Nghiên cứu nhân giống tam thất gừng (stahlianthus thorelii gagnep) bằng nuôi cấy in vitro

1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG KIM THÀNH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG TAM THẤT GỪNG (Stahlianthus thorelii Gagnep)BẰNG NUÔI CẤYIN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : Công nghệ sinh học và Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên - 2014 2 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG KIM THÀNH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG TAM THẤT GỪNG (Stahlianthus thorelii Gagnep)BẰNG NUÔI CẤYIN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 - 2014 Người hướng dẫn : 1. TS. Nguyễn Văn Duy (Khoa CNSH - CNTP – ĐH Nông Lâm Thái Nguyên) 2. ThS. Trần Đình Quang (Khoa CNSH - CNTP – ĐH Nông Lâm Thái Nguyên) Thái Nguyên - 2014 3 LỜI CẢM ƠN Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trong thời gian thực tập tốt nghiệp tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nhân giống tam thất gừng (Stahlianthus thorelii Gagnep) bằng nuôi cấy in vitro”. Sau 6 tháng thực tập tại phòng nuôi cấy mô Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đến nay tôi đã hoàn thành đề tài. Để đạt được kết quả như ngày hôm nay tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô giáo trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Văn Duy và ThS. Trần Đình Quang đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với những đóng góp và hướng dẫn quý báu của KS. Lã Văn Hiền trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Do trình độ và thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Tôi rất mong nhận được sự đóng góp các thầy cô và các bạn để đề tài của tôi được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 6 năm 2014 Sinh viên thực hiện Hoàng Kim Thành 4 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Diện tích trồng cây dược liệu ở một số quốc gia trên thế giới giai đoạn 1990 - 2001 8 Bảng 2.2. Tình hình xuất, nhập khẩu cây thuốc của EU và thế giới giai đoạn 1998 - 2002 8 Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu (sau 7 ngày nuôi cấy) 24 Bảng 4.2. Kết quả của phương pháp cắt mẫu đến khả năng tái sinh chồi(sau 20 ngày nuôi cấy) 25 Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng cảm ứng chồi(sau 20 ngày nuôi cấy) 27 Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân nhanh chồi (sau 30 ngày nuôi cấy) 28 Bảng 4.5. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp NAA và kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi (sau 30 ngày nuôi cấy) 30 Bảng 4.6. Kết quả ảnh hưởng của BA kết hợp NAA và TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi (sau 30 ngày nuôi cấy) 31 Bảng 4.7. Kết quả ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (BA, kinetin, NAA và TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi 33 Bảng 4.8. Kết quả ảnh hưởng của GA 3 đến khả năng kéo dài chồi(sau 30 ngày nuôi cấy) 33 Bảng 4.9. Kết quả ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con (sau 20 ngày) 34 5 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 2.1. Hình ảnh khái quát về tam thất gừng [4] 5 Hình 2.2. Tam thất gừng 5 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình tái sinh cây tam thất gừng in vitro của Sharma G.J. và cs 17 Hình 4.1. Kết quả phương pháp cắt mẫu đến khả năng tái sinh chồi(sau 20 ngày nuôi cấy) 26 Hình 4.2. Kết quả cảm ứng chồi (sau 20 ngày nuôi cấy) 27 Hình 4.3. Kết quả nhân nhanh chồi sau 30 ngày nuôi cấy 29 Hình 4.4. Kết quả nhân nhanh chồi (sau 30 ngày nuôi cấy) 31 Hình 4.5. Kết quả nhân nhanh chồi (sau 30 ngày nuôi cấy) 32 Hình 4.6. Kết quả kéo dài chồi (sau 30 ngày nuôi cấy) 34 Hình 4.7. Cây con trồng trong giá thể đất + trấu (2:1) (sau 20 ngày nuôi cấy) 35 6 DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT STT Từ và thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ 1 BA : 6 - Benzyl Adenine 2 BAP : 6 - Benzyl Amino Purine 3 Ca : Calcium 4 Cs : Cộng sự 5 CT : Công thức 6 CV : Coeficient of Variation 7 DNA : Deoxyribonucleic Acid 8 Đ/c : Đối chứng 9 EU : European Union 10 Fe : Ferrum 11 GA 3 : Gibberellic Acid 12 Ha : Hecta 13 IAA : Indole-3-Acetic Acid 14 IBA : β – Indol Butyric Acid 15 LSD : Least Singnificant Diference Test 16 MS : Murashige & Skoog (1962) 17 NAA : α -Napthalene Acetic Acid 18 TDZ : Thidiazuron 19 TP.HCM : Thành phố Hồ Chí Minh 20 W/V : Weight/volume 21 WHO : World Health Organization 7 MỤC LỤC Phần 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích nghiên cứu 2 1.3. Yêu cầu của đề tài 2 1.4. Ý nghĩa của đề tài 2 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Giới thiệu về tam thất gừng 4 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại 4 2.1.2. Đặc điểm hình thái tam thất gừng 5 2.2. Giá trị của tam thất gừng 6 2.2.1. Giá trị kinh tế 6 2.2.2. Giá trị dược liệu 7 2.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây dược liệu trên thế giới và Việt Nam 7 2.3.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây dược liệu trên thế giới 7 2.3.