BÁO CÁO THỰC TẬP-Giới thiệu phương pháp ELISA

Trong phương pháp này, kháng thể hay kháng nguyên có gắn chất đánh dấu phóng xạ và sự hiện diện của chúng được xác định thông qua tín hiệu phóng xạ.. Tuy nhiên, để tín hiệu này được sử d

1

Ngày nay, để phòng tránh các căn bệnh hiểm nghèo, phát hiện các yếu tố lạ trong thực phẩm cây trồng, người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp vật lý, phương pháp giải phẫu bệnh – sinh thiết và phương pháp hóa sinh, hoặc kết hợp các phương pháp này Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng Tuy nhiên, phương pháp đơn giản, giá thành xét nghiệm rẻ và tương đối chính xác, được phổ biến hiện nay là ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme

Hà Nội, 14/4/2012

I Giới thiệu phương pháp ELISA

1 Lịch sử phát triển

Vào năm 1960, Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Berson Prior mô tả phương pháp miễn dịch có gắn chất phóng xạ (radioimmunoassay) dùng để xác định kháng nguyên, kháng thể Trong phương pháp này, kháng thể hay kháng nguyên có gắn chất đánh dấu phóng xạ và sự hiện diện của chúng được xác định thông qua tín hiệu phóng xạ Tuy vậy, các chất phóng xạ lại tiềm ẩn mối nguy hiểm vì vậy người ta nghĩ đến một phương pháp mới trong đó tín hiệu được phát ra không phải nhờ phóng xạ Khi đó người ta đã biết rằng một số loại enzyme như các peroxidase phản ứng với một số cơ chất nhất định như Tetramethylbenzidine hay 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid sẽ phát màu Màu sinh

ra từ các phản ứng này có thể được sử dụng làm tín hiệu nhận biết (tín hiệu chỉ thị) Tuy nhiên, để tín hiệu này được sử dụng như chất phóng xạ trong radioimmunoassay, tín hiệu màu phát ra phải đồng nghĩa với sự có mặt của kháng thể hay kháng nguyên Chính

vì vậy, giải pháp được đưa ra là enzyme sẽ được gắn với kháng nguyên hay kháng thể

Kỹ thuật gắn kết enzyme với kháng nguyên hay kháng thể được phát triển bởi Stratis Avrameas và G.B Pierce Tiếp sau đó, vào năm 1966, Wide và Porath phát triển phương pháp gắn kháng nguyên và kháng thể trên bề mặt rắn (bề mặt của các vi phiếm hay các đĩa) nhờ đó mà kháng nguyên hay kháng thể không được gắn kết sẽ dễ dàng được rửa trôi

Peter Perlmann và Eva Engvall (Thụy Điển) cùng với nhóm Anton Schuurs và Bauke van

2

Weemen (Hà Lan) công bố phương pháp được đặt tên ELISA (EIA) dựa trên tất cả những bước phát triển nói trên Phương pháp chính thức ra đời vào năm 1971

2 Khái niệm về ELISA

Định nghĩa: ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme

ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm

*Chú thích:

Kháng nguyên (antigen) là những chất có khả năng huy động hệ miễn dịch và gây một

phản ứng miễn dịch Kháng nguyên bao gồm protein lạ, acid nucleic, một số lipide và polysaccharide Chưa biết gắn trên bề mặt

Kháng thể (antibody) tạo thành phần gramma globulin trong các protein máu Kháng

thể là những protein hòa tan do các tế bào B hay tương bào tiết ra để đáp ứng với một kháng nguyên và chúng có thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên đó

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và chất tạo màu; thực hiện qua hai bước:

- Phản ứng miễn dịch học: Là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

- Phản ứng hóa học: Thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phóng oxy nguyên

tử [O] từ H2O2 để oxy hóa cơ chất chỉ thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch thí nghiệm

Enzyme thường được sử dụng là :

+ Peroxidase

+ Beta – galactoxidase

+ Alkaline phosphatase

3 Ưu điểm và hạn chế

3

Kĩ thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở một nồng độ rất thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) thì kĩ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh

Ưu điểm:

