a) Chọn lọc khuẩn lạc xanh trắng
Sản phẩm PCR sau khi sau khi được gắn trực tiếp vào T-vector chúng tôi tạo ra sẽ được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α khả biến bằng phương pháp sốc nhiệt. Sau khi biến nạp dịch nuôi tế bào được cấy trải trên môi trường chọn lọc LB đặc và nuôi trong tủ ấm 37oC qua đêm.
Việc chọn lọc các dòng khuẩn lạc màu trắng thường loại bỏ phần lớn các trường hợp không mong muốn, sau khi tách dòng và biến nạp xuất hiện khuẩn lạc màu xanh và khuẩn lạc màu trắng, chúng tôi chọn lọc lấy các dòng khuẩn lạc màu trắng là các dòng có khả năng mang sản phẩm tách dòng. Các dòng khuẩn lạc này được nuôi tăng sinh trong môi trường chọn lọc, tách
plasmid, tiến hành kiểm tra bằng phương pháp sàng lọc kích thước, phương pháp PCR và cắt bằng enzyme cắt giới hạn để khẳng định T-vector đã được thiết kế thành công.
b) Kiểm tra hiệu quả tách dòng bằng phản ứng PCR và cắt enzyme giới hạn Phản ứng PCR
Các khuẩn lạc trắng được chọn sau khi được tách chiết plasmid sẽ được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR nhằm kiểm tra hiệu quả tách dòng TA.
Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích là 15µl. Thành phần phản ứng PCR được trình bày trong bảng 3.10.
Bảng 3.10: Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích(µl) DNA khuôn 1 Primer 2(1F+ 1R) PCR mastermix 7,5 H2O 4,5
Trộn đều hỗn hợp sau đó chuyển vào máy PCR, nhiệt độ gắn mồi được tối ưu hóa ở 55oC trong 30 giây, phản ứng diễn ra trong 30 chu kì. Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.
Chu trình nhiệt của phản ứng được thể hiện ở hình 3.3 dưới đây.
Hình 3.3: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
95oC 5phút 95oC 45 giây 55oC 30 giây 72oC 72oC 4oC 50 giây 10 phút ∞
c)Kiểm tra tách dòng bằng cắt enzyme giới hạn.
Sản phẩm tách dòng sau khi được kiểm tra bằng phương pháp PCR sẽ tiếp tục được kiểm tra bằng phản ứng cắt với các enzyme giới hạn nhằm làm xuất hiện băng có kích thước bằng với kích thước đoạn gen chúng tôi đã chèn vào trước đó. Thành phần của phản ứng cắt kiểm tra sản phẩm tách dòng bằng
enzyme SacI và EcoRI được trình bày ở bảng 3.11.
Bảng 3.11: thành phần phản ứng cắt đồng thời với SacI và EcoRI
Thành phần Thể tích (µl) Plasmide tái tổ hợp 3 SacI 1 EcoRI 1 Buffer tango 2X 2 H2O 3 Tổng thể tích 10 3.4. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài tiến hành nghiên cứu tạo T-vector pTUAF từ vector pTZ57R/T bằng enzyme XcmI trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử & công nghệ gen – Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả
4.1.1. Kết quả thiết kế T-vector pTUAF
4.1.1.1. Kết quả lựa chọn và kiểm tra vector làm vật liệu nghiên cứu
Để thiết kế pTUAF chúng tôi dựa trên một loại T-vector thương mại. pTZ57R/T được lựa chọn làm vector nền tảng vì vector này nhỏ gọn (2886 bp) và có đầy đủ các tính chất đặc trưng của T-vector dùng trong tách dòng TA.
