Địa điểm thí nghiệm - Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thực vật và chuyển hóa sinh học và Phòng thí nghiệm sinh học phân tử B, Trường Đại học Khoa h
Trang 1PH ẦN 2
PHÁP
Trang 2Vật liệu – Phương pháp
2.1 V ật liệu
2.1.1 Đối tượng
- Hạt cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) được mua ở Viện nghiên cứu dầu
và cây có dầu, quận 1, Tp Hồ Chí Minh
Hình 2.1 Hạt đậu phộng (Arachis hypogaea L.) giống VD1
- Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được mua từ ngân
hàng RIKEN-BRC thông qua dự án của MEXT, Nhật Bản
Trang 3Vật liệu – Phương pháp
Hình 2.2 Khuẩn lạc của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC
15834
2.1.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường Murashige và Skoog (MS) (phụ lục1): Môi trường muối khoáng đa
lượng và vi lượng MS, bổ sung saccharose dùng để nuôi cấy mô thực vật in vitro
- Môi trường Nutrient Broth (NB) (phụ lục1): Môi trường NB sử dụng để tăng sinh vi khuẩn A rhizogenes ATCC 15834
- Các tác nhân cảm ứng: nhôm clorua, natri acetate, vi khuẩn
- Tiền chất bổ sung: phenylalanine
Trang 4Vật liệu – Phương pháp
2.1.3 Hóa ch ất sử dụng
2.1.3.1 Hóa ch ất sử dụng trong thử hoạt tính kháng oxi hóa
- Phương pháp Yen và Duh: Vitamine E (α-tocopherol), Potassium ferricyanide (K3(Fe(CN)6)), acid tricloroacetic, NaH2PO4 2H2O, Na2HPO4.12H2O, FeCl
- Phương pháp DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)
3
2.1.3.2 Hóa ch ất PCR (Polymerase chain reaction)
- Các hóa chất: Dream Taq DNA polymerase, Dream Taq buffer (Fermentas),
dNTPs 2mM (Fermentas), nước siêu sạch
- Mồi sử dụng:
• Mồi khuếch đại gen rolB
Gen rolB được khuếch đại với cặp mồi rolBF và rolBR Sản phẩm khuếch đại được phát hiện và kết quả dương tính sẽ cho một vạch có kích thước 423 bp [22, 37]
B ảng 2.1 Đặc điểm của cặp mồi rolBF và rolBR
CTA GAT TT-3’
5’-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC-3’
• Mồi khuếch đại gen rolC
Trang 5Vật liệu – Phương pháp
Gen rolC được khuếch đại với cặp mồi rolCF và rolCR Sản phẩm khuếch đại được phát hiện và kết quả dương tính sẽ cho một vạch có kích thước 626 bp [22, 37]
Bảng 2.2 Đặc điểm của cặp mồi rolCF và rolCR
TCA AAC TCG TC-3’
5’-TGC TTC GAG TTA TGG GTA CA-3’
2.1.3.3 Hóa ch ất tách chiết và điện di
- Các dung môi hữu cơ: hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol
- Hóa chất tách chiết DNA: CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide), phenol, chloroform, nitơ lỏng, TE (Tris – EDTA), ethanol
- Hóa chất tách chiết plasmid: Dung dịch I gồm glucose 50 mM, Tris HCl 2,5
mM pH 8 và EDTA 10 mM pH 8 Dung dịch II gồm SDS 10% và NaOH 5N Dung dịch III gồm KOAc 5M và glacial acetic 0.2M
- Hóa chất điện di: Agarose, dung dịch TAE (Tris-Acetate-EDTA), ethidium bromide, dung dịch nạp mẫu (glycerol, bromophenol blue, xyencyanol)
Trang 6Vật liệu – Phương pháp
2.1.4 Địa điểm thí nghiệm
- Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thực
vật và chuyển hóa sinh học và Phòng thí nghiệm sinh học phân tử B, Trường Đại học Khoa học Tư nhiên Tp Hồ Chí Minh
2.2 Phương pháp
2.2.1 Tạo cây con in vitro
- Thao tác ngoài tủ cấy: Các hạt được tách vỏ, rửa sạch bằng xà phòng, sau đó được rửa lại bằng nước cất cho sạch xà phòng Erlen chứa hạt được đậy bằng
giấy bạc và đưa vào tủ cấy vô trùng
- Thao tác trong tủ cấy vô trùng: Tiến hành lắc với cồn 70o
trong khoảng 30 giây đến 1 phút Tiếp đó, ngâm và lắc hạt trong dung dịch sodium hypochlorite (NaOCl) 1,5% trong 7 phút Sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần Các hạt được cấy lên môi trường MS có bổ sung saccharose (30 g/l) và agar (7,5 g/l) Sau 5 ngày thì hạt nãy mầm với điều kiện chiếu sáng 16
giờ trong ngày, cường độ ánh sáng 2500 lux, nhiệt độ 25 – 28o
C
Trang 7Vật liệu – Phương pháp
Hình 2.3 Cây đậu phộng in vitro
2.2.2 C ảm ứng tạo rễ tơ
