Nghiên cứu đặc tính hoá sinh của một số phân đoạn dịch chiết từ cây thảo quyết minh (Cassia tora

LỜI CẢM ƠN Bằng tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS. Đỗ Ngọc Liên - Tr- ờng Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, đã giao đề tài, tận tình giủp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới các cán bộ Trung tâm nghiên cứu Khoa học sự sống, khoa Sinh học, tr- ờng Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết tới Ban giám hiệu, phòng sau đại học và Khoa sinh Tr- ờng Đại học S- phạm Hà Nội 2, là nơi tôi đ- ợc đào tạo về kiến thức cơ bản, ph- ơng pháp trong chuyên môn sinh học thực nghiệm và đã tạo mọi điều kiện để tôi đ- ợc học tập, thực hiện đề tài luận văn này. Nhân đây tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến Sở giáo dục và Đào tạo tỉnh Bắc Giang cũng nh- Tr- ờng THPT Lục Ngạn số 1 đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi đ- ợc học tập nâng cao trình độ chuyên môn để thực hiện luận văn này. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và những ng- ời đã giúp tôi hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2010 Học viên Vi Thị Nguyệt MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Kinh tế xã hội ngày càng phát triển đã làm cho đời sống con ng- ời ngày càng đ- ợc nâng cao nh- ng cũng kéo theo quá trình đô thị hoá nhanh và tốc độ ô nhiễm môi tr- ờng ngày càng lớn. Ô nhiễm môi tr- ờng hiện nay đã lan tràn vào mọi nơi, từ đất, n- ớc đến khí quyển, từ bề mặt đến các lớp sâu của đại d- ơng, từ 1 n- ớc này sang n- ớc khác. Chính ô nhiễm môi tr- ờng đã dẫn tới sức khoẻ con ng- ời đang bị giảm sút và bệnh tật xuất hiện ngày càng nhiều. Ng- ời ta thấy rằng, bệnh tật ngày càng phát triển, đặc biệt các bệnh ung th-, tim mạch, đái tháo đ- ờng, gan w hơn thế nữa còn xuất hiện các bệnh lạ và tử lệ tử vong do bệnh tật ngày càng cao. Các loại bệnh đã phát triển thành dịch ngày càng phát triển V- ợt qua cả các bệnh truyền nhiễm là bệnh rối loạn trao đổi chất nh- bệnh béo phì, đái tháo đ- ờng, ung th- và tim mạch. Nh- với ung th-, ở Mỹ và các n- ớc phát triển khác ung th- chiếm khoảng 25% tr-ờng hợp chết do mọi nguyên nhân. Theo thống kê hàng năm thì khoảng 0,5 % dân số đ- ợc chẩn đoán ung th Với bệnh tim mạch, theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cứ 2 giây có 1 ng- ời chết vì bệnh tim mạch, cứ 5 giây thì có 1 tr- ờng hợp nhồi máu cơ tim, cứ 6 giây có 1 tr- ờng hợp đột quỵ. Và mỗi năm bệnh tim mạch gây thiệt mạng cho hơn 17 triệu ng- ời trên thế giới. Với bệnh đái tháo đ-ờng, ĐTĐ theo thống kê của WHO năm 2000 toàn thế giới có khoảng 151 triệu ng- ời mắc bệnh và dự đoán đến 2025 con số mắc bệnh sẽ tăng đến 300 - 330 triệu ng-ời, chiếm 5,4% dân số toàn cầu vv [3] [29][30]. Do tốc độ phát triển của các loại bệnh ngày càng nhanh, nên nghiên cứu về thuốc điều trị cũng phải tăng theo về chủng loại và số l-ợng. Ngày nay hàng loạt các loại thuốc điều trị các bệnh đã đ- ợc ra đời và đang đ- ợc sử dụng nhằm hạn chế sự phát triển của các bệnh. Tuy nhiên, rất nhiều loại thuốc tổng hợp có giá đắt và th- ờng kéo theo phản ứng phụ cho cơ thể. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khuyên cáo là nên dùng các sản phẩm có nguồn gốc từ thảo d- ợc vì chúng vừa có sẵn, giá cả rẻ, mà hơn hết là các sản phẩm đó ít có phản ứng phụ đối với ng- ời dùng [29]. 