Tình hình nghiên cứu trong nước

Bước đầu tìm hiểu về sự nuôi cấy in vitro lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp), năm 1996, Võ Thị Bạch Mai và Lê Văn Hướng [20] cho rằng dưới tác động của auxin và cytokinin được bổ sung riêng lẻ hay kết hợp vào môi trường MS cải tiến. Khi có bổ sung

5 ppm BA và 1ppm 2,4-D, mô cấy được kích thích tạo ra tiền củ. Trong môi trường MS bổ sung 2 ppm BA, mô cấy sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh.

Khi “nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồng lan Phalaenopsis” Nguyễn Quang Thạch và cs (2003)[13], đã sử dụng vật liệu nuôi cấy mô khởi đầu bằng lá non, mắt ngủ trên phát hoa và đỉnh phát hoa.

Năm 2005, Liêu Hồng Phú nghiên cứu tạo phôi và hạt nhân tạo lan HồĐiệp

được thực hiện tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của các chất kích thích tố sinh trưởng và các loại môi trường đến khả năng tạo mô sẹo, phát sinh phôi, tái sinh chồi và tạo hạt nhân tạo lan HồĐiệp.

Theo Trần Thị Dung, Trịnh Pari và Liêu Hồng Phú (2005)[23] khi nuôi cấy phát sinh mô sẹo từ protocorm trên môi trường VW (Vacin &Went) có bổ sung 0,01 mg/ l BA + 200 mg/ l nước dừa + 40 g/ l đường cho khả năng tạo mô sẹo cao nhất.

Đối với việc tạo phôi, môi trường thích hợp nhất là VW có bổ sung 2mg/ lTDZ sau

đó cấy chuyền sang môi trường ½ VW. Môi trường tốt nhất cho việc tái sinh lan Hồ Điệp từ phôi là môi trường VW + 30 g/ l khoai tây + 1g / l than hoạt tính.

Theo Cung Hoàng Phi Phượng và cs (2007)[1] sử dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời sẽ cung cấp chất dinh dưỡng và không khí cho các mô sẹo một cách chủđộng. Cũng nhờ đó hệ số nhân giống cây cao gấp 5-6 lần so với cách nhân giống lan HồĐiệp bằng phương pháp sinh sản vô tính. Trong môi trường nuôi cấy ngập chìm tạm thời, các mô phát triển nhanh và nhân chồi liên tục. Trung bình, từ

một mô sẹo sau 2-3 tháng có thể cho 20- 25 chồi con. Các chồi này có lá lớn và ra rễ rất nhanh, chồi phát triển thành cây con chỉ sau 2- 3 tháng. Khi đưa ra trồng ở

môi trường tự nhiên, 100% cây con được nuôi cấy bằng kỹ thuật nói trên đều sống và phát triển tốt.

Theo Dương Tấn Nhựt và cs (2007)[2] sử dụng vật liệu nuôi cấy khởi đầu là protocorm có màu xanh, đường kính từ 1- 1.5 mm cấy chuyền 2-3 tháng 1 lần, môi trường MS cơ bản bổ sung 2mg/ l BA, 1mg / l NAA và 20% nước dừa và hệ thống nuôi cấy bioreactor rất thích hợp để nhân nhanh protocorm của lan Hồ Điệp. Monosaccharide (đường mía) không thích hợp cho nuôi cấy phôi vô tính cây lan Hồ Điệp, đặc biệt D- fructose có tác động rất xấu đến mẫu cấy (gây chết 100% mẫu). Các disaccharide thích hợp hơn cho nuôi cấy phát sinh phôi từ mẫu đoạn mắt ngủ là

phương pháp nhanh chóng và luân phiên để nhân giống cây trồng nhờ cấy mô sẹo. Môi trường nuôi cấy bổ sung 20g / l sucrose sẽ cho hiệu quả phát sinh phôi cao nhất (Dương Tấn Nhựt và cs, 2007) [2].

Theo Trần Thị Kim Liên (2008) khi nghiên cứu khả năng phát sinh chồi từ

mắt ngủ trên phát hoa lan HồĐiệp cho thấy: việc nuôi cấy mô từ các chấn thương, sẽ đạt được nhiều cây con Hồ điệp hơn so với các khúc mắc bình thường chỉ cho một cây con duy nhất. Môi trường thích hợp để phát sinh chồi là môi trường MS có bổ sung 1 mg/ l BA và 2 mg/ l NAA.

