Nhân nhanh giống lan Hồ Điệp (P.Tai-Lin Red Angel) nhập nội bằng phương pháp in vitro.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐINH THỊ THỦY Tên đề tài: “NHÂN NHANH GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP (P.TAI-LIN RED ANGEL) NHẬP NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐINH THỊ THỦY Tên đề tài: “NHÂN NHANH GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP (P.TAI-LIN RED ANGEL) NHẬP NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Họ và tên : Đinh Thị Thủy Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014 Người hướng dẫn : 1. TS. Hà Thị Thúy Vi ện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam 2. Ths. Lương Thị Thu Hường Khoa CNSH & CNTP - ĐH Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS. Hà Thị Thuý, phó Viện trưởng Viện Di truyền Nông nghiệp, người đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn cô ThS. Lương Thị Thu Hường đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi thực tập và hoàn thành khoá luận. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới chị Phạm Thị Phương đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập cùng toàn thể các cô chú, anh chị làm việc tại Trạm thực nghiệm Công nghệ cao Văn Giang - Hưng Yên, trực thuộc Viện Di truyền Nông Nghiệp Việt Nam. Tôi xin gửi lời tri ân và biết ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn giảng dạy tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn hỗ trợ, giúp đỡ tôi và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 02 tháng 06 năm 2014 Sinh viên Đinh Thị Thủy DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là hạt theo phương pháp nhân giống hữu tính (sau 30 ngày ) 25 Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng theo phương pháp nhân giống vô tính (sau 90 ngày) 26 Bảng 4.3: Kết quả ảnh hưởng của Kinetin lên sự phát sinh hình thái của lát mỏng (sau 30 ngày nuôi cấy). 27 Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng của 2,4 - D lên sự phát sinh hình thái của lát mỏng (sau 30 ngày nuôi cấy). 29 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của Ki và 2,4 - D lên khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng (sau 30 ngày nuôi cấy) 30 Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của nguồn mẫu khác nhau đến sự phát sinh hình thái của lát mỏng (sau 30 ngày nuôi cấy) 32 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1: Protocorm 25 Hình 4.2: Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng đến tỷ lệ tạo chồi và tỷ lệ tạo protocorm của lan Hồ Điệp 26 Hình 4.3: Chồi hình thành từ mắt ngủ ngồng hoa non 27 Hình 4.4: Kết quả ảnh hưởng của Kinetin đến tỷ lệ tạo chồi, tỷ lệ tạo protocorm của lát mỏng (sau 4 tuần nuôi cấy) 28 Hình 4.5: Kết quả ảnh hưởng của 2,4-D đến tỷ lệ tạo chồi, tỷ lệ tạo protocorm của lát mỏng (sau 30 ngày nuôi cấy) 29 Hình 4.6: Ảnh hưởng của Ki và 2,4 - D lên tỷ lệ tạo chồi và tỷ lệ tạo protocorm của lát mỏng (sau 4 tuần nuôi cấy) 31 Hình 4.7: Kết quả ảnh hưởng của nguồn mẫu khác nhau đến sự phát sinh hình thái của lát mỏng (sau 4 tuần nuôi cấy) 32 Hình 4.8: Protocorm 33 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CT : Công thức MS : Murashinge and Skoog, 1962 Ki : Kinetine Cs : Cộng sự Đ/C : Đối chứng Nxb : Nhà xuất bản KT : Khoai tây PSHT : Phát sinh hình thái ĐTST : Điều tiết sinh trưởng 2,4-D : Acid 2,4 dichloro phenol acetic MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích nghiên cứu 2 1.3. Yêu cầu của đề tài 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 3 2.1.