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cây dược liệu ở Việt Nam 9 2.4. Các phương pháp nhân giống tam thất gừng 9 2.5. Cơ sở khoa học của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào 10 2.5.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật 10 2.5.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 11 2.6. Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 2.6.1. Giai đoạn chuẩn bị 11 2.6.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy 12 2.6.3. giai đoạn nhân nhanh chồi 12 2.6.4. Tạo cây hoàn chỉnh 12 2.6.5. Giai đoạn đưa cây ra đất 13 2.7. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro một số cây thuộc họ gừng trên thế giới và Việt Nam 13 2.7.1. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro một số cây thuộc họ gừng trên thế giới 13 2.7.2. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro một số cây thuộc họ gừng tại Việt Nam 15 Phần 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1. Vật liệu nghiên cứu 16 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16 8 3.3. Hóa chất và thiết bị 16 3.4. Nội dung nghiên cứu 16 3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu 16 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp cắt mẫu đến khả năng tái sinh chồi 16 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng cảm ứng chồi 16 3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (BA, kinetin, NAA và TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi 16 3.4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của GA 3 đến khả năng kéo dài chồi sau khi tái sinh từ củ 17 3.4.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro 17 3.5. Phương pháp nghiên cứu 17 3.5.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu 17 3.5.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp cắt mẫu đến khả năng tái sinh chồi 19 3.5.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng cảm ứng chồi 19 3.5.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (BA, kinetin, NAA và TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi 20 3.5.5. Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của GA 3 đến khả năng kéo dài chồi sau khi tái sinh từ củ 22 3.5.6. Nội dung 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro 23 3.6. Xử lý số liệu 23 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2 0,1%đến khả năng vô trùng mẫu 24 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp cắt mẫu đến khả năng tái sinh chồi 25 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng cảm ứng chồi 26 4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (BA, kinetin, NAA và TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi 28 4.4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi 28 9 4.4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp NAA và kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi 30 4.4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp NAA và TDZ đến khả năng nhân nhanh chồi 31 4.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của GA 3 đến khả năng kéo dài chồi 33 4.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con 34 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 5.1. Kết luận 36 5.2. Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Tam thất gừng (tên khoa học là Stahlianthus thorelii Gagnep) hay Khương tam thất, phân bố ở một số tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, phía Nam Trung Quốc và Ấn Độ có độ cao từ 1200 - 1500m. Ở Việt Nam, tam thất được trồng ở một số tỉnh với một lượng nhỏ như: Hà Giang, Lào Cai, Cao Bằng…. [8],[14]. Trong đó, tam thất gừng là một loài thuộc họ gừng (Zingiberaceae) mang những đặc điểm chung của họ gừng. đồng thời, tam thất gừng còn có những đặc điểm riêng biệt: Cây có nhiều củ nhỏ bằng quả trứng chim xếp thành chuỗi, có rễ con dạng sợi, lá mọc rời từ 3 - 5 cái, phiến lá thuôn dài, chóp nhọn, màu lục, pha nâu hay nâu tím [8],[24]. Tam thất gừng là một loại thảo dược có giá trị cao chứa thành phần chủ yếu là tinh dầu, chúng được có mặt trong nhiều loại cây dược liệu như: Gừng gió, nghệ, nghệ đen,… [32],[40],[41]. Ngoài ra còn chứa một số acid amin thiết yếu (leucin, isoleucin, valin, histidin,…) và các chất vô cơ như Fe, Ca [25]. Tam thất gừng có vị cay, hơi đắng, tính ấm nên trong dân gian người ta sử dụng để chữa đòn ngã sưng đau, phong nhức xương khớp, thổ huyết, chảy máu cam, kinh nguyệt không ổn định, trùng độc cắn và rắn cắn,…[5],[25]. Hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng nhu cầu sản xuất thuốc từ dược liệu ngày càng lớn dẫn đến tình trạng khai thác quá mức nguồn dược liệu trong tự nhiên. Việc nuôi trồng cây tam thất chủ yếu là tự phát chưa có kế hoạch tổng thể và quy hoạch vùng sản xuất [10]. Trong đó, phương pháp nuôi trồng cây tam thất gừng chủ yếu hiện nay là giâm hom chồi củ hoặc gieo từ hạt. Số lượng cây giống được tạo ra từ phương pháp này còn hạn chế, khả năng nhân lên còn thấp và phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh [10]. Nuôi cấy in vitro được xem như là phương pháp hiệu quả cao trong nhân giống và cải thiện các loài thực vật, trong đó bao gồm cả cây tam thất gừng. Vì vậy, hiện nay công tác nghiên cứu đặc điểm hình thái, tách chiết hợp chất có ích và nhân giống để góp phần xóa đói giảm nghèo vùng cao, duy trì đa dạng sinh học và phát triển cây dược liệu đang được tập trung nghiên cứu như nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi, 2004 [14], Đặng Ngọc Hùng, 2013 [10], Trần Thị Tý và cs [...]