Hoàng Thị Hiền (2009). Đề tài nghiên cứu “Xác định nồng độ nước javel cho quá trình khử mẫu phát hoa lan Hồđiệp. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan Hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) bằng phương pháp in vitro” được tiến hành tại phòng di truyền và chọn giống - Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam.

CN.Sinh học Đặng Thị Ánh Tuyết (2009), đề tài nghiên cứu “Ứng dụng phương pháp nuôi cấy lỏng tĩnh để nhân nhanh giống lan Hồ điệp (Phalaenopsis sp)”. Tại Trung tâm Ứng dụng và Chuyển giao công nghệ Phú Yên.

Hồ Phan Thiết Toàn (2011), đề tài nghiên cứu “Khảo sát một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của lan Hồđiệp (Phalae nops is) in

vitro.” Tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của Khoa - Khoa học nông nghiệp - CNSH. Trường Cao Đẳng Nguyễn Tất Thành Quận 4 TP. Hồ Chí Minh.

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu

- Vật liệu nghiên cứu: Giống Hồ Điệp hoa tím đậm (P.Tai-Lin Red Angel).

Được cung cấp từ Trạm thực nghiệm Sinh học Công nghệ cao, Văn Giang - Hưng Yên. Kí hiệu trong phòng thí nghiệm là giống 34902.

- Hóa chất: Các chất dùng để khử trùng như: HgCl2 0,1% và H2O2 40%, các chất kích thích sinh trưởng như: 2,4 - D, Kinetin được bổ sung vào môi trường nuôi cấy theo từng thí nghiệm.

- Các thiết bị nghiên cứu: Panh, kéo, dao cắt, box cấy vô trùng, đèn UV, cân kĩ thuật, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống giàn đèn, nồi hấp tiệt trùng, máy đo pH, máy khuấy từ, bếp từ…

3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu: tại Trạm thực nghiệm Sinh học Công nghệ cao, Văn Giang - Hưng Yên; trực thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp, Km số 2 - Đường Phạm Văn Đồng - Từ Liêm - Hà Nội.

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 12/2013 đến tháng 06/2014.

3.3. Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Nghiên cứu xác định nguồn vật liệu thích hợp để đưa vào nhân giống.

- Nội dung 2: Nghiên cứu cải tiến giai đoạn nhân nhanh bằng phương pháp cắt lát mỏng để gia tăng hệ số nhân.

3.4. Phương pháp nghiên cứu

3.4.1. Cách bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng nuôi cấy mô của viện ở Văn Giang - Hưng Yên.

- Phương pháp nuôi cấy: Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro được thực hiện trong điều kiện nhân tạo cho phép chủđộng các chếđộ ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ.

+ Cường độ ánh sáng: 2500-3000 lux. + Nhiệt độ phòng nuôi: 25±2oC.

* Nội dung 1: Nghiên cứu xác định nguồn vật liệu thích hợp đểđưa vào nhân giống

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu nuôi cấy là hạt.

Công thức 1 : Mẫu quả lan xanh (100-120 ngày tuổi). Công thức 2 : Mẫu quả lan chín ( 160-180 ngày tuổi).

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 2 công thức, thí nghiệm nhắc lại 3 lần, vào 10 mẫu cho mỗi công thức.

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ nảy mầm của hạt.

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu nuôi cấy là cơ quan sinh dưỡng

Công thức 1: Ngồng hoa non (chưa nở hoa).

Công thức 2: Ngồng hoa già ( sau khi đã nở hết hoa). Công thức 3: Đỉnh ngọn cành hoa.

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 3 công thức, mỗi công thức 25 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm 1 mẫu, thí nghiệm nhắc lại 3 lần.

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu tạo chồi, chất lượng mẫu tạo thành.

* Nội dung 2: Nghiên cứu cải tiến giai đoạn nhân nhanh bằng phương pháp lát mỏng để gia tăng hệ số nhân.

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của Ki bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng.

Công thức 1(Đối chứng) : Môi trường MS + Ki 0mg/l Công thức 2 : Môi trường MS + Ki 1mg/l Công thức 3 : Môi trường MS + Ki 2mg/l Công thức 4 : Môi trường MS + Ki 3 mg/l

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 4 công thức, mỗi công thức 9 đĩa peptri, mỗi đĩa peptri 3 mẫu, thí nghiệm nhắc lại 3 lần.

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái, tỷ lệ mẫu tạo protocorm, chất lượng protocorm tạo thành.

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D bổ sung vào môi trường nuôi cấy

đến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng.