Trang 8Vật liệu – Phương pháp
Hình 2.4 Quy trình t ạo rễ tơ
Rễ tơ được tạo ra thông qua sự chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được hoạt hóa trên môi trường lỏng NB lắc với vận tốc
100 - 130 vòng/phút trong 48 giờ ở 25o
C vào tế bào thực vật Vi khuẩn sau khi hoạt
hóa được cấy vào môi trường NB để tăng sinh khối Khi A rhizogenes phát triển
đến giữa pha tăng trưởng (mid-log phase) với OD600
28
= 0,5 được dùng để gây nhiễm
nhằm chuyển gen Các mẫu (tử diệp, trụ thượng diệp, trụ hạ diệp, lá, cuống lá) được
cắt và tạo vết thương được nhúng vào dịch khuẩn A rhizogenes Thời gian ngâm
mẫu trong dịch khuẩn là 15 phút Sau đó, các mẫu cấy được đặt lên giấy thấm vô trùng, để khô bề mặt và chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật để thực hiện quá trình đồng nuôi cấy Quá trình đồng nuôi cấy được thực hiện trong tối Sau thời kỳ đồng nuôi cấy, mẫu được rửa với môi trường
MS lỏng có bổ sung cefotaxime (250 mg/l) để loại vi khuẩn trên bề mặt mẫu Sau khi rửa, mẫu được chuyển vào nuôi cấy trên môi trường MS rắn bổ sung cefotaxime (250 mg/l) để loại bỏ vi khuẩn và cảm ứng tạo rễ tơ Sau 2-3 tuần nuôi cấy, rễ tơ được tao thành từ vết thương [ , 61]
2.2.3 Phương pháp PCR và điện di
2.2.3.1 Phương pháp PCR
Nguyên tắc của phương pháp: Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng
hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase
Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi Điều đó có nghĩa là
để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự
Trang 9: Phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu rúc
của các nucleic acid Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường Tính linh động của phân tử trong gel phụ thuộc vào hai chỉ tiêu: khối lượng phân tử nucleotide hay cặp nucleotide và nồng độ các chất cấu thành gel.[ ]
Mục tiêu của điện di
2.2.4 Phương pháp tách chiết hợp chất
: Phân tích và kiểm tra kích thước của sản phẩm khuếch đại PCR
2.2.4.1 Điều chế các loại cao
Mỗi loài cây đều chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến
loại rất phân cực, vì thế dung môi được sử dụng điều chế cao có độ phân cực tăng
dần [5]
Xử lý nguyên liệu: Rễ tơ sau 25 ngày nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc được
rửa sạch môi trường nuôi cấy, ghi nhận trọng lượng tươi
Quy trình điều chế cao xử dụng máy Soxhlet:
Trang 10Vật liệu – Phương pháp
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ điều chế cao
Các loại cao thu nhận được được dùng để khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa
Dung d ịch môi trường nuôi cấy rễ tơ
2.2.5 Xác định hoạt tính kháng oxi hóa
: hòa dung môi ethyl acetate vào dịch môi trường, hỗn hợp dung môi và dịch môi trường được trộn đều trong 30 phút, sau
đó hổn hợp được lắng, thu lấy phân đoạn ethyl acetate để xác định hàm lượng
2.2.5.1 Phương pháp thử năng lực khử (Phương pháp Yen và Duh)
Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia
phản ứng oxy hóa khử Do đó, năng lực khử cũng biểu hiện khả năng kháng oxy hóa của một chất Trong phương pháp của Yen và Duh (1993) [59], chất khử sẽ
khử potassium ferricyanide (K3(Fe(CN)6)) thành potassium ferrocyanide (K4(Fe(CN)6)), hay nói cách khác ion Fe3+ trong phân tử potassium ferricyanide bị
Trang 11)
6)3- (Fe(CN)6) Sau đó bổ sung Fe
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (hình 2.5 ) được đặc trưng bởi gốc tự
do ổn định Gốc tự do này bền do được an định bởi các hiệu ứng điện tử và hiệu ứng lập thể nội phân tử tạo ra, do đó các phân tử này không thể kết hợp tạo thành
nhị phân tử DPPH có màu tím đặc trưng Đỉnh hấp thu của dung dịch DPPH trong dung môi methanol là 515 - 517 nm Khi DPPH phản ứng với hợp chất có thể cho phân tử hydrogen, thì màu tím đ ặc trưng của DPPH giảm xuống [39] Vì vậy, phương pháp này dùng để sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất thu nhận được trong nhiều nghiên cứu