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 3 2.1.2. Tính toàn năng của tế bào thực vật. 3 2.1.3. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật 4 2.1.4. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 5 2.1.4.1. Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 5 2.1.4.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 6 2.1.5. Các công đoạn của nuôi cấy mô tế bào 10 2.2. Lan Hồ Điệp hoa tím đậm (P.Tailen Red Angle) 11 2.2.1. Lịch sử phát hiện lan Hồ Điệp 11 2.2.2. Đặc điểm hình thái của lan Hồ Điệp 11 2.3. Yêu cầu về hệ sinh thái 13 2.3.1. Các phương pháp nhân giống 14 2.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 15 2.3.2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 15 2.3.2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 17 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1. Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu 20 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 20 3.3. Nội dung nghiên cứu 20 3.4. Phương pháp nghiên cứu 20 3.4.1. Cách bố trí thí nghiệm 20 3.4.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 22 3.4.3. Phương pháp khử trùng mẫu cấy 23 3.5. Chỉ tiêu theo dõi 23 3.6. Xử lý số liệu 24 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25 4.1. Kết quả nghiên cứu xác định nguồn vật liệu thích hợp để đưa vào nhân giống 25 4.1.1. Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là hạt 25 4.1.2. Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng 26 4.2. Nghiên cứu cải tiến giai đoạn nhân nhanh bằng phương pháp cắt lát mỏng để gia tăng hệ số nhân 27 4.2.1. Kết quả ảnh hưởng của Kinetin lên sự phát sinh hình thái của lát mỏng (sau 4 tuần nuôi cấy) 27 4.2.2. Kết quả ảnh hưởng của 2,4 - D lên sự phát sinh hình thái của lát mỏng (sau 4 tuần nuôi cấy) 28 4.2.3. Ảnh hưởng của Ki và 2,4 - D lên khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng (sau 4 tuần nuôi cấy) 30 4.2.4. Kết quả ảnh hưởng của nguồn mẫu khác nhau đến sự phát sinh hình thái của lát mỏng 32 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 5.1. Kết luận 34 5.2. Đề nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 I. Tiếng Việt 35 II. Tiếng Anh 36 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Lan Hồ Điệp có tên khoa học Phalaenopsis Blullle, 1825. Họ phụ Vandoideae. Tông Vandeae. Có tên từ chữ Phalaina nghĩa là “con bướm” và opsis có nghĩa là “giống như”. Giống Hồ Điệp có khoảng trên 60 loài và ngày càng được lai tạo ra rất nhiều cây lai hoa rất đẹp và quý phái. Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius đặt tên là Angraecum album. Năm 1753, Linne đổi tên thành Epidendrum. Năm 1825, nhà thực vật Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis. Hồ Điệp phân bố chủ yếu ở các nước Đông Nam Á như: Malaysia, Indonesia, Philipin, phía đông Ấn Độ và Úc. Ở Việt Nam có 107 loài và 1 thứ, phân bố ở các vùng núi từ Bắc vào Nam và trên một số đảo ven biển. Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân khác nhau, đến nay nhiều loài đã bị tuyệt chủng hoặc bị đe dọa tuyệt chủng. Một số loài nằm trong danh lục Đỏ của “ Sách đỏ Việt Nam”. Ở Việt Nam cũng có một số loài vì có hoa nhỏ nên được gọi là tiểu Hồ Điệp (Phalaenopsis manni, gibbosa, lobbi, fuscata, cornucervi). Hồ Điệp có thể mọc ở khí hậu nhiệt đới và đồi núi cao 2000m nên vừa chịu được khí hậu nóng ẩm vừa chịu được khí hậu mát. Các loài này đều có hoa nhỏ nhưng màu sắc đẹp, cấu trúc kỳ diệu, rất dễ thương và có hương thơm nên hấp dẫn đối với giới sưu tầm lan rừng nguyên thủy. Đây cũng là nguồn gen quý để phát triển công nghệ lai tạo hoa lan Việt Nam. Tuy nhiên, Hồ Điệp