Công thức 1(Đối chứng) : Môi trường MS + 2,4-D 0mg/l Công thức 2 : Môi trường MS + 2,4-D 0,1 mg/l Công thức 3 : Môi trường MS + 2,4-D 0,3 mg/l Công thức 4 : Môi trường MS + 2,4-D 0,5 mg/l Công thức 5 : Môi trường MS + 2,4-D 1 mg/l

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 5 công thức, mỗi công thức 9 đĩa peptri, mỗi đĩa peptri 3 mẫu, thí nghiệm nhắc lại 3 lần.

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái, tỷ lệ mẫu tạo protocorm, chất lượng protocorm tạo thành.

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Ki và 2,4 - D bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến khả năng phát sinh hình thái của lát mỏng ( sau 4 tuần nuôi cấy).

Công thức 1 (Đối chứng) : Môi trường MS + 2,4-D 0 mg/l + Ki 0 mg/l Công thức 2 : Môi trường MS + 2,4-D 0,1 mg/l + Ki 0,1 mg/l Công thức 3 : Môi trường MS + 2,4-D 0,1 mg/l + Ki 0,3 mg/l Công thức 4 : Môi trường MS + 2,4-D 0,1 mg/l + Ki 0,5 mg/l Công thức 5 : Môi trường MS + 2,4-D 0,5 mg/l + Ki 0,1 mg/l Công thức 6 : Môi trường MS + 2,4-D 0,5 mg/l + Ki 0,3 mg/l Công thức 7 : Môi trường MS + 2,4-D 0,5 mg/l + Ki 0,5 mg/l Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn, có 7 công thức, mỗi công thức 9 đĩa peptri, mỗi đĩa peptri 3 mẫu, thí nghiệm nhắc lại 3 lần.

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái, tỷ lệ mẫu tạo protocorm, chất lượng protocorm tạo thành.

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn mẫu khác nhau đến sự phát sinh hình thái của lát mỏng.

Công thức 1 : Đỉnh ngọn cành hoa.

Công thức 2 : Thể protocorm mới hình thành. Công thức 3 : Thể protocorm đã qua cấy chuyển. Công thức 4 : Cây sau 1,2 lần cấy chuyển.

Công thức 5 : Cây sau 3,4 lần cấy chuyển.

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái, tỷ lệ mẫu tạo protocorm, chất lượng protocorm tạo thành.

3.4.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

- Sử dụng môi trường MS (Murashinge & Skoog, 1962) bổ sung 30g/l đường, 3,5g/l agar tùy từng thí nghiệm.

- Các chất kích thích sinh trưởng sử dụng thuộc nhóm Auxin và Cytokinin bổ

sung vào môi trường nuôi cấy.

- Giá trị pH của môi trường nuôi cấy trước khi khử trùng là: 5,8.

- Thể tích môi trường nuôi cấy trong bình nuôi cấy là 50-70ml/bình, trong đĩa peptri là 10-15ml/đĩa.

- Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C, áp suất 1,1atm trong 25 phút.

3.4.3. Phương pháp khử trùng mẫu cấy

Mẫu cấy sử dụng là: quả lan, mắt ngủ từ ngồng hoa, đỉnh ngọn cành hoa, lá lan. *Đối với quả lan

- Quả lan xanh phải kín, không có lỗ hoặc các vết nấm mốc xâm nhập vào hạt lan. Cắt quả lan bằng dao hoặc kéo sắc rồi đem vào rửa sạch bằng xà phòng loãng trong 5 phút, sau đó rửa lại bằng nước sạch cho sạch.

- Cho quả lan vào một bình sạch (tốt nhất đã hấp khử trùng) mang vào tủ cấy vô trùng.

- Khử trùng quả lan bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng (3 lần).

- Dùng kẹp gắp quả lan nhúng cho ngập trong cồn 960. Sau đó hơ qua ngọn lửa đèn cồn rồi rút ra để lửa tự tắt.

- Dùng dao xẻ dọc quả lan lấy hạt (hạt lan nhỏ li ti như cám, màu vàng hoặc trắng ngà)

- Đem hạt rắc vào trong các bình tam giác đã có môi trường. Đậy nắp binh lại.

*Đối với mắt ngủ từ ngồng hoa, đỉnh ngọn cành hoa

- Cắt ngồng lan bằng dao hoặc kéo sắc rồi đem vào rửa sạch bằng xà phòng loãng trong 5 phút, sau đó rửa lại bằng nước sạch cho sạch.

