BÁO CÁO THỰC TẬP-MÔI TRƯỜNG NB-VẬT LIỆU-PHƯƠNG PHÁP Tạo cây con in vitro

PHẦN 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 20 Vật liệu – Phương pháp 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Đối tượng - Hạt cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.) được mua ở Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu, quận 1, Tp. Hồ Chí Minh. Hình 2.1. Hạt đậu phộng (Arachis hypogaea L.) giống VD1 - Chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được mua từ ngân hàng RIKEN-BRC thông qua dự án của MEXT, Nhật Bản. 21 Vật liệu – Phương pháp Hình 2.2. Khuẩn lạc của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 2.1.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường Murashige và Skoog (MS) (phụ lục1): Môi trường muối khoáng đa lượng và vi lượng MS, bổ sung saccharose dùng để nuôi cấy mô thực vật in vitro. - Môi trường Nutrient Broth (NB) (phụ lục1): Môi trường NB sử dụng để tăng sinh vi khuẩn A. rhizogenes ATCC 15834 - Các tác nhân cảm ứng: nhôm clorua, natri acetate, vi khuẩn - Tiền chất bổ sung: phenylalanine 22 Vật liệu – Phương pháp 2.1.3. Hóa chất sử dụng 2.1.3.1. Hóa chất sử dụng trong thử hoạt tính kháng oxi hóa - Phương pháp Yen và Duh: Vitamine E (α-tocopherol), Potassium ferricyanide (K 3 (Fe(CN) 6 )), acid tricloroacetic, NaH 2 PO 4 . 2H 2 O, Na 2 HPO 4 .12H 2 O, FeCl - Phương pháp DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 3 2.1.3.2. Hóa chất PCR (Polymerase chain reaction) - Các hóa chất: Dream Taq DNA polymerase, Dream Taq buffer (Fermentas), dNTPs 2mM (Fermentas), nước siêu sạch. - Mồi sử dụng: • Mồi khuếch đại gen rolB Gen rolB được khuếch đại với cặp mồi rolBF và rolBR. Sản phẩm khuếch đại được phát hiện và kết quả dương tính sẽ cho một vạch có kích thước 423 bp [22, 37]. Bảng 2.1. Đặc điểm của cặp mồi rolBF và rolBR Mồi rolBF rolBR Trình tự 5’-GCT CTT GAC GTG CTA GAT TT-3’ 5’-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC-3’ Chiều dài (bp) 20 20 Trọng lượng phân tử (g/mol) 6114,0 6102,0 Nhiệt độ nóng chảy (G/C) 53,0 55,3 • Mồi khuếch đại gen rolC 23 Vật liệu – Phương pháp Gen rolC được khuếch đại với cặp mồi rolCF và rolCR. Sản phẩm khuếch đại được phát hiện và kết quả dương tính sẽ cho một vạch có kích thước 626 bp [22, 37]. Bảng 2.2. Đặc điểm của cặp mồi rolCF và rolCR Mồi rolCF rolCR Trình tự 5’-CTC CTG ACA TCA AAC TCG TC-3’ 5’-TGC TTC GAG TTA TGG GTA CA-3’ Chiều dài (bp) 20 20 Trọng lượng phân tử (g/mol) 5996,9 6163,0 Nhiệt độ nóng chảy (G/C) 52,9 53,3 2.1.3.3. Hóa chất tách chiết và điện di - Các dung môi hữu cơ: hexane, chloroform, ethyl acetate, methanol. - Hóa chất tách chiết DNA: CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide), phenol, chloroform, nitơ lỏng, TE (Tris – EDTA), ethanol. - Hóa chất tách chiết plasmid: Dung dịch I gồm glucose 50 mM, Tris HCl 2,5 mM pH 8 và EDTA 10 mM pH 8. Dung dịch II gồm SDS 10% và NaOH 5N. Dung dịch III gồm KOAc 5M và glacial acetic 0.2M. - Hóa chất điện di: Agarose, dung dịch TAE (Tris-Acetate-EDTA), ethidium bromide, dung dịch nạp mẫu (glycerol, bromophenol blue, xyencyanol). 