+Dễ thực hiện

+ Có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu

+ Có thể phát hiện kháng thể IgM, IgG, IgA và IgE

Hạn chế:

+ Đòi hỏi thời gian (có kết quả sau 5h)

+ Thiết bị mắc tiền

II Phân loại

1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)

Đây là dạng đơn giản nhất của phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn enzyme)

Quy trình thực hiện:

4

Ưu nhược điểm:

 Ưu điểm:

+ Đơn giản nhất, Nhanh chóng bởi vì chỉ có một kháng thể và trải qua ít bước hơn

+ Phản ứng của kháng thể thứ cấp được loại bỏ

 Nhược điểm:

+ Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1 kháng thể gắn vào một epitope

+ Phản ứng miễn dịch của kháng thể chính có thể ảnh hưởng bất lợi bằng cách tác dụng với các enzyme

+ Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng

+ Không có sự linh hoạt trong lựa chọn kháng thể chính từ một thí nghiệm khác + Khuếch đại tín hiệu tối thiểu

5

Áp dụng:

- Phát hiện nhiễm HIV ở trẻ sơ sinh được sinh ra từ mẹ nhiễm HIV

- Phát hiện sớm giai đoạn mới nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) hoặc khi kết quả phát hiện

KT không rõ ràng

- Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu quả điều trị thuốc kháng virút và trong các mục đích nghiên cứu khác

2 Indirect ELISA (ELISA gián tiếp)

Phương pháp này khác Direct ELISA ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không được gắn enzyme mà nó là mục tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác (kháng thể này mới là kháng thể được gắn với enzyme)

Quy trình thực hiện:

- Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa) Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết

- Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác Kháng nguyên chưa biết

6

được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn

- Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn) Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa

- Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh

- Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme)

- Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ

- Thêm cơ chất Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại)

Ưu nhược điểm:

 Ưu điểm:

+ Bước cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này

+ Kháng thể gắn enzyme có thể sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi và kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa

+ Linh hoạt bởi vì các kháng thể nhiều chính có thể được thực hiện trong một loài

và cùng một kháng thể thứ cấp có thể được sử dụng để phát hiện

+ Độ nhạy sáng được tăng lên bởi vì mỗi kháng thể chính chứa các epitope một số

có thể được ràng buộc bởi các kháng thể thứ cấp , cho phép khuếch đại tín hiệu

 Nhược điểm:

+ Độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau Điều này dẫn đến kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được

7

+ Phản ứng có thể xảy ra với kháng thể thứ cấp, dẫn đến tín hiệu không đặc hiệu + Một bước ủ bệnh thêm là cần thiết trong thủ tục

3 Sandwich ELISA

Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó cho phản ứng mạnh và nhạy Được gọi là “sandwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua

sự kết hợp của hai loại kháng thể là kháng thể bắt (capture antibodies) và kháng thể phát hiện (detection antibodies) Kỹ thuật này cũng được phân làm hai dạng là Direct

sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) và Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich)

3.1 Sandwich ELISA trực tiếp

- Ưu điểm: Có thể phát hiện sự khác biệt nhỏ giữa các kháng nguyên nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện khác nhau

- Vì phương pháp này có ưu điểm hơn hẳn những phương pháp khác mà chúng tôi chọn phương pháp này để chẩn đoán bệnh virus đang nghiên cứu

8

Chú ý: nếu sử dụng kháng thể bắt và kháng thể phát hiện giống nhau có thể dẫn đến vấn

đề nếu có sự giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát hiện Mối quan hệ về kích thước và vị trí không gian của các epitope cũng có ảnh hưởng đến thử nghiệm

3.2 Sandwich ELISA gián tiếp

Chuyên biệt hơn Direct sanwich ELISA do antispecies kháng thể được gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên

4 ELISA cạnh tranh

Quy trình thực hiện:

+ “Ủ” kháng thể không được đánh dấu với kháng nguyên

+ Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa kháng nguyên

+ Rửa đĩa, kháng thể không được gắn kết sẽ bị rửa trôi Lượng kháng nguyên càng lớn, lượng kháng thể gắn thành công với kháng nguyên trong đĩa càng thấp do “cạnh tranh”