là loài lan khó nhân giống, hiện tại chỉ có một số cơ sở trường Đại học, Viện nghiên cứu có hướng phát triển trên những kĩ thuật mới như: Kỹ thuật nuôi cấy quang tự dưỡng, Bioreactor… nhưng vẫn chưa đưa ra áp dụng rộng rãi. Công nghệ nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là một trong những phương pháp nhân giống vô tính với những ưu điểm nổi trội là: Cho hệ số nhân giống rất cao, sản xuất quanh năm không phụ thuộc vào mùa vụ, cần ít diện tích sản xuất và vật liệu nhân giống ban đầu, cây giống sản xuất hoàn toàn sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền (Nguyễn Quang Thạch, 1995)[12], việc vận chuyển cây giống đi xa thuận tiện, tổn thất ít, chất lượng cây được đảm bảo do đó đáp ứng được các yêu cầu về sản xuất cây giống với số lượng mang tính công nghiệp. 2 Trên cơ sở đó tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nhân nhanh giống lan Hồ Điệp (P.Tai-Lin Red Angel) nhập nội bằng phương pháp in vitro”. 1.2. Mục đích nghiên cứu Hoàn thiện các khâu kỹ thuật nhân giống in vitro cho cây lan Hồ Điệp, từ lựa chọn vật liệu đưa vào nuôi cấy, cải tiến phương pháp khử trùng đến cải tiến phương pháp nhân nhanh và môi trường nhân nhanh để gia tăng hệ số nhân và chất lượng cây hình thành. Trên cơ sở các biện pháp kỹ thuật, tìm ra quy trình phù hợp ứng dụng trong sản xuất giống hoa lan Hồ điệp có chất lượng, góp phần phát triển cây lan Hồ điệp giúp các cơ sở sản xuất kinh doanh áp dụng tiến bộ kỹ thuật một cách khoa học và có hiệu quả nhất. 1.3. Yêu cầu của đề tài - Xác định được nguồn vật liệu thích hợp để đưa vào nhân giống. - Cải tiến môi trường nuôi cấy khởi động tái sinh mẫu để gia tăng nguồn mẫu ban đầu. - Cải tiến môi trường nhân nhanh để gia tăng hệ số nhân. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài * Ý nghĩa khoa học - Thông qua đề tài, tìm hiểu được vai trò của một số chất kích thích sinh trưởng đối với quá trình tái sinh, nhân nhanh của cây lan Hồ Điệp. - Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng. * Ý nghĩa thực tiễn sản xuất Sản xuất được cây con sinh trưởng, phát triển tốt, đồng đều và sạch bệnh với khối lượng lớn. Thuận tiện cho việc áp dụng các biện pháp kỹ thuật trong giai đoạn sản xuất hoa thương phẩm, giảm được giá thành, từ đó kích thích sản xuất hoa phát triển. [...]... phát hoa lan Hồ điệp Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan Hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) bằng phương pháp in vitro” được tiến hành tại phòng di truyền và chọn giống - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam CN.Sinh học Đặng Thị Ánh Tuyết (2009), đề tài nghiên cứu “Ứng dụng phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh để nhân nhanh giống lan Hồ điệp (Phalaenopsis... Xuân Bình và cs, 2003)[10] 2.2 Lan Hồ Điệp hoa tím đậm (P.Tailen Red Angle) 2.2.1 Lịch sử phát hiện lan Hồ Điệp Lan Hồ Điệp có tên khoa học là Phalaenopsis sp, là loại lan có hoa lớn, đẹp, bền Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, không thua kém giống lan nào khác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại lan Hồ Điệp có sọc nằm ngang hoặc thẳng đứng hoặc có đốm to hay nhỏ Giống Phalaenopsis có khoảng 70... 