- Địa điểm: Phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
- Thời gian: Từ 12/2013 - 06/2014.
3.3. Hóa chất và thiết bị
- Hóa chất: Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962); các chất điều hòa sinh trưởng: BAP (Duchefa), IAA (Sigma), GA3 (Duchefa), IBA (Sigma), NAA (Sigma); Các chất khử trùng: Cồn, HgCl2;....
- Các trang thiết bị máy móc dùng cho thí nghiệm bao gồm: Cân điện tử
(Olhous- Vietlabcu), nồi hấp khử trùng (ALP), tủ sấy (Memmert), tủ cấy vô trùng cấp II (Airtech), máy chuẩn pH (Hanna HI2210), máy ảnh Canon IXUS 115HS, tủ
lạnh (Sanyo), pank, dao, kéo, ống falcon,…
Ngoài ra còn có các trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm - Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm.
3.4. Nội dung nghiên cứu
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả
năng vô trùng mẫu
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp cắt mẫu đến khả năng tái sinh chồi 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng cảm ứng chồi
3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (BA, kinetin, NAA và TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi
- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp NAA và kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA và TDZ đến khả năng nhân
nhanh chồi.
3.4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3đến khả năng kéo dài chồi sau khi tái sinh từ củ
3.4.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thểđến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro
3.5. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu nhân giống in vitro cây tam thất gừng được dựa trên kết quả
nghiên cứu của Sharma G.J. và cs [44]. Khái quát quy trình được thể hiện trong hình 3.1. Củ tam thất Cảm ứng chồi Kéo dài chồi Ra rễ Ra cây
Hình 3.1. Sơđồ quy trình tái sinh cây tam thất gừng in vitro của Sharma G.J. và cs
3.5.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến khả năng vô trùng mẫu
Củ tam thất gừng được rửa sạch bằng nước máy để loại bỏđất và bụi bẩn. Sau
đó rửa mẫu bằng xà phòng loãng, rửa sạch mẫu dưới vòi nước máy để loại bỏ hết xà phòng và bụi bẩn còn lại bám trên mẫu. Tiếp theo, mẫu sẽđược khử trùng bằng cồn 70% trong 2 - 3 phút, tráng sạch bằng nước cất vô trùng từ 3 - 4 lần. Sau đó, tiến hành các thí nghiệm sau nhằm hoàn thiện quy trình tái sinh cây tam thất gừng:
CT 1: Mẫu được khử trùng HgCl2 0,1mg/l trong vòng 4 phút. CT 2: Mẫu được khử trùng HgCl2 0,1mg/l trong vòng 6 phút. CT 3: Mẫu được khử trùng HgCl2 0,1mg/l trong vòng 8 phút. CT 4: Mẫu được khử trùng HgCl2 0,1mg/l trong vòng 10 phút. CT 5: Mẫu được khử trùng HgCl2 0,1mg/l trong vòng 12 phút. Khử trùng mẫu:Mẫu đã rửa sạch bằng cồn 70% sẽ được khử trùng bằng HgCl20,1mg/l ở các khoảng thời gian khác nhau (thí nghiệm 1). Sau đó, rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 - 7 lần. Ngâm mẫu trong nước cất khoảng 5 phút.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, cấy 15 mẫu cho mỗi công thức. Tiến hành theo dõi và đánh giá sau 7 ngày nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ mẫu vô trùng: Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm (%) = Số mẫu không bị nhiễm x 100 Tổng số mẫu cấy - Tỷ lệ mẫu sống bị nhiễm: Tỷ lệ mẫu sống bị nhiễm (%) = Tổng số mẫu sống bị nhiễm x 100 Tổng số mẫu cấy - Tỷ lệ mẫu chết: Tỷ lệ mẫu chết (%) = Số mẫu chết x 100 Tổng số mẫu cấy
3.5.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp cắt mẫu đến khả
năng tái sinh chồi
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp cắt mẫu đến khả năng tái sinh chồi
Cách tiến hành: Mẫu sau khi khử trùng xong để trên giấy thấm, dùng pank kẹp và dao số 11 cắt tỉa phần vỏ cứng bên ngoài nhằm tạo mẫu nhỏ gọn, dễ thao tác. Tiến hành thao tác với mẫu theo công thức ở thí nghiệm 2. Riêng đối với mẫu cắt thành 1/2 và 1/4, củ tam thất gừng được bổ dọc và tiến hành theo yêu cầu của từng công thức và cấy mẫu vào bình chứa sẵn môi trường nuôi cấy MS. Sau đó, tiến hành thí nghiệm theo các công thức sau:
CT 1: Để nguyên mẫu củ. CT 2: Cắt 1/2 mẫu củ. CT 3: Cắt 1/4 mẫu củ.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, cấy 15 mẫu cho mỗi công thức.Tiến hành theo dõi và đánh giá sau 20 ngày nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi: - Sức sống của mẫu - Tỷ lệ mẫu nảy chồi: Tỷ lệ nảy chồi = Số mẫu nảy chồi x 100 (%) Tổng số mẫu cấy
3.5.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng cảm ứng chồi
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng cảm ứng chồi
Cách tiến hành:
1 lít môi trường MS cơ bản được hấp vô trùng được chia nhỏ ra 5 bình tam giác,mỗi bình 200ml. Sau đó bổ sung BA (theo thí nghiệm 3), mỗi bình 200ml đổ ra 5 bình trụ, để khô. Tiếp theo đó cấy 1 mẫu/1 bình trụ.