Vì chúng tôi dự kiến sử dụng enzyme XcmI để tạo đầu T, do đó pTZ57R/T được kiểm tra trình tự bằng phần mềm Vector NTI. Kết quả cho thấy vector này không chứa vị trí cắt của enzyme giới hạn XcmI. pTZ57R/T được hãng Thermo Scientific cung cấp ở dạng mở vòng với 2 đầu T ở tận cùng, vì vậy để có được số lượng lớn vector này phục vụ các thao tác thiết kế pTUAF vector này cần trở thành dạng vòng. Để thực hiện việc đó, vector pTZ57R/T thương mại được thực hiện phản ứng tự gắn nối của vector và kết quả là không thu được khuẩn lạc nào (kết quả không được trình bày ở đây). Do vậy, một sản phẩm PCR chứa một lượng primer dimers nhìn thấy rõ ràng trên bản gel điện đi được sử dụng trong vai trò đoạn xen để gắn nối với vector tách dòng pTZ57R/T. Kết quả cho ra các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh, trong đó khuẩn lạc xanh có thể chứa vector pTZ57R/T tự đóng vòng hoặc gắn với một đoạn xen nhỏ có số lượng base là bội số của 3. Một khuẩn lạc có mầu xanh đậm nhất được nhân nuôi và tách plasmid. Plasmid sau khi tách chiết được cắt bằng XcmI để kiểm tra sự có mặt của enzyme này. Kết quả được thể hiện ở hình 4.1.
3000bp
Hình 4.1: A- Kết quả tạo vector pTZ57R/T dạng vòng
B- Kiểm tra vị trí cắt của enzyme XcmI trên vector pTZ57R/T
Đường chạy số 1: cắt pTZ57R/T bằng enzyme XcmI Đường chạy số 2: vector pTZ57R/T dạng vòng
Kết quả kiểm tra cho thấy trên vector pTZ57R/T không có vị trí cắt của
enzyme XcmI. Như vậy, vector pTZ57R/T đủ tiêu chuẩn để được sử dụng làm
vật liệu nghiên cứu trong đề tài.
4.1.1.2. Kết quả thiết kế adapter insilico
Hai đoạn adapter được thiết kế với độ dài 36 bp chứa hai vị trí cắt của enzyme giới hạn XcmI. Đoạn oliogonucleotid thứ nhất (F) được thiết kế với vị trí nhận biết của enzyme giới hạn EcoRI và đoạn oligonucleotid thứ hai (R) được thiết kế với trình tự nhận biết của enzyme BamHI. Kết quả thiết kế
adapter in silico được thể hiện trên hình 4.2
M 1 2
Hình 4.2. Kết quả thiết kế adapter in silico
Chú giải:
Chữ được gạch chân phía dưới là vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Gạch đỏ là vị trí cắt của enzyme XcmI
Chữ đỏ là T (Thymidine) thò ra khi cắt bằng XcmI
4.1.1.3. Lai hai đoạn oligonucleotide tạo adapter
Phản ứng lai hai đoạn oligonucleotide được tiến hành dựa trên nguyên lý hồi tính của DNA. Khi hạ nhiệt độ một cách từ từ hai đoạn DNA mạch đơn có trình tự nucleotide bổ sung sẽ bắt cặp với nhau tạo thành DNA mạch kép. Kết quả tạo adapter được thể hiện ở hình 4.3.
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm lai có màu sáng đậm hơn so với hai đoạn oligonucleotid đơn. Ngoài ra chúng tôi còn so sánh kết quả sản phẩm lai với kết quả ở đường chạy số 1 là phản ứng trộn hai đoạn oligonucleotide đơn nhưng không tiến hành phản ứng lai và kết quả cho băng có độ sáng hơn so với 2 đoạn oligonucleotide đơn nhưng không sáng bằng phản ứng được thực hiện với chu trình nhiệt ở đường chạy số 4. Vậy đoạn adapter đã được lai thành công.
4.1.1.4. Kết quả gắn adapter vào vector PTZ57R/T tạo ra T-vector pTUAF a) Cắt mở vòng vector pTZ57R/T a) Cắt mở vòng vector pTZ57R/T
Vector pTZ57R/T được cắt mở vòng bằng cắt đồng thời hai enzyme
BamHI và EcoRI chuẩn bị cho phản ứng nối giữa vector và đoạn adapter. Kết quả cắt mở vòng được thể hiện ở hình 4.4.