2004)[29] 2.3.1 Các phương pháp nhân giống *Phương pháp nhân giống truyền thống 15 Nhân giống bằng phương pháp tách bụi Thường được sử dụng cho các giống lan đa thân Cattleya, Bendrobium, Cymbidium, và những giống tương tự : ở mỗi gốc giả hành có ít nhất một chồi ngủ, mỗi gốc giả hành đó là một đơn vị để trồng Ưu điểm: dễ làm, nhanh, cây giữ được các dặc tính quý của cây mẹ Nhược điểm: hệ số nhân không cao,... thành thể giống protocorm (PLB) và khả năng tái sinh cây con Đối với các loài lan, đã nuôi cấy thành công trên quy mô công nghiệp loài Phalaenopsis và Dendrobium thông qua hệ thống bioreactor(Young, 2000)[42], ( Chung, 2005)[28] Năm 1949, ông Rotor là người đầu tiên nhân giống lan Hồ Điệp bằng cách sử dụng cành phát hoa Và được coi là phương pháp chính để nhân giống vô tính lan hồ điệp Phương pháp này... các auxin được hòa tan hoặc trong ethanol hoặc trong NaOH loãng -Cytokinin ( Dương Công Kiên, 2002)[3] : Các cytokinin là dẫn xuất của adenine, đây là những hormone liên quan chủ yếu đến sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy mô Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là 6-benzylaminopurine (BAP) hoặc kinetin, và zeatin Zeatin và 2-iP là các cytokinin tự nhiên,... hoa do làm không đúng kỹ thuật Nhân giống bằng phương pháp giâm cành Là các chồi “ mắt ngủ” có thể sản xuất ra một hoặc nhiều cây trong điều kiện thích hợp Ưu điểm: Hệ số nhân giống cao, cây con sẽ giữ lại được những đặc tính quý giá của cây mẹ Nhược điểm: Rất tốn thời gian Nhân giống bằng phương pháp gieo hạt Là phương pháp lấy hạt giống cho nảy mầm thành cây con, hạt giống được thu từ quả đã chín... TÀI LIỆU 2.1 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.1.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nhân giống vô tính là hình thức nhân giống thông qua các cơ quan dinh dưỡng (thân, lá, vỏ, củ,…) bao gồm các phương pháp giâm cành, chiết cành, mắt ghép và nuôi cấy in vitro Trong đó nuôi cấy in vitro được coi là phương pháp hữu hiệu nhất Nhân giống vô tính in vitro được tiến hành trên nguyên... trường tốt nhất cho việc tái sinh lan Hồ Điệp từ phôi là môi trường VW + 30 g/ l khoai tây + 1g / l than hoạt tính Theo Cung Hoàng Phi Phượng và cs (2007)[1] sử dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời sẽ cung cấp chất dinh dưỡng và không khí cho các mô sẹo một cách chủ động Cũng nhờ đó hệ số nhân giống cây cao gấp 5-6 lần so với cách nhân giống lan Hồ Điệp bằng phương pháp sinh sản vô tính Trong môi... tạo ra từ hạt và là dị hợp tử Tuy nhiên, khi nhân giống bằng hạt, cây con thu được sẽ không đồng nhất về mặt di 16 truyền, nhất là sự phân ly tính trạng màu sắc hoa Đã có nhiều phương pháp vi nhân giống lan hồ điệp như nuôi cấy cuống hoa với chồi nách, mô phân sinh, đỉnh chồi của chồi cuống hoa, đốt cuống hoa, đoạn cắt lá và chóp rễ Tuy nhiên các phương pháp này chưa ứng dụng rộng rãi trong sản xuất... cytokinin tự nhiên, còn BA và kinetin là các cytokinin nhân tạo Nói chung, chúng được hòa tan trong NaOH hoặc HCl loãng Cytokinin liên quan tới sự phân chia tế bào, phân hóa chồi v.v… Trong môi trường nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào và phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo phôi vô tính, tăng cường phát sinh chồi phụ - Gibberellin : Gibberellin được phát hiện vào những . NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ĐINH THỊ THỦY Tên đề tài: “NHÂN NHANH GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP (P. TAI-LIN RED ANGEL) NHẬP NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI. xuất cây giống với số lượng mang tính công nghiệp. 2 Trên cơ sở đó tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nhân nhanh giống lan Hồ Điệp (P. Tai-Lin Red Angel) nhập nội bằng phương pháp in vitro Tên đề tài: “NHÂN NHANH GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP (P. TAI-LIN RED ANGEL) NHẬP NỘI BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Họ và tên : Đinh Thị Thủy Hệ đào tạo :