CT 1(đ/c): Môi trường nền + BA 0,0mg/l. CT 2: Môi trường nền + BA 0,5mg/l. CT 3: Môi trường nền + BA 1,0mg/l. CT 4: Môi trường nền + BA 2,0mg/l. CT 5: Môi trường nền + BA 5,0mg/l.
Môi trường nền: Môi trường MS + agar 5,4g/l + đường 30g/l. Trong tất cả các công thức độ pH của môi trường là 5,6 - 5,8.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, cấy 15 mẫu cho mỗi công thức. Theo dõi kết quả sau 20 ngày nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi: - Chất lượng chồi - Số lượng chồi:
Tỷ lệ nảy chồi = Số chồi thu được
x 100 (%) Tổng số mẫu cấy
3.5.4. Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất kích thích sinh trưởng (BA, kinetin, NAA và TDZ) đến khả năng nhân nhanh chồi
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
Cách tiến hành:
Các chồi tạo thành có chiều cao từ 1,5 - 2cm sau 20 ngày nuôi cấy được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh bao gồm: Nồng độ BA tốt nhất từ thí nghiệm 3, NAA ở các nồng độ khác nhau (theo thí nghiệm 4). Sau khi cấy chuyển, mẫu
được đưa vào phòng nuôi cấy có nhiệt độ từ 23 - 25oC với cường độ ánh sáng từ
2000 - 2500lux.
CT 1(đ/c): Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + NAA 0,0mg/l. CT 2: Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + NAA 0,3mg/l.
CT 3: Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + NAA 0,5mg/l. CT 4: Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + NAA 1,0mg/l. CT 5: Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + NAA 1,5mg/l.
Môi trường nền: Môi trường MS + agar 5,4g/l + đường 30g/l. Trong tất cả các công thức độ pH của môi trường là 5,6 - 5,8.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, cấy 15 mẫu cho mỗi công thức, Tiến hành theo dõi và đánh giá sau 30 ngày nuôi cấy.
Chỉ tiêu theo dõi: - Tổng số chồi thu được - Chất lượng chồi - Hệ số nhân chồi: Hệ số nhân chồi (lần) = Tổng số chồi thu được Tổng số chồi đưa vào
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp NAA và kinetin đến khả
năng nhân nhanh chồi
Cách tiến hành, bố trí thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi giống thí nghiệm 4.tiến hành theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy.
CT 1(đ/c): Môi trường nền + BA 5,0 mg/l+ Kinetin 0,5mg/l + NAA 0,0mg/l. CT 2: Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + Kinetin 0,5mg/l + NAA 0,3mg/l. CT 3: Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + Kinetin 0,5mg/l + NAA 0,5mg/l. CT 4: Môi trường nền + BA 5,0mg/l + Kinetin 0,5mg/l + NAA 1,0mg/l. CT 5: Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + Kinetin0,5mg/l + NAA 1,5mg/l. Môi trường nền: Môi trường MS + agar 5,4g/l + đường 30g/l.
Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA kết hợp NAA và TDZ đến khả
năng nhân nhanh chồi
CT 1(đ/c): Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + TDZ0,5mg/l + NAA 0,0mg/l. CT 2: Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + TDZ 0,5mg/l + NAA 0,3mg/l. CT 3: Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + TDZ0,5mg/l + NAA 0,5mg/l. CT 4: Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + TDZ 0,5mg/l + NAA 1,0mg/l. CT 5: Môi trường nền + BA 5,0 mg/l + TDZ0,5mg/l+ NAA 1,5mg/l. Môi trường nền: Môi trường MS + agar 5,4g/l + đường 30g/l.
Trong tất cả các công thức độ pH của môi trường là 5,6 - 5,8.
Cách tiến hành, bố trí thí nghiệm và chỉ tiêu theo dõi giống thí nghiệm 4.
3.5.5. Nội dung 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi sau khi tái sinh từ củ
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồisau khi tái sinh từ củ
CT 1(đ/c): Môi trường nền + GA30,0mg/l. CT 2: Môi trường nền + GA30,5mg/l. CT 3: Môi trường nền + GA3 1,0mg/l. CT 4: Môi trường nền + GA3 1,5mg/l. CT 5: Môi trường nền + GA3 2,0mg/l.
Môi trường nền: Môi trường MS + agar 5,4g/l + đường 30g/l. Trong tất cả các công thức độ pH của môi trường là 5,6 - 5,8.
Cách tiến hành: Cụm chồi được hình thành từ môi trường nhân nhanh sẽ được cắt ra thành từng chồi riêng biệt. Sau đó được cấy chuyển sang môi trường kéo dài chồi có bổ sung GA3 (theo thí nghiệm 6) để nghiên cứu khả năng kéo dài chồi cây tam thất gừng. Tiến hành theo dõi và đánh giá sau 30 ngày nuôi cấy.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, cấy 15 mẫu cho mỗi công thức.
Chỉ tiêu theo dõi: - Chất lượng chồi. - Chiều dài chồi (cm):
Chiều cao trung bình của chồi (cm) =
Số chồi thu được Tổng số chồi ban đầu
3.5.6. Nội dung 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thểđến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thểđến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro
CT1: Đất
CT2: Đất + cát (2:1) CT3: Đất + trấu (2:1)
Cây con in vitrohoàn chỉnh có chiều cao khoảng 3,0 - 4,0cm với 2 - 4 lá, sau khi
được huấn luyện thích nghi với thay đổi nhiệt độ, độẩm, sự mất nước được trồng trực tiếp trên 3 loại giá thể khác nhau: Đất; Đất + cát (2:1); Đất + trấu (2:1). Tiến hành
đánh giá sau 20 ngày chăm sóc. Chỉ tiêu theo dõi:
- Số cây sống - Tỷ lệ sống: Tỷ lệ sống (%) = Số cây sống x 100 Tổng số cây đem trồng 3.6. Xử lý số liệu
Các số liệu thu thập được thống kê và xử lý theo phương pháp thống kê toán học bằng phần mềm Excel 2003 và phần mền IRRISTAT 4.0.
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1%đến khả năng vô trùng mẫu
Để tạo nguồn vật liệu sạch cho nuôi cấy, nghiên cứu tiến hành khử trùng mẫu củ
bằng HgCl2 0,1% với thời gian 4 - 12 phút. Kết quả khử trùng được thể hiện ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quảảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl20,1% đến khả năng vô trùng mẫu (sau 7 ngày nuôi cấy)
Công thức Phương pháp Số mẫu nuôi cấy Tỷ lệ mẫu sống (%) Tỷ lệ mẫu chết (%) Không nhiễm Bị nhiễm 1 Khử trùng HgCl2 0,1% trong 4 phút 45 42,22 57,78 0,00 2 Khử trùng HgCl2 0,1% trong 6 phút 45 48,89 51,11 0,00 3 Khử trùng HgCl20,1% trong 8 phút 45 53,33 46,67 0,00 4 Khử trùng HgCl2 0,1% trong 10 phút 45 71,11 28,89 0,00 5 Khử trùng HgCl2 0,1% trong 12 phút 45 68,89 24,44 6,67 CV (%) 3,9 5,2 LSD05 4,06 3,97
Kết quả bảng 4.1 cho thấy, thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% có ảnh hưởng
đến khả năng đến vô trùng mẫu củ tam thất gừng.Qua theo dõi cho thấy, ở thời gian khử trùng 10 phút cho tỷ lệ mẫu vô trùng cao hơn so với các công thức còn lại, đạt 71,11%. Khi tăng thời gian 4 đến 8 phút kết quả tỷ lệ mẫu sống không nhiễm lần lượt 42,22%, 48,89%, 53,33%.Thời gian khử trùng tăng lên 12 phút cho tỷ lệ mẫu sống không nhiễm giảm xuống còn 68,89%. Sự khác biệt giữa các công thức được thể hiện qua tỷ lệ mẫu nhiễm và mẫu chết, trong đó tỷ lệ mẫu nhiễm có xu hướng giảm dần từ 57,78% (4 phút) xuống 24,44% (12 phút). Về tỷ lệ mẫu chết thu được 6,67% ở thời gian khử trùng 12 phút, còn khử trừng ở các thời gian thấp hơn không thu được mẫu chết ở mức độ tin cậy 95%.