Hình 2.5 C ấu trúc DPPH ở trạng thái tự do (có màu tím đặc trưng)
Trang 12Vật liệu – Phương pháp
Hình 2.6 C ấu trúc DPPH mất gốc tự do (có màu vàng)
2.2.6 Định lượng hợp chất nhóm stilbene
2.2.6.1 Bán định lượng bằng phương pháp phổ tử ngoại
Nguyên t ắc: Mỗi hợp chất có màu đều có phổ đồ đặc trưng ở độ dài sóng
hấp thu chuyên biệt, chẳng hạn như trans – resveratrol được hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 308 nm [10,43] , trans – pterostilbene có phổ đồ đặc trưng ở độ dài sóng
hấp thu 308 nm [43] Do đó, khi đo mật độ quang ở bước sóng đặc trưng cho chất chuẩn có nồng độ khác nhau sẽ có một đường chuẩn tuyến tính của mật độ quang
với nồng độ chất chuẩn đó Từ đó, với bất kỳ hổn hợp nào có chứa hợp chất này, chỉ
cần xác định mật độ quang của nó ở bước sóng hấp thu đặc trưng đó, nồng độ hợp
chất có trong dung dịch đem đo sẽ được xác định Hàm lượng stilbene được suy ra
dựa vào đường cong phổ hấp thu ở bước sóng 308 nm của resveratrol chuẩn Resveratrol được xem là đại diện của nhóm stilbene trong rễ cây đậu phộng [13]
Các bước tiến hành:
Xây dựng đường chuẩn:
Resveratrol được cân chính xác và được hòa tan trong dung môi methanol để đạt nồng độ 1 mg/ml, sau đó được pha loãng thành các dung dịch có nồng độ từ
0,005 mg/ml đến 0,030 mg/ml Đo mật độ quang của các dung dịch được pha ở bước sóng 308 nm; trong đó, dung môi methanol có giá trị ABS = 0
Trang 13Định lượng hợp chất có trong dịch được tách chiết: Pha loãng dung dịch có
chứa hợp chất cần định lượng cho đến khi mật độ quang của chúng nằm trong khoảng giới hạn các mật độ quang có trong đường chuẩn Dựa vào phương trình đường chuẩn y = 113,7x – 0,068 với y là giá trị OD và x là nồng độ resveratrol (mg/ml), suy ra nồng độ hợp chất tương ứng trong dung dịch đem đo, từ đó quy về hàm lượng hợp chất có trong hỗn hợp ban đầu
y = 113,7x - 0,068 R² = 0,994
-.500 000 500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500 4.000
Trang 14Vật liệu – Phương pháp
2.2.6.2 Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Trong luận văn này, phương pháp HPLC-UV được gửi phân tích tại phòng thí nghiệm phân tích trung tâm thuộc Trường ĐH Khoa học tự nhiên, TP HCM
2.2.7 Phương pháp xử lý thống kê
Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với số mẫu trên mỗi nghiệm thức từ 30-35
mẫu Số liệu thu được từ kết quả của các thí nghiệm được xử lý thống kê bằng phần
mềm Microsoft Excel 2007, SPSS 16.0 phân nhóm các giá trị bằng phương pháp Duncan và so sánh các giá trị bằng phương pháp Dunnett Kết quả được trình bày ở
dạng: trung bình ± sai số (Mean ± SE)
2.3.1 Kh ảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tơ
2.3.1.1 Kh ảo sát loại mô thích hợp để tạo rễ tơ
Hầu hết các mô và cơ quan thực vật gồm trục hạ diệp, lá, trục thượng diệp,
cuống lá được xâm nhiễm đều có thể được chuyển gen bởi A rhizogenes dẫn đến
cảm ứng hình thành rễ tơ Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen thì phụ thuộc vào sự
tương tác giữa vi khuẩn A rhizogenes với từng loại mô, từng loại tế bào [55] Vì
vậy, thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định nguồn nguyên liệu đầu phù hợp để
cảm ứng tạo rễ tơ Lá, cuống lá, trụ thượng diệp, tử diệp, trụ hạ diệp của cây 20 ngày tuổi được cắt và tạo vết thương được sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu
để khảo sát sự tạo rễ tơ sau khi xâm nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
Trang 15Vật liệu – Phương pháp
Thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn là 15 phút và thời gian đồng nuôi
cấy là 72 giờ [28,32]
Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ và số rễ tơ tạo ra trên
mỗi mẫu sau 14 - 21 ngày nuôi cấy Mẫu đối chứng là các khúc cắt được nuôi cấy không được gây nhiễm với vi khuẩn, cũng được nuôi cấy trên trên các môi trường tương tự Số mẫu thực hiện trên cảm ứng ở mỗi loại bộ phận là 30 – 45 mẫu
