BÁO CÁO THỰC TẬP-Giới thiệu phương pháp ELISA

Ngày nay, để phòng tránh bệnh hiểm nghèo, phát yếu tố lạ thực phẩm trồng, người ta sử dụng nhiều phương pháp khác phương pháp vật lý, phương pháp giải phẫu bệnh – sinh thiết phương pháp hóa sinh, kết hợp phương pháp Mỗi phương pháp có ưu nhược điểm riêng Tuy nhiên, phương pháp đơn giản, giá thành xét nghiệm rẻ tương đối xác, phổ biến ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme Hà Nội, 14/4/2012 Giới thiệu phương pháp ELISA I Lịch sử phát triển Vào năm 1960, Rosalyn Sussman Yalow Solomon