2 Hiện nay, thế giới đã nghiên cứu và đã thành công trong việc sử dụng các loại thuốc chiết xuất từ thực vật, các loại thuốc đó đã đ- ợc sử dụng ở nhiều quốc gia và trên nhiều loại bệnh khác nhau nh- : béo phì, ho, táo bón, sốt, cảm, tiêu chảy, đau dạ dày, giảm đau, chống viêm w kể cả những bệnh nan y nh- : Tim mạch, ung th-, gan, đái tháo đ- ờng vv [57]. Việt Nam là n- ớc có khí hậu nhiệt đới gió mùa với nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phũ và đa dạng, có thể nói chúng ta đang sống trên “một kho thuốc”. Để tân dung đ-ợc nguồn tài nguyên đó, giảm chi phí cho việc chữa bệnh mà ngày nay ng- ời ta đã nghiên cứu, khảo sát thành phần hoá học và tác động d- ợc lý của các loài cây thuốc có giá trị của Việt Nam nhầm đặt cơ sở tin cậy cho việc sử dụng khoa học các loại cây thuốc. [2, 7, 8, 10, 14,21]. Ng- ời ta cũng đã nghiên cứu nhiều loại cây ở Việt Nam có tác dụng về việc chữa bệnh nh- : M- ớp đắng (Khổ qua), Nha đam, Giảo cổ lam, Chuối hột, Diệp hạ châu đắng, Chè xanh, Nghệ w [7] Họ đậu ( Fabaceae) là họ khá phổ biến ở Việt Nam với số loài t- ơng đối đa dạng. Hiện nay đã có một số công trình khoa học nghiên cứu về các loài trong họ này và cho kết quả khả quan về khả năng điều trị nhiều bệnh nh-: bệnh tiểu đ- ờng, chống nhiễm khuẩn và ung th- w Tuy nhiên, ch-a có tác giả nào đề cập đến đặc tính sinh d- ợc và tác dụng hạ đ- ờng của cây Thảo quyết minh (Cassỉa tora L.) Xuất phát từ thực tế trên, cùng với mong muốn góp phần vào việc nghiên cứu, phát hiện thêm các thuốc có nguồn gốc thảo d- ợc để dự phòng và chữa bệnh. Chúng tôi chọn đề tài: ” Nghiên cứu đặc tính hoá sình của một số phân đoạn dịch chiết từ cây thảo quyết minh (Cassia tora L.) ” 3 2. Mục đích nghiên cứu 2.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học của cây thảo quyết minh 2.2 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn cây thảo quyết minh đến trọng l- ợng và một số chỉ số hoấ sinh của chuột béo phì thực nghiệm 2.3 Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của một số phân đoạn trên mô hình chuột béo phì ĐTĐ mô phỏng type 2 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết, tách các phân đoạn của cây thảo quyết minh. - Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học của cây thảo quyết minh. - Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm, ĐTĐ type 2. - Đánh giá tác dụng của các phân đoạn dịch chiết đến trọng 1-ợng,mộtsố chỉ số lipid máu của chuột béo phi thực nghiệm, nồng độ glucose huyết của chuột ĐTĐ tpye 2. 4. Đối t ợng và phạm vi nghiên cún 4.1. Đối t- ợng nghiên cứu * Mầu thực vật - Thảo quyết minh (Cassia torn L.), vỏ thân, lá, rễ đã đ-ợc TS. Võ Văn Chi phân loại [7]. - Thời giãn thu hái: vàõ tháng 6 -7/ 2009, tại Lục Ngạn - Bắc Giãng. *Mầu động vật - Chuột nhắt trắng chủng Swiss (14 - 15g) 4 tuần tuổi đ- ợc mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW. - Thức ăn tiêu chuẩn đ- ợc mua tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW. 4.2. Phạm vi nghiên cứu 4 Nghiên cứu đặc tính sinh d- ợc học của một số phân đoạn dịch chiết ( cao ethanol, n- hexan, ethylaxetate) từ thảo quyết minh ( Cassia tora L.) trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm bằng thức ăn hàm l-ợng béo cao ( FD)[69], chuột béo phì gây ĐTĐ phỏng theo type 2. 