9

+ Thêm kháng thể thứ cấp (kháng thể của kháng thể ở bước 1) Kháng thể thứ cấp gắn với enzym

+ Thêm cơ chất Lượng enzym dư sẽ giải phóng tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu màu Trong phương pháp này, hàm lượng kháng nguyên gốc càng cao, tín hiệu sản sinh càng yếu

III Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp

1 Ảnh hưởng đến độ nhạy

 Số lượng kháng thể thứ nhất được gắn vào đáy giếng

 Ái lực của kháng thể thứ nhất đối với kháng nguyên

 Ái lực của kháng thể thứ hai đối với kháng nguyên

2 Ảnh hưởng đến kết quả

 Nếu các đối chứng âm cho kết quả dương tính thì có thể do sự nhiễm từ chất tạo màu hoặc từ kháng thể được đánh dấu hoặc chính các đối chứng bị nhiễm

 Nếu màu không xuất hiện đối với đối chứng dương hoặc đối với mẫu thì phải kiểm tra lại tất cả hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản

 Nếu màu xuất hiện quá thấp đối với đối chứng dương và cả mẫu kiểm tra thì phải kiểm tra lại kháng thể được gắn enzyme và nồng độ của chất tạo màu

 Nếu có tạo màu đối với mẫu nhưng không tạo màu với đối chứng dương thì có thể kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng và điều kiện bảo quản

 Khi chạy lại một thử nghiệm trong điều kiện đang gặp sự cố thì chỉ nên thay đổi một yếu tố thí nghiệm

IV Một số thiết bị sử dụng trong phương pháp ELISA

- Khay nhựa có các giếng

- Máy quang phổ với các bước sóng khác nhau

- Micropipette

- Máy rửa khay nhựa

10

V Ứng dụng

1 Trong thực phẩm

-Phương pháp Elisa có thể phát hiện và định lượng vi sinh trong thực phẩm trong thời gian vài giờ sau khi tăng sinh

-Phát hiện yếu tố gây dị ứng thực phẩm như sữa, đậu phộng, quả óc chó, hạnh nhân và trứng

-Phát hiện độc tố trong tảo

-Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus,sán lá gan… trong thực phẩm

-Phát hiện chất chloramphenicol (chất không được phép có trong tôm, cá và các sản phẩm thuỷ sản khác)

-Kiểm tra dư lượng kháng sinh trong thực phẩm,tàn dư thuốc diệt cỏ,thuốc trừ sâu…

2 Trong nông nghiệp

-Chuẩn đoán bệnh Tristeza(tác nhân gây bệnh héo rũ) trên cây cam quýt

-Giám định sự hiện diện của BBTV(Banana Bunchy Top Virus) gây bệnh chùn đọt chuối -Phát hiện kháng thể chống Mycoplasma hyopnewmonia(MH) ở heo

-Giám định bệnh lùn xoắn lá trên lúa bằng phương pháp DAS ELISA cải tiến

3 Trong y học

-Chuẩn đóan và điều trị bệnh viêm gan siêu vi B và C,bệnh ung thư

-Ứng dụng để phát hiện bệnh A cantonensis (bệnh viêm màng não) do loại giun kí sinh ở phổi chuột gây ra

- Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét ở miền Trung-Tây Nguyên

VI Ứng dụng của ELISA trong xét nghiệm HIV

1 Về HIV/AIDS

11

AIDS(Acquired Immuno-Deficiency Syndrome) là hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải gây ra bởi HIV (Human Immuno-Deficiency virus)

AIDS xảy ra do sự tấn cơng HIV vào tế bào của hệ miễn dịch Trước hết là làm suy giảm

số lượng và rối loạn chức năng của tế bào miễn dịch dẫn dến hàng loạt rối loạn khác của

hệ miễn dịch, gây ra suy giảm miễn dịch nghiêm trọng, tạo điều kiện cho nhiễm trùng cơ hội phát triển, cuối cùng là tử vong

Cấu trúc HIV:

HIV cĩ đặc điểm chung của họ retroviridae Hạt virus hồn chỉnh (virion) cĩ cấu trúc gồm 3 lớp