2.3.1.2 Kh ảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên quá trình cảm ứng tạo rễ tơ
Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gene từ
Agrobacterium vào tế bào thực vật là thời gian đồng nuôi cấy [55] Thí nghiệm được tiến hành nhằm tìm thời gian đồng nuôi cấy cho hiệu suất chuyển gen tạo rễ tơ cao nhất Sau khi tiến hành khảo sát loại mô, ta chọn được nguồn vật liệu đầu phù
hợp cho sự cảm ứng tạo rễ tơ ở đậu phộng Mẫu sau khi được nhúng trong dịch khuẩn 15 phút, được chuyển sang giấy thấm vô trùng để giảm độ ẩm trên bề mặt
mẫu và sau đó chuyển lên môi trường MS không có chất điều hòa sinh trư ởng để đồng nuôi cấy Thời gian đồng nuôi cấy được bố trí lần lượt: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ,
96 giờ, 120 giờ Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng ra rễ tơ Số mẫu trên
mỗi nghiệm thức là 45 mẫu Lặp lại 3 lần
2.3.1.3 Kh ảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm mẫu trong dịch khuẩn đến
vi ệc hình thành rễ tơ
Trong các nghiên cứu về cảm ứng tạo rễ tơ, mỗi tác giả sử dụng một thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn đã hoạt hóa Vì vậy, thí nghiệm này được
tiến hành nhằm tìm thời gian nhúng mẫu trong dịch khuẩn thích hợp tạo rễ tơ nhiều
nhất Thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn lần lượt: 5, 10, 15, 20, 25, 30 phút Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ
Trang 16Vật liệu – Phương pháp
2.3.2 Chứng minh sự chuyển gen rolB, rolC thành công và khảo sát khả
năng sinh trưởng rễ tơ trong môi trường lỏng lắc
2.3.2.1 Ki ểm tra sự chuyển gen
Kiểu hình rễ tơ là sự biểu hiện của việc tái tổ hợp các gen từ T-DNA (chẳng
hạn rol và aux) của Ri plasmid vào trong tế bào thực vật Do đó, kiểm tra chuyển
gen thành công có 2 cách: phương pháp trực tiếp phát hiện thông qua T-DNA hoặc gián tiếp phát hiện thông qua opine Phương pháp trực tiếp thường được sử dụng hơn vì trong m ột số trường hợp opine tại ra không bền Để phát hiện T-DNA, phương pháp PCR hay Northern Blot thường được sử dụng [61] Trong đó, phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi của các gen rolA, rolB, rolC, rolD và aux1 để kiểm
tra sự chuyển gen vào tế bào.[49]
Thí nghiệm được tiến hành gồm các bước: tách chiết Ri – plasmid của
Agrobacterium rhizogenes sử dụng làm chứng dương; tách chiết DNA bộ gen của
rễ cây đậu phộng in vitro để làm mẫu đối chứng; tách chiết DNA bộ gen của rễ tơ
được cảm ứng từ mẫu lá, trụ hạ diệp, trụ thượng diệp, tử diệp, cuống lá để kiểm tra;
thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi của gen rolB, rol C; điện di xem sản phẩm
Trang 17Vật liệu – Phương pháp
Sơ đồ 2.2 Quy trình tách chiết DNA bộ gen thực vật
Vi khuẩn A rhizogenes phát triển đến giữa pha tăng trưởng (OD = 0,5 - 1)
được thu nhận sinh khối để tách plasmid theo quy trình của Curier và Nester (1976) [
Tách plasmid của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
1 ml EtOH 100% lạnh, ủ 0oC qua đêm
C
Trang 18Vật liệu – Phương pháp
Sơ đồ 2.3 Quy trình tách chiết DNA plasmid
Ch ứng minh sự hiện diện của gen chuyển bằng PCR:
10-15 ml dịch khuẩn A rhizogenes
Ly tâm 6000 rpm/15 phút Thu tủa vào eppendolf 1,5 ml Sinh khối giữ trong gel lạnh
100 µl dung dịch I Votex kĩ
100 µl TE 0,1X, để lạnh
200 µl dung dịch II, đảo nhẹ
600 µl phenol:chloroform (1:1), đảo nhẹ
100 µl dung dịch III đảo nhẹ
Ly tâm 13000 rpm/5 phút, thu dịch nổi
Trang 19Mồi xuôi, 10 pmol/µl
Mồi ngược, 10 pmol/µl
DEPC-H2
1,5
1
1 17,75 1,5 1,25
1
25
O
Dream Taq buffer
Dream Taq DNA polymerase, 1 U/µl
DNA khuôn
Tổng thể tích phản ứng
Lần lượt đặt phản ứng cho các cặp mồi của gen rolB và rolC
B ảng 2.5: Chương trình khuếch đại cặp mồi RolBF-RolBR, rolCF-rolCR
Các bước khuếch đại Nhiệt độ (o
0:30 0:30 1:00