5. Ph ơng pháp nghiên cứu 5.1. Ph- ơng pháp định tính thành phần hoá học của cây Thảo quyết minh 5.2 Ph- ơng pháp phân lập các hợp chất bằng kỹ thuật sác kí lớp mỏng 5.3 Định l-ợng hợp chất phenolics tổng số theo ph-ơng pháp Folin - Ciocalteau)[ 69] 5.4 Xây dựng mô hình chuột thí nghiệm - Chuột béo phì thực nghiệm, ĐTĐ type 2 )[67] [70]. 5.5 Ph- ơng pháp định Ị- ợng một số chỉ số hóa sinh. 5. 6 Ph- ơng pháp xử lý thống kê. 6. Đóng góp mới của đề tài - Đ- a ra quy trình tách chiết phân đoạn các hợp chất tự nhiên từ cây thảo quyết minh. - Phân lập một số hợp chất bằng sắc ký mỏng, định tính, định 1- ợng một số hợp chất tự nhiên từ thảo quyết minh. Đánh giá đ-ợc tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết cây thảo quyết minh ( Cassia tora L.) đến trọng 1- ợng, một số chỉ số hoá sinh của chuột béo phì thực nghiệm và tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết trên mô hình chuột béo phì và ĐTĐ mô phỏng theo type 2. 5 CH ƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vài nét về cây Thảo quyết minh ( Cassia tora L.) 7.7.7 Phân loại khoa học và đặc điểm của Thảo quyết minh Thảo quyết minh ( Cassia torn L.) hay còn gọi là muồng ngủ, đậu ma, muồng lạc. * Phân loại khoa học: [7]. - Giới:Plantae - Ngành: Magnoliophyta - Lớp: Magnoliopsida - Bộ: Fabales * Đặc điểm thực vật của Thảo quyết minh ( Cassia tor a L.) Là loài cây bụi nhỏ cao 0,5- lm, lá mọc so le, kép lông chim chẵn, gồm 2- 4 đôi lá chét. Lá hình trứng ng-ợc lại phía đầu lá nở rộng ra, dài 3-5 cm, rộng 15-25 mm. Hoa màu vàng t- ơi, mọc ở nách lá, th- ờng xếp 1 -3 cái không đều nhau. Quả dài và hẹp dài 12-14 cm, rộng 4 mm), trong chứa chừng 25 hạt, hạt có màu nâu nhạt, bóng, hai đầu vát chéo trông hơi tựa viên đá lửa. Vị chát hơi đắng và nhầy. [7] - Họ: Fabaceae - Chi: Cassia - Loài: c . tora [...]... thêm một nguyên tử cacbon nên có thể tạo thêm một vòng pyran thứ hai * Hoạt tính sình học của flavonoid Các hợp chất flavonoid th- ờng gặp trong tự nhiên, phân bố phổ biến trong thực vật Việc nghiên cứu hoạt tính sinh học của flavonoid đ- ợc quan tâm đặc biệt vì giá trị to lớn của nó đối với đời sống con ng- ời và d- ới đây là một số hoạt tính sinh học chính của flavonoid - Tác dụng chống oxy hoá ịanti... n- ớc nóng và chiết lần 1- ợt với các dung môi nhexan, choloroíorm và ethylacetate, cất loại dung môi d-ới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cặn chiết t- ơng ứng 2.2.2 Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học của cây Thảo quyết minh [6, 31, 44, 70] 2.2.2.1 Định tính một số hợp chất tự nhiên trong Thảo quyết minh 2.2.2.1.1 Định tính ílavonoids Mẫu thử đ- ợc pha trong ethanol với một 1- ợng thích... khác trong phòng thí nghiệm hoá sinh nh-: pipetman, bình nón, ống đong, cân điện tử - Máy phân tích các thành phần lipid, glucose máu và lipase máu nhờ máy tự động OLYMPUS AU640 của Nhật Bản 2.2 Ph ơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Ph- ơng pháp tách chiết mẫu nghiên cứu Thân lá thảo quyết minh ( 1,5 kg) khô đ- ợc chiết rút 3 lần với ethanol ( cồn 96°) ở nhiệt độ phòng Gộp các dịch chiết lại lọc qua giấy lọc... Phản ứng Keller-Killỉan: ■ Thuốc thử Keller-Killian: + Dung dịch A: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid acetic 10% + Dung dịch B: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid suníuric đặc ■ Ph- ơng