24 Vật liệu – Phương pháp 2.1.4. Địa điểm thí nghiệm - Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thực vật và chuyển hóa sinh học và Phòng thí nghiệm sinh học phân tử B, Trường Đại học Khoa học Tư nhiên Tp. Hồ Chí Minh. 2.2. Phương pháp 2.2.1. Tạo cây con in vitro - Thao tác ngoài tủ cấy: Các hạt được tách vỏ, rửa sạch bằng xà phòng, sau đó được rửa lại bằng nước cất cho sạch xà phòng. Erlen chứa hạt được đậy bằng giấy bạc và đưa vào tủ cấy vô trùng. - Thao tác trong tủ cấy vô trùng: Tiến hành lắc với cồn 70 o trong khoảng 30 giây đến 1 phút. Tiếp đó, ngâm và lắc hạt trong dung dịch sodium hypochlorite (NaOCl) 1,5% trong 7 phút. Sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 5 lần. Các hạt được cấy lên môi trường MS có bổ sung saccharose (30 g/l) và agar (7,5 g/l). Sau 5 ngày thì hạt nãy mầm với điều kiện chiếu sáng 16 giờ trong ngày, cường độ ánh sáng 2500 lux, nhiệt độ 25 – 28 o C. 25 Vật liệu – Phương pháp Hình 2.3. Cây đậu phộng in vitro 2.2.2. Cảm ứng tạo rễ tơ 26 Vật liệu – Phương pháp Hình 2.4. Quy trình tạo rễ tơ Rễ tơ được tạo ra thông qua sự chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 được hoạt hóa trên môi trường lỏng NB lắc với vận tốc 100 - 130 vòng/phút trong 48 giờ ở 25 o C vào tế bào thực vật. Vi khuẩn sau khi hoạt hóa được cấy vào môi trường NB để tăng sinh khối. Khi A. rhizogenes phát triển đến giữa pha tăng trưởng (mid-log phase) với OD 600 28 = 0,5 được dùng để gây nhiễm nhằm chuyển gen. Các mẫu (tử diệp, trụ thượng diệp, trụ hạ diệp, lá, cuống lá) được cắt và tạo vết thương được nhúng vào dịch khuẩn A. rhizogenes. Thời gian ngâm mẫu trong dịch khuẩn là 15 phút. Sau đó, các mẫu cấy được đặt lên giấy thấm vô trùng, để khô bề mặt và chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật để thực hiện quá trình đồng nuôi cấy. Quá trình đồng nuôi cấy được thực hiện trong tối. Sau thời kỳ đồng nuôi cấy, mẫu được rửa với môi trường MS lỏng có bổ sung cefotaxime (250 mg/l) để loại vi khuẩn trên bề mặt mẫu. Sau khi rửa, mẫu được chuyển vào nuôi cấy trên môi trường MS rắn bổ sung cefotaxime (250 mg/l) để loại bỏ vi khuẩn và cảm ứng tạo rễ tơ. Sau 2-3 tuần nuôi cấy, rễ tơ được tao thành từ vết thương. [ , 61] 2.2.3. Phương pháp PCR và điện di 2.2.3.1. Phương pháp PCR Nguyên tắc của phương pháp: Tất cả DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR được hình thành dựa vào đặc tính đó của các DNA polymerase. Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự 27 Vật liệu – Phương pháp đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các mồi này gọi là mồi xuôi và mồi ngược.[2] 2.2.3.2. Điện di Nguyên tắc của phương pháp 2 : Phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu rúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử trong gel phụ thuộc vào hai chỉ tiêu: khối lượng phân tử nucleotide hay cặp nucleotide và nồng độ các chất cấu thành gel.