- Lớp vỏ ngồi (vỏ peplon): lớp này là 1 màng lipid kép cĩ kháng nguyên chéo với màng

nguyên sinh chất tế bào Gắn lên màng này là các nhú, đĩ là các phân tử Glycoprotein cĩ trọng lượng phân tử 160 kilodalton (gp160) Nĩ gồm cĩ 2 phần:

+ Glycoprotein màng ngồi :cĩ trọng lượng phân tử là 120 kilodalton (gp120) GP120 là kháng nguyên đã biến đổi nhất, gây khĩ khăn cho phản ứng bảo vệ cơ thể và chế vaccin phịng bệnh

+Glycoprotein xuyên màng: cĩ trọng lượng phân tử 41 kilodalton

- Vỏ trong (vỏ capsid): vỏ này gồm 2 lớp protein:

+ Lớp ngồi hình cầu, cấu tạo bởi protein cĩ trọng lượng phân tử 18 kilodalton (p18) + Lớp trong hình trụ, cấu tạo bởi các phân tử cĩ trọng lượng phân tử là 24 kilodalton (p24) Đây là kháng nguyên rất quang trọng để chẩn đốn nhiễm HIV/AIDS

- Lõi: Là những thành phần bên trong của vỏ capsid, bao gồm:

+ Hai phân tử ARN đơn, đĩ là bộ gen di truyền HIV(genom).Genom của HIV chứa 3 gen cấu trúc: Gag (group specific antigen) là các gen mã hố cho các kháng nguyên đặc hiệu của capsid cuả virus; Pol (polymerase) mã hố cho các Enzym: reverve transcriptase (RT:Enzym sao mã ngược), protease và endonuclease (cịn gọi kháng nguyên integrase);

và EnV (envelop) mã hố cho glycoprotein lớp vỏ peplon của HIV

2 Nguyên lý của phương pháp ELISA phát hiện kháng thể kháng HIV

12

Elisa gián tiếp

Kháng thể kháng HIV có trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên virút HIV đã được cố định sẵn trên giá đỡ (các giếng phản ứng trên phiến nhựa)

Phức hợp kháng nguyên -kháng thể này được nhận biết đặc hiệu bởi một cộng hợp là một kháng thể kháng immunoglobuline người (Ig) có gắn enzyme và sẽ cho phản ứng hiện màu với một cơ chất thích hợp Giá trị mật độ quang của phản ứng màu (OD: optical density) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử

Elisa cạnh tranh

Nguyên tắc của kỹ thuật dựa trên sự cạnh tranh giữa kháng thể kháng HIV có trong mẫu thử với cộng hợp là kháng thể kháng HIV đã gắn với enzyme để được gắn lên các kháng nguyên đã cố định trên giếng Giá trị mật độ quang (OD) tỷ lệ nghịch với lượng kháng thể trong mẫu thử

Sanwich elisa

Kháng thể kháng HIV trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên cố định trên giếng và được phát hiện bởi cộng hợp là các kháng nguyên virút gắn enzyme Giá trị mật

độ quang của phản ứng màu (OD) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử

Các thế hệ sinh phẩm

Sinh phẩm thế hệ thứ nhất sử dụng kháng nguyên là vi rút toàn phần được ly giải và tinh chế từ các tế bào đã gây nhiễm với HIV Các sinh phẩm này có độ nhạy và độ đặc hiệu hạn chế

Sinh phẩm thế hệ thứ hai dùng các kháng nguyên là protein tái tổ hợp hoặc protein tổng hợp Sinh phẩm có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn

Sinh phẩm thế hệ ba xử dụng các kháng nguyên tái tổ hợp và các proteine tổng hợp nhưng kháng thể được phát hiện theo nguyên tắc ELISA sandwich Độ nhạy và độ đặc hiệu được cải thiện rõ rệt

Sinh phẩm thế hệ thứ tư phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng thể có trong mẫu thử Sinh phẩm này cho phép phát hiện nhiễm HIV trước khi có sự chuyển đổi huyết thanh và là sinh phẩm được khuyến cáo nên lựa chọn cho kiểm tra an toàn trong truyền máu

Các sinh phẩm ELISA ngày càng được hoàn thiện để có thể phát hiện sớm và chính xác