- Sau đó lau qua cồn 700 rồi bỏ vào bình sạch đã được khử trùng.

- Sau đó cho 50-100ml cồn 700 lắc nhẹ trong thời gian 1 phút, rồi tráng lại bằng nước vô trùng 1 lần.

- Khử trùng ngồng lan bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng (3 lần).

3.5. Chỉ tiêu theo dõi

(%) số protocorm/mẫu = Mẫu tạo protocorm x 100 Tỷ lệ mẫu sống - Tỷ lệ tạo chồi (%) = Σ Chồi tạo ra x 100 Σ Thể protocorm tạo ra - Tỷ lệ tạo protocorm (%) = Σ Số mẫu tạoprotocorm x 100 Σ ố ẫ ố

3.6. Xử lý số liệu

- Các số liệu được tính toán bằng phần mềm Excel.

- Các số liệu phân tích là số liệu trung bình của các lần theo dõi. Quá trình xử lý thực hiện trên máy theo chương trình IRRISTAT 4.0 (Phạm Tiến Dũng, 2003)[20].

- Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình và sử dụng tiêu chuẩn LSD (Least Significant Different) ởđộ tin cậy 95%.

- Kiểm tra độ biến động của thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV%.

PHẦN 4

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả nghiên cứu xác định nguồn vật liệu thích hợp đểđưa vào nhân giống

4.1.1. Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là hạt Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là hạt Bảng 4.1: Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là hạt CT Bộ phận vào mẫu Tổng số mẫu (quả) Tổng số bình thí nghiệm Tổng số bình bị nhiễm Thời gian nảy mầm của hạt (ngày) Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) Chất lượng mẫu 1 Quả còn xanh (100-120 ngày) 30 54 2 25 96 + 2 Quả chín (160-180 ngày) 30 54 5 20 90,7 ++

Môi trường gieo hạt: MS + KT 150g + Đường 30g + Than 2g+... + : Chồi nhiều, có màu xanh.

++ : Chồi nhiều, có màu xanh vàng.

CT1 CT2 Hình 4.1: Protocorm

Từ kết quả thu được ở bảng 4.1.1 cho thấy:

Công thức 1 với nguồn mẫu là quả lan xanh (100-120 ngày tuổi) cho tỷ lệ nảy mầm đạt 96%, protocorm hình thành nhiều, có màu xanh nhạt.

Công thức 2 với nguồn mẫu là quả chín (160-180 ngày tuổi) có tỷ lệ hạt nảy mầm thấp hơn công thức 1 là 90,7%. Protocorm hình thành nhiều, có màu vàng nhạt.

Như vậy quả lan xanh (100-120 ngày tuổi) là nguồn mẫu thích hợp để tăng hiệu quả của phương pháp nhân giống hữu tính từ hạt.

Kết quả thí nghiệm trùng hợp với nghiên cứu trước đây về cây lan Hồ Điệp của các tác giả (Nguyễn Quang Thạch, 2003)[13]. Nghiên cứu trước đây đều cho thấy sử dụng quả lan sau thụ phấn 120 ngày là tốt nhất (tỷ lệ nảy mầm đạt 96%).

4.1.2. Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng

Bảng 4.2: Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng

CT Bộ phận vào mẫu Tỷ lệ mẫu PSHT (%) Tỷ lệ tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu Protocorm (%) Chất lượng chồi 1 Mắt ngủ từ ngồng hoa non (chưa nở hoa) 23 14 9 Tốt 2 Mắt ngủ từ ngồng hoa già (sau khi đã nở hết hoa)

13,33 10,33 3 Kém

3 Đỉnh ngọn cành hoa 16,67 8 8,67 Kém

LSD 0,005 1,76 0,98 0,72

CV % 5,7 4,6 5,3

Hình 4.2: Kết quả nghiên cứu nguồn vật liệu khởi đầu là cơ quan sinh dưỡng

CT1 CT2 CT3

Hình 4.3: Chồi hình thành từ mắt ngủ ngồng hoa non

Qua bảng số liệu 4.2 và hình 4.3 ta thấy tỷ lệ tạo chồi và tạo protocorm ở các công thức là khác nhau. Với nguồn mẫu là mắt ngủ ngồng hoa non (chưa nở hoa) cho tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao (đạt 23 %), tỷ lệ tạo chồi và tạo protocorm khá cao là 14 % và 9 %, chất lượng protocorm tốt ( protocorm to, đồng đều).

Cách bố trí thí nghiệm