Hiện nay, việc vô trùng mẫu nuôi cấy ở đối tượng thực vậtbằng CaOCl2, NaOCl, HgCl2,…được báo cáo bởi Trịnh Đình Đạt (2007) [6]. Qua bảng 4.1 cho thấy, việc sử dụng HgCl2 0,1% cho kết quả vô trùng mẫu tương đối tốt. Tuy nhiên, thời gian khử trùng là một yếu tố quan trọng đến khả năng vô trùng và sức sống của mẫu, với thời gian khử trùng từ 4 đến 8 phút hạn chế được tỷ lệ mẫu chết nhưng tỷ lệ mẫu vô trùng thấp. Theo kết quảcủa Rahman M.M. và cs (2004) [40] khi tăng thời gian khử trùng củ nghệ vàngbằng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút thu được kết quả số mẫu sạch thu được là 50%. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng có tỷ lệ mẫu sạch thu được tăng lên và cho kết quả tốt nhất khi khử trùng trong 14 phút với tỷ lệ mẫu sạch thu được là 90%.
Từ kết quả đạt được, nghiên cứu lựa chọn thời gian thích hợp cho vô trùng mẫu tam thất gừng bằng HgCl2 0,1% là 10 phút.
4.2. Kết quảnghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp cắt mẫu đến khả năng tái sinh chồi
Kết quảđược thể hiện trong bảng 4.2 và hình 4.1.
Bảng 4.2. Kết quả của phương pháp cắt mẫu đến khả năng tái sinh chồi (sau 20 ngày nuôi cấy)
Công thức Phương pháp Số mẫu nuôi cấy (mẫu) Thời gian nảy chồi (ngày) Số chồi phát sinh (chồi) Hệ số tái sinh (chồi) Chất lượng chồi 1 Để nguyên mẫu củ 45 7 - 10 68 1,51 Xanh, nhỏ 2 Cắt 1/2 mẫu củ 45 4 - 5 55 1,22 Xanh, mập 3 Cắt 1/4 mẫu củ 45 4 - 5 48 1,07 Xanh, nhỏ CV(%) 5,4 LSD.05 0,14 Từ bảng 4.2 và hình 4.1 thể hiện kết quả ảnh hưởng của phương pháp cắt mẫu đến khả năng tái sinh chồi từ củ tam thất gừng, số chồi phát sinh từ 48 đến 68 chồi tương ứng với hệ số tái sinh dao động từ 1,07 đến 1,51 chồi. Ở phương
pháp để nguyên củ thu (1,51 chồi) cao hơn so v thấy thời gian nảy chồ với mẫu nảy chồi ở cắ Về chất lượng chồ biệt, chồi xanh, mập ở ắ mẫu. Điều này cho th chất lượng chồi, nếu bỏ
tái sinh và số chồi phát sinh cao) th tái sinh chồi và tạo đ
dụng cắt 1/2 và 1/4 m và cs (2011) [42].
Từ kết quả bảng 4.2 nghi thí nghiệm tái sinh chồ
Hình 4.1. Kết qu
a - Mẫu để
4.3. Kết quả nghiên cứ
Kết quả tái sinh ch
ủ thu được số chồi phát sinh (68 chồi) và h
ơn so với các công thức còn lại. Tuy nhiên, qua theo dõi cho
ảy chồi của mẫu củđể nguyên dao động từ 7 -
ồ ở cắt 1/2 và 1/4 củ với thời gian nảy chồi 4