a) Cắt mở vòng vector pTZ57R/T
Vector pTZ57R/T được cắt mở vòng bằng cắt đồng thời hai enzyme
BamHI và EcoRI chuẩn bị cho phản ứng nối giữa vector và đoạn adapter. Kết quả cắt mở vòng được thể hiện ở hình 4.4.
Hình 4.3: Kết quả tạo adapter
Đường chạy 1: 100 pmoles oligonucleotid F + 100 pmoles
oligonucleotide R không lai bằng chu trình nhiệt
Đường chạy 2: 200 pmoles oligonucleotid R
Đường chạy 3: 200 pmoles oligonucleotid F
Đường chạy 4: 100 pmoles oligonucleotid F + 100 pmoles
oligonucleotide R lai bằng chu trình nhiệt
Nhìn vào hình 4.4 có thể thấy giếng cắt mở vòng tạo ra duy nhất 1 băng và có kích thước ≈ 3000bp tương đương với kích thước lý thuyết của vector pTZ57R/T. Đường chạy số 2 là vector pTZ57R/T dạng vòng đối chứng có 2 băng tương ứng với 2 cấu hình không gian khác nhau. Vậy vector pTZ57R/T đã được cắt mở vòng thành công.
b) Nối đoạn adapter vào vector pTZ57R/T và chọn lọc dòng
Đoạn adapter được nối vào vector pTZ57R/T mở vòng và biến nạp vào vi khuẩn E. coli khả biến. Chọn lọc những dòng khuẩn lạc xanh, sau đó tách chiết plasmid và tiến hành kiểm tra kết quả gắn nối bằng enzyme XcmI. Chọn khuẩn lạc màu xanh bởi vì những khuẩn lạc xanh này được sử dụng cho mục đích tách dòng. Đoạn adapter được chèn vào có trình tự nucleotide là bội số của 3 nên khi được chèn vào vector đoạn adapter không làm lệch khung đọc của gen LacZ do đó gen LacZ vẫn hoạt động bình thường và tạo ra enzyme β-
Hình 4.4: Cắt mở vòng vector pTZ57R/T Đường chạy M: ladder 10kb Đường chạy 1: pTZ57R/T cắt đồng thời với EcoRI và BamHI Đường chạy 2: Vector pTZ57R/T 3000bp M 1 2 2886bp
galactosidase kết hợp với cơ chất IPTG phân hủy Xgal có trong môi trường làm cho khuẩn lạc có màu xanh. Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối vào vi khuẩn E. coli khả biến và tách plasmid được thể hiện ở hình 4.5
A B
Hình 4.5: Kết quả chọn lọc dòng và sản phẩm gắn nối adapter
A- Kết quả biến nạp sản phẩm gắn nối B - Kết quả tách chiết plasmid
Plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc xanh thu được trong phản ứng gắn đoạn adapter vào vector pTZ57R/T được kí hiệu là pTUAF các dòng từ 1 đến 10.
Tiếp theo, 4 dòng pTUAF 4, 5, 8 và 10 được chọn ngẫu nhiên và cắt kiểm tra bằng enzyme XcmI và kết quả được thể hiện ở hình 4.6.
Hình 4.6: Kết quả cắt kiểm tra bằng enzyme XcmI
Đường chạy M: Ladder 10kb
Đường chạy 1, 3, 5, 7: Các dòng pTUAF được cắt bằng XcmI
Đường chạy 2, 4, 6, 8: Các dòng pTUAF đối chứng không cắt với XcmI
Đường chạy 9: pTZ57R/T được cắt bằng XcmI
Đường chạy 10: pTZ57R/T đối chứng không cắt với XcmI
Từ kết quả hình 4.6 cho thấy khi cắt các dòng pTUAF bằng XcmI thì tạo ra 1 băng duy nhất là dạng mạch thẳng với kích thước ≈3000bp đúng như dự kiến. Các mẫu pTUAF đối chứng và các mẫu pTZ57R/T cắt và không cắt đều xuất hiện 3 băng tương ứng với các cấu hình không gian khác nhau. Như vậy, các dòng khuẩn lạc xanh đều chứa vị trí nhận biết của enzyme XcmI, hay nói cách khác đoạn adapter đã được nối vào pTZ57R/T thành công. Băng mờ phía dưới là RNA do sản phẩm plasmid được tách bằng hóa chất và không xử lý bằng enzyme Rnase
c)Kết quả tạo T-vector pTUAF bằng enzyme XcmI
Vector pTUAF dạng vòng được cắt tạo đầu T bằng enzyme XcmI. Kết quả tạo T-vector pTUAF được thể hiện ở hình 4.7.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
M 1 2
Đường chạy M: ladder 1kb
Đường chạy 1: sản phẩm T-vector
Đường chạy 2: T-vector thương mại
Hình 4.7: Kết quả tạo T-vector pTUAF
Hình 4.7 cho thấy sản phẩm T-vector pTUAF sau khi được cắt tạo đầu T và được thu nhận lại từ gel có kích thước ≈ 3000 bp tương đương với kích thước T-vector thương mại. Ngoài ra, về độ sáng của băng sản phẩm T-vector pTUAF thu được cũng gần tương đương với T-vector thương mai.
Như vậy, vector pTUAF đã được tạo ra. Tiếp theo vector này cần được ứng dụng thử nghiệm tách dòng sản phẩm PCR.
4.1.2. Kết quả ứng dụng T-vector pTUAF trong tách dòng TA và so sánh hiệu suất tách dòng với bộ KIT InsTAcloneTM
.