Hình 4.3: Kết quả tạo adapter
Đường chạy 1: 100 pmoles oligonucleotid F + 100 pmoles
oligonucleotide R không lai bằng chu trình nhiệt
Đường chạy 2: 200 pmoles oligonucleotid R
Đường chạy 3: 200 pmoles oligonucleotid F
Đường chạy 4: 100 pmoles oligonucleotid F + 100 pmoles
oligonucleotide R lai bằng chu trình nhiệt
Nhìn vào hình 4.4 có thể thấy giếng cắt mở vòng tạo ra duy nhất 1 băng và có kích thước ≈ 3000bp tương đương với kích thước lý thuyết của vector pTZ57R/T. Đường chạy số 2 là vector pTZ57R/T dạng vòng đối chứng có 2 băng tương ứng với 2 cấu hình không gian khác nhau. Vậy vector pTZ57R/T đã được cắt mở vòng thành công.
b) Nối đoạn adapter vào vector pTZ57R/T và chọn lọc dòng
Đoạn adapter được nối vào vector pTZ57R/T mở vòng và biến nạp vào vi khuẩn E. coli khả biến. Chọn lọc những dòng khuẩn lạc xanh, sau đó tách chiết plasmid và tiến hành kiểm tra kết quả gắn nối bằng enzyme XcmI. Chọn khuẩn lạc màu xanh bởi vì những khuẩn lạc xanh này được sử dụng cho mục đích tách dòng. Đoạn adapter được chèn vào có trình tự nucleotide là bội số của 3 nên khi được chèn vào vector đoạn adapter không làm lệch khung đọc của gen LacZ do đó gen LacZ vẫn hoạt động bình thường và tạo ra enzyme β-
Hình 4.4: Cắt mở vòng vector pTZ57R/T Đường chạy M: ladder 10kb Đường chạy 1: pTZ57R/T cắt đồng thời với EcoRI và BamHI Đường chạy 2: Vector pTZ57R/T 3000bp M 1 2 2886bp
galactosidase kết hợp với cơ chất IPTG phân hủy Xgal có trong môi trường làm cho khuẩn lạc có màu xanh. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối vào vi khuẩn E. coli khả biến và tách plasmid được thể hiện ở hình 4.5
A B
Hình 4.5: Kết quả chọn lọc dòng và sản phẩm gắn nối adapter
A- Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối B - Kết quả tách chiết plasmid
Plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc xanh thu được trong phản ứng gắn đoạn adapter vào vector pTZ57R/T được kí hiệu là pTUAF các dòng từ 1 đến 10.
Tiếp theo, 4 dòng pTUAF 4, 5, 8 và 10 được chọn ngẫu nhiên và cắt kiểm tra bằng enzyme XcmI và kết quả được thể hiện ở hình 4.6.