[ ] Mục tiêu của điện di 2.2.4. Phương pháp tách chiết hợp chất : Phân tích và kiểm tra kích thước của sản phẩm khuếch đại PCR. 2.2.4.1. Điều chế các loại cao Mỗi loài cây đều chứa nhiều loại hợp chất hữu cơ, từ loại không phân cực đến loại rất phân cực, vì thế dung môi được sử dụng điều chế cao có độ phân cực tăng dần [5]. Xử lý nguyên liệu: Rễ tơ sau 25 ngày nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc được rửa sạch môi trường nuôi cấy, ghi nhận trọng lượng tươi. Quy trình điều chế cao xử dụng máy Soxhlet: Rễ tơ tươi Methanol Sấy khô ở 40 o C tới khối lượng không đổi Xay nhuyễn Bột khô Tận trích với các dung môi khác nhau trong dụng cụ Soxhlet Cô cạn dung môi ở 40 o C Hexane Chloroform Ethyl acetate 28 Vật liệu – Phương pháp Sơ đồ 2.1. Sơ đồ điều chế cao Các loại cao thu nhận được được dùng để khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa và định tính stilbene. 2.2.4.2. Phương pháp tách chiết rễ tươi và dung dịch môi trường nuôi cấy. Sinh khối rễ tơ tươi 5 : mẫu được ngâm đông lạnh trong nitơ lỏng, rồi nghiền giã cho thật mịn trước khi được ngâm trong dung môi methanol trong 30 phút trước khi lọc, dịch lọc đem xác định hàm lượng hợp chất.[ ] Dung dịch môi trường nuôi cấy rễ tơ 2.2.5. Xác định hoạt tính kháng oxi hóa : hòa dung môi ethyl acetate vào dịch môi trường, hỗn hợp dung môi và dịch môi trường được trộn đều trong 30 phút, sau đó hổn hợp được lắng, thu lấy phân đoạn ethyl acetate để xác định hàm lượng. 2.2.5.1. Phương pháp thử năng lực khử (Phương pháp Yen và Duh) Năng lực khử của một chất là khả năng chất đó cho điện tử khi tham gia phản ứng oxy hóa khử. Do đó, năng lực khử cũng biểu hiện khả năng kháng oxy hóa của một chất. Trong phương pháp của Yen và Duh (1993) [59], chất khử sẽ khử potassium ferricyanide (K 3 (Fe(CN) 6 )) thành potassium ferrocyanide (K 4 (Fe(CN) 6 )), hay nói cách khác ion Fe 3+ trong phân tử potassium ferricyanide bị [...]... được thực hiện với mục tiêu so sánh hoạt tính kháng oxi hóa giữa các loại cao và resveratrol chuẩn Vật liệu – Phương pháp 41 Thử nghiệm tăng sinh hàm lượng stilbene trong nuôi cấy rễ tơ bằng 2.3.4 phương pháp bổ sung tiền chất và chất cảm ứ ng 2.3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung phenylalanine lên sự sinh tổng hợp stilbene trong rễ tơ cây đậu phộng Phenylalanine là tiền chất trong con đường sinh... của Ri plasmid vào trong tế bào thực vật Do đó, kiểm tra chuyển gen thành công có 2 cách: phương pháp trực tiếp phát hiện thông qua T-DNA hoặc gián tiếp phát hiện thông qua opine Phương pháp trực tiếp thường được sử dụng hơn v trong m ột số trường hợp opine tại ra không bền Để phát hiện T-DNA, ì phương pháp PCR hay Northern Blot thường được sử dụng [61] Trong đó, phương pháp PCR sử dụng các cặp mồi của... trị bằng phương pháp Duncan và so sánh các giá trị bằng phương pháp Dunnett Kết quả được trình bày ở dạng: trung bình ± sai số (Mean ± SE) Phương pháp bố trí thí nghiệm 2.3 Phương pháp nghiên cứu chung gồm có khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cảm ứng tạo rễ tơ Sau đó kiểm tra sự chuyển gen tạo rễ tơ của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes sang bộ gen của thực vật bằng phương pháp PCR Tiếp theo... từng loại tế bào [55] Vì vậy, thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định nguồn nguyên liệu đầu phù hợp để cảm ứng tạo rễ tơ Lá, cuống lá, trụ thượng diệp, tử diệp, trụ hạ diệp của cây 20 ngày tuổi được cắt và tạo vết thương được sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban đầu để khảo sát sự tạo rễ tơ sau khi xâm nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes Vật liệu – Phương pháp 33 Thời gian nhúng mẫu trong dung dịch... chứng dương; tách chiết DNA bộ gen của rễ cây đậu phộng in vitro để làm mẫu đối chứng; tách chiết DNA bộ gen của rễ tơ được cảm ứng từ mẫu lá, trụ hạ diệp, trụ thượng diệp, tử diệp, cuống lá để kiểm tra; thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi của gen rolB, rol C; điện di xem sản phẩm PCR Tách DNA bộ gen thực vật DNA bộ gen đâu phộng được tách chiết theo phương pháp CTAB của Stewart và Via (1993) [52] đã... hành nhằm tìm thời gian nhúng mẫu trong dịch khuẩn thích hợp tạo rễ tơ nhiều nhất Thời gian nhúng mẫu trong dung dịch vi khuẩn lần lượt: 5, 10, 15, 20, 25, 30 phút Chỉ tiêu theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ Vật liệu – Phương pháp 34 2.3.2 Chứng minh sự chuyển gen rolB, rolC thành công và kho sát khả ả năng sinh trưởng rễ tơ trong môi trường lỏng lắc 2.3.2.1 Kiểm tra sự chuyển gen Kiểu hình rễ... sinh tổng hợp stilbene Phenylalanine trong môi trường nuôi cấy ban đầu được bổ sung ở các nồng độ khác nhau: 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 mM Chỉ tiêu theo dõi là hàm ư ợng stilbene trong l sinh khối rễ tơ và trong dung dịch môi trường sau 21 ngày nuôi cấy 2.3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ natri acetate lên sự sinh tổng hợp stilbene Natri acetate được bổ sung vào môi trường nuôi cấy rễ tơ đậu phộng... sinh khối rễ tơ và trong môi trường nuôi cấy [38] Mẫu đối chứng là rễ tơ không có bổ sung natri acetate 2.3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhôm clorua lên sự sinh tổng hợp stilbene Nhôm clorua được bổ sung vào môi trường nuôi cấy rễ tơ ở các nồng độ 0,3; 0,6; 0,9; 1,2 mM vào ngày thứ 19 của quá trình nuôi cấy lỏng lắc Sau 2 ngày bổ sung, khảo sát hàm lượng stilbene trong môi trường nuôi cấy và trong sinh... theo dõi là phần trăm mẫu cảm ứng tạo rễ tơ và số rễ tơ tạo ra trên mỗi mẫu sau 14 - 21 ngày nuôi cấy Mẫu đối chứng là các khúc cắt được nuôi cấy không được gây nhiễm với vi khuẩn, cũng được nuôi cấy trên trên các môi trường tương tự Số mẫu thực hiện trên cảm ứng ở mỗi loại bộ phận là 30 – 45 mẫu 2.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy lên quá trình cảm ứng tạo rễ tơ Một trong những yếu... dung dịch đem đo, từ đó quy về hàm lượng hợp chất có trong hỗn hợp ban đầu Vật liệu – Phương pháp 32 2.2.6.2 Định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Trong luận văn này, phương pháp HPLC-UV được gửi phân tích tại phòng thí nghiệm phân tích trung tâm thuộc Trường ĐH Khoa học tự nhiên, TP HCM Phương pháp xử lý thống kê 2.2.7 Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần với số mẫu trên mỗi nghiệm thức . Vật liệu – Phương pháp Hình 2.2. Khuẩn lạc của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834 2.1.2. Môi trường nuôi cấy Môi trường Murashige và Skoog (MS) (phụ lục1): Môi trường muối khoáng. Phương pháp 2.1.4. Địa điểm thí nghiệm - Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thực vật và chuyển hóa sinh học và Phòng thí nghiệm sinh học phân tử B, Trường. để khô bề mặt và chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật để thực hiện quá trình đồng nuôi cấy. Quá trình đồng nuôi cấy được thực hiện trong tối. Sau thời kỳ