pháp: Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm Thêm lml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào Phản ứng d- ơng tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng ... màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron - Phản ứng định tính catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HC1 đặc Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng d- ơng tính 2.2.2.1.2 Định tính tannins - Mẫu thử cũng đ- ợc pha nh- trên và làm các phản ứng: Phản ứng với vanilin: Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm... nh- Sinh địa, cỏ ngọt, M- ớp đắng, Hoàng kỳ, Huyền sâm [56] [68] CH ƠNG 2 ĐỐI T ỢNG VÀ PH ƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1 Đối t ợng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu thực vật - Thân lá cây thảo quyết minh ( Cassia tora L.) - Thời gian thu hái: đ- ợc thu vào tháng 7- 8/2009 - Xử lí mẫu: Thân lá đ- ợc rủa sạch, để ráo, băm nhỏ vàsấy khô ở 60 65°, bảo quản trong túi nilông Tên khoa học đ- ợc xác định theo tiến sỹ phân. .. xuất đ- ờng của ílavonoid có hoạt tính của vitamin nh- rutin, hisperidin có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch; giảm sức thẩm thấu của hồng cầu qua thành mao mạch Hoạt tính này đ- ợc ứng dụng trong chữa trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch; giãn hay suy yếu tĩnh mạch trĩ; rối loạn tuần hoàn tĩnh mạch [14] - Tác dụng giảm béo phì và lipỉd mấu Theo kết quả nghiên cứu của các nhà... đã đ- ợc nhiều nhà nghiên cứu chiết xuất và thử tác dụng trên mô hình chuột béo phì cho kết quả tốt trong việc làm hạ các chỉ số lipid máu [24,30] - Tác dụng hạ đ- ờng huyết Một số flavonoid đ- ợc tách chiết từ nguyên liệu thực vật đ- ợc chứng minh là có tác dụng điều hoà đ- ờng huyết nh-: Quercetin có trong Đỗ trọng ( Eucommia ulmoides Oliver.) [57] Hesperidin và naringin có trong cây thuộc họ Rutaceae... tiểu đ- ờng này 1.4.2 Cơ chê sinh bệnh ĐTĐ 1.4.2.1 Cơ chế sinh bệnh ĐTĐ type 1 Nguyên nhân chính của ĐTĐ type 1 là do tế bào ß của đảo tuỵ Langerhan bị phân huỷ dẫn đến mất khả năng sản xuất insulin, một hormone điều hoà nồng độ glucose máu Quá trình huỷ hoại các tế bào ß này là do cơ chế sinh bệnh tự miễn dịch Khoảng 18 vùng gen đặc biệt là các gen mã hóa D Q 2, DR3,DQg, DR, của phức hệ HLAII [29] [35]... 2S04 Phản ứng d- ơng tính khi thu đ- ợc màu đỏ đậm - Phản ứng với gelatin/NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng d- ơng tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục - Phản ứng với acetate chì: cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào dung dịch mẫu, phản ứng d- ơng tính khi xuất hiện kết tủa 2.2.2.1.3 Định tính các polyphenols khác - Phản ứng với dung dịch kiểm: Dung dịch mẫu thử đ-ợc . phần hoá học của cây thảo quyết minh 2.2 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn cây thảo quyết minh đến trọng l- ợng và một số chỉ số hoấ sinh của chuột béo phì thực nghiệm 2.3 Nghiên cứu. tính, định 1- ợng một số hợp chất tự nhiên từ thảo quyết minh. Đánh giá đ-ợc tác dụng của một số phân đoạn dịch chiết cây thảo quyết minh ( Cassia tora L.) đến trọng 1- ợng, một số chỉ số hoá. gốc thảo d- ợc để dự phòng và chữa bệnh. Chúng tôi chọn đề tài: ” Nghiên cứu đặc tính hoá sình của một số phân đoạn dịch chiết từ cây thảo quyết minh (Cassia tora L.) ” 3 2. Mục đích nghiên cứu 2.1