Hình 4.6: Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme XcmI
Đường chạy M: Ladder 10kb
Đường chạy 1, 3, 5, 7: Các dòng pTUAF được cắt bằng XcmI
Đường chạy 2, 4, 6, 8: Các dòng pTUAF đối chứng không cắt với XcmI
Đường chạy 9: pTZ57R/T được cắt bằng XcmI
Đường chạy 10: pTZ57R/T đối chứng không cắt với XcmI
Từ kết quả hình 4.6 cho thấy khi cắt các dòng pTUAF bằng XcmI thì tạo ra 1 băng duy nhất là dạng mạch thẳng với kích thước ≈3000bp đúng như dự kiến. Các mẫu pTUAF đối chứng và các mẫu pTZ57R/T cắt và không cắt đều xuất hiện 3 băng tương ứng với các cấu hình không gian khác nhau. Như vậy, các dòng khuẩn lạc xanh đều chứa vị trí nhận biết của enzyme XcmI, hay nói cách khác đoạn adapter đã được nối vào pTZ57R/T thành công. Băng mờ phía dưới là RNA do sản phẩm plasmid được tách bằng hóa chất và không xử lý bằng enzyme Rnase
c)Kết quả tạo T-vector pTUAF bằng enzyme XcmI
Vector pTUAF dạng vòng được cắt tạo đầu T bằng enzyme XcmI. Kết quả tạo T-vector pTUAF được thể hiện ở hình 4.7.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
M 1 2
Đường chạy M: ladder 1kb
Đường chạy 1: sản phẩm T-vector
Đường chạy 2: T-vector thương mại
Hình 4.7: Kết quả tạo T-vector pTUAF
Hình 4.7 cho thấy sản phẩm T-vector pTUAF sau khi được cắt tạo đầu T và được thu nhận lại từ gel có kích thước ≈ 3000 bp tương đương với kích thước T-vector thương mại. Ngoài ra, về độ sáng của băng sản phẩm T-vector pTUAF thu được cũng gần tương đương với T-vector thương mai.
Như vậy, vector pTUAF đã được tạo ra. Tiếp theo vector này cần được ứng dụng thử nghiệm tách dòng sản phẩm PCR.
4.1.2. Kết quả ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAcloneTM
.
4.1.2.1. Kết quả gắn nối đoạn xen vào T-vector pTUAF và chọn lọc dòng
Đoạn xen sử dụng thử nghiệm T-vector pTUAF là sản phẩm PCR của
gen ech mã hóa cho enzyme enoyl coA hydratase dài 831 bp đang được thực hiện trong phòng thí nghiêm Sinh học phân tử & Công nghệ gen, Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên. Khi gắn nối 3 µl sản phẩm PCR vào 1 µl T-vector pTUAF thu được 46 khuẩn lạc trắng và 43 khuẩn lạc xanh, làm đối chứng đồng thời với T-vector của bộ KIT thương mại làm đối chứng so sánh đồng thời với T-vector của bộ kit thương mại InsTAclone. Quy trình thực hiện 3000bp
với bộ KIT là đúng hướng dẫn tiêu chuẩn của nhà sản xuất, thu được 6 khuẩn lạc trắng và 8 khuẩn lạc xanh (hình 4.8).
Hình 4.8: Kết quả chọn lọc dòng mang gen ech bằng khuẩn lạc
4.1.2.2. Kết quả sàng lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp so sánh kích thước plasmid
Kết quả tách dòng được kiểm tra bằng phương pháp sàng lọc kích thước. Theo lý thuyết điện di DNA trong gel nếu pTUAF tách dòng thành công thì plasmid tái tổ hợp sẽ mang gen ech và do đó có kích thước lớn hơn so với pTUAF tự đóng vòng. Kết quả kiểm tra được thể hiện ở hình 4.9:
pTUAF KIT Khuẩn lạc xanh Khuẩn lạc trắng
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314 15
Hình 4.9: Kết quả sàng lọc dòng bằng kích thước
Đường chạy từ 1-14: 14 dòng khuẩn lạc tách chiết sau khi sản phẩm PCR
Đường chạy 15:pTUAF đóng vòng
Kết quả trên cho thấy các dòng số 1, 2, 4, 8, 9, 11, 12, 13 và 14 vị trí băng cao hơn đối chứng pTUAF và các dòng còn lại. Do đó các dòng này có thể mang đoạn xen.
4.1.2.3. Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp PCR
Để thuyết phục hơn chúng tôi chọn một vài dòng đại diện (1, 2, 4 và 7) để kiểm bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu gen ech. Kết quả được thể hiện ở hình 4.10
Hình 4.10: Kết quả chọn lọc dòng bằng phương pháp PCR
M 1 2 4 7
831bp 1000bp
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm PCR xuất hiện 1 băng ≈ 831bp đúng như kích thước lý thuyết của gen ech ở cả 4 dòng plasmid trong 9 dòng plasmid nghi ngờ trên. Băng mờ phía dưới là hai mồi bắt cặp với nhau (primer dimmers).