... cây con in vitro 3.5 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tam thất gừng được dựa trên kết quả nghiên cứu của Sharma G.J và cs [44] Khái quát quy trình được thể hiện trong hình 3.1 Củ tam thất Cảm ứng chồi Kéo dài chồi Ra rễ Ra cây Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tái sinh cây tam thất gừng in vitro của Sharma G.J và cs 3.5.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2... (2010) [37] Trên đây là cơ sở để chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu nhân giống tam thất gừng (Stahlianthus thorelii Gagnep) bằng nuôi cấy in vitro 1.2 Mục đích nghiên cứu Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tái sinh cây tam thất gừng ở Việt Nam 1.3 Yêu cầu của đề tài - Xác định được ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng 0,1%đến khả năng vô trùng mẫu - Xác định được... chồi Đặng Ngọc Phúc (2011)[15] khi nghiên cứu nhân giống in vitro từ đỉnh sinh trưởng và đoạn thân cây sa nhân tím cho thấy hệ số nhân nhanh chồi tốt nhất là 7,40 chồi/mẫu Shahinozzaman M và cs (2013)[43] nghiên cứu nhân giống in vitro trên cây nghệ đen hệ số nhân giống trung bình tốt nhất đạt 10,17±1,89 chồi 2.5 Cơ sở khoa học của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô tế bào 2.5.1 Tính toàn năng của... Sâm Ngọc Linh bằng Cồn 70% trong 30s và HgCl2 trong 5 phút thu được tỷ lệ mẫu sạch cao 2.6.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy Nayak S và cs (2011) [38] nghiên cứu nhân giống cây riềng in vitro cho thấy:... giới và Việt Nam 2.7.1 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro một số cây thuộc họ gừng trên thế giới Thông thường tam thất gừng và hầu hết các cây thuộc họ gừng có thể được nhân giống bằng cách gieo hạt hoặc tách chồi củ từ cây mẹ [10] Tuy nhiên, các phương pháp này cho hiệu quả nhân giống thấp không đáp ứng được nhu cầu của thị trường [28] Vì vậy, phương pháp nuôi cấy in vitro cho phép tạo ra một lượng... quả nghiên cứu của đề tài xác định được một số yếu tố đến tái sinh tạo cây tam thấtgừngin vitro hoàn chỉnh phục vụ cho công tác nhân giống, duy trìvà phát triển tam thất gừng, một cây dược liệu có giá trị 4 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về tam thất gừng 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 2.1.1.1 Nguồn gốc Họ gừng (Zingiberaceae) có nhiều chi và gồm nhiều loài khác nhau Hầu hết các cây thuộc họ gừng. .. tách chiết thông thường: Tam thất gừng là cây sống lâu năm với các thân rễ bò ngang hay tạo củ Cây có thể được nhân lên từ hạt hoặc từ thân rễ, tuy nhiên hiệu quả nhân giống tam thất gừng chưa có nhiều tài liệu khoa học công bố.Nguyễn Văn Tập (2011)[19] công bố kết quả nghiên cứu phương pháp nhân giống sa nhân tím từ nhánh dinh dưỡng và từ hạt Kết quả nghiên cứu trên nhánh dinh dưỡng bao gồm nhánh non,... khả năng sinh trưởng và phát triển sa nhân tím - Phương pháp nuôi cấy in vitro: Là phương pháp duy nhất hiện nay có thể nhân giống tam thất trên quy mô công nghiệp, cây con được sản xuất hoàn toàn giống nhau từ một cây bố mẹ So với phương pháp thông thường thì một cây mẹ một năm có thể cho ra 12 - 13 củ giống thì phương pháp nuôi cấy in vitro có thể cho ra hàng triệu cây/năm với hệ số nhân giống từ... Myanmar, Cam-pu-chia, Ma-lay-xi-a, In- đô-nê-xi-a [14] 2.2 Giá trị của tam thất gừng 2.2.1 Giá trị kinh tế Nhờ có giá trị dược liệu nên tam thất gừng đã được nuôi trồng và bán trên thị trường Một số đơn thuốc dân gian có tam thất gừng như Lê Trần Đức (1997)[8], Đỗ Tất Lợi (2004)[14]: - Chữa đau bụng kinh, ra kinh nguyệt quá nhiều, đau nhức mình mẩy sau khi sinh + Tam thất gừng ngày dùng 6 - 10g, sử dụng... năng nhân nhanh chồi - Xác định được ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi sau khi tái sinh từ củ - Xác định được ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro 1.4 Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học: + Bước đầu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô cây tam thất gừng bằng phương pháp in vitro 3 + Cung cấp tài liệu học tập và nghiên cứu cho sinh viên, giúp sinh . cơ sở để chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu nhân giống tam thất gừng (Stahlianthus thorelii Gagnep) bằng nuôi cấy in vitro . 1.2. Mục đích nghiên cứu Bước đầu khảo sát ảnh. nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trong thời gian thực tập tốt nghiệp tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu nhân giống tam thất gừng (Stahlianthus thorelii Gagnep) bằng nuôi cấy in vitro tài: NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG TAM THẤT GỪNG (Stahlianthus thorelii Gagnep)BẰNG NUÔI CẤYIN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh