tra trình tự bằng phần mềm Vector NTI. Kết quả cho thấy vector này không chứa vị trí cắt của enzyme giới hạn XcmI. pTZ57R/T được hãng Thermo Scientific cung cấp ở dạng mở vòng với 2 đầu T ở tận cùng, vì vậy để có được số lượng lớn vector này phục vụ các thao tác thiết kế pTUAF vector này cần trở thành dạng vòng. Để thực hiện việc đó, vector pTZ57R/T thương mại được thực hiện phản ứng tự gắn nối của vector và kết quả là không thu được khuẩn lạc nào (kết quả không được trình bày ở đây). Do vậy, một sản phẩm PCR chứa một lượng primer dimers nhìn thấy rõ ràng trên bản gel điện đi được sử dụng trong vai trò đoạn xen để gắn nối với vector tách dòng pTZ57R/T. Kết quả cho ra các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh, trong đó khuẩn lạc xanh có thể chứa vector pTZ57R/T tự đóng vòng hoặc gắn với một đoạn xen nhỏ có số lượng base là bội số của 3. Một khuẩn lạc có mầu xanh đậm nhất được nhân nuôi và tách plasmid. Plasmid sau khi tách chiết được cắt bằng XcmI để kiểm tra sự có mặt của enzyme này. Kết quả được thể hiện ở hình 4.1.
3000bp
Hình 4.1: A- Kết quả tạo vector pTZ57R/T dạng vòng
B- Kiểm tra vị trí cắt của enzyme XcmI trên vector pTZ57R/T
Đường chạy số 1: cắt pTZ57R/T bằng enzyme XcmI Đường chạy số 2: vector pTZ57R/T dạng vòng
Kết quả kiểm tra cho thấy trên vector pTZ57R/T không có vị trí cắt của
enzyme XcmI. Như vậy, vector pTZ57R/T đủ tiêu chuẩn để được sử dụng làm
vật liệu nghiên cứu trong đề tài.
4.1.1.2. Kết quả thiết kế adapter insilico
Hai đoạn adapter được thiết kế với độ dài 36 bp chứa hai vị trí cắt của enzyme giới hạn XcmI. Đoạn oliogonucleotid thứ nhất (F) được thiết kế với vị trí nhận biết của enzyme giới hạn EcoRI và đoạn oligonucleotid thứ hai (R) được thiết kế với trình tự nhận biết của enzyme BamHI. Kết quả thiết kế
adapter in silico được thể hiện trên hình 4.2
M 1 2
Hình 4.2. Kết quả thiết kế adapter in silico
Chú giải:
Chữ được gạch chân phía dưới là vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Gạch đỏ là vị trí cắt của enzyme XcmI
Chữ đỏ là T (Thymidine) thò ra khi cắt bằng XcmI
4.1.1.3. Lai hai đoạn oligonucleotide tạo adapter
Phản ứng lai hai đoạn oligonucleotide được tiến hành dựa trên nguyên lý hồi tính của DNA. Khi hạ nhiệt độ một cách từ từ hai đoạn DNA mạch đơn có trình tự nucleotide bổ sung sẽ bắt cặp với nhau tạo thành DNA mạch kép. Kết quả tạo adapter được thể hiện ở hình 4.3.
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm lai có màu sáng đậm hơn so với hai đoạn oligonucleotid đơn. Ngoài ra chúng tôi còn so sánh kết quả sản phẩm lai với kết quả ở đường chạy số 1 là phản ứng trộn hai đoạn oligonucleotide đơn nhưng không tiến hành phản ứng lai và kết quả cho băng có độ sáng hơn so với 2 đoạn oligonucleotide đơn nhưng không sáng bằng phản ứng được thực hiện với chu trình nhiệt ở đường chạy số 4. Vậy đoạn adapter đã được lai thành công.