4.1.2.4. Kết quả chọn lọc các dòng tái tổ hợp bằng phương pháp lập bản đồ
giới hạn
Để khẳng định chắc chắn hơn, chúng tôi tiếp tục cắt 4 dòng plasmid nói trên bằng enzyme giới hạn SacI và EcoRI. Đây là 2 vị trí nhận biết đã được treo ở đầu 2 cặp mồi nhân gen ech. Do đó, nếu plasmid tái tổ hợp chứa gen ech thì khi cắt bằng 2 enzyme giới hạn này sẽ xuất hiện 2 băng. Băng thứ nhất là pTUAF mạch thẳng có kích thước 2922 bp và băng thứ hai là gen ech có kích thước là 831 bp. Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn được thể hiện ở hình 4.11.
Hình 4.11: Kết quả cắt kiểm tra gen ech
Hình 4.11 cho thấy kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn SacI và
EcoRI tạo ra hai băng. Băng 1 có kích thước ≈ 3000bp tương ứng với kích thước lý thuyết của T-vector sản phẩm. Băng 2 có kích thước ≈831bp tương ứng với kích thước lý thuyết của gen ech. Như vậy, gen ech được tách dòng thành công.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
831 bp 3000bp
Từ các kết quả thu được chúng tôi khẳng định đã thiết kế thành công T- vector pTUAF.
4.2. Thảo luận
4.2.1. Khả năng tự đóng vòng của vector khi thiết kế 2 đầu sử dụng cùng một enzyme giới hạn.
Dựa vào phương pháp tạo T-vector của tác giả Phan Trọng Hoàng và cộng sự Viện Công nghệ Sinh học chúng tôi đã thiết kế đoạn adapter chứa hai vị trí cắt của enzyme giới hạn XcmI với hai đầu của adapter là vị trí nhận biết của enzyme BamHI (hình 4.12A). Đoạn adapter theo thiết kế được chèn vào vị trí đa tách dòng của vector pTZ57R/T đã được cắt mở vòng bằng enzyme BamHI mà không làm lệch khung đọc của gene. Trên thực tế, mặc dù đã loại bỏ gốc phosphate ở 2 đầu vector pTZ57R/T mở vòng bằng Calf-Interstinal Phosphat (CIP) để ngăn chặn khả năng tự đóng vòng, chúng tôi vẫn thất bại. Các dòng plasmid thu được đều là vector pTZ57R/T tự đóng vòng (hình 4.12B). BamHI TAGGCCAATACTTGTATGGCACCAAAGGAGTATTGG GGTTATGAACATACCGTGGTTTCCTCATAACCGGAT BamHI B
Hình 4.12: A-thiết kế adapter với hai đầu dính là trình tự nhận biết của enzyme BamHI
A
Chữ in đâm là trình tự nhận biết của enzyme XcmI
Chữđược gạch chân phía dưới là vị trí nhận biết của enzyme BamHI
Đường kẻ là vị trí cắt của enzyme XcmI
B-cắt mở vòng plasmid chứa sản phẩm gắn nối bằng enzyme XcmI
M: ladder,đường chạy 1-5: cắt bằng enzyme XcmI
Đường chạy 6: Đối chứng plasmid không cắt bằng XcmI
Đường chạy 7: vector pTZ57R/T dạng vòng
Chúng tôi thất bại với phương pháp này do khi cắt mở vòng vector pTZ57R/T bằng một enzyme sẽ tạo ra hai đầu tương thích khi đó vector có khả năng tự đóng vòng (hình 4.12). Mặc dù đã sử lý ankalyphosphat nhưng khả năng tự đóng vòng của vector vẫn cao hơn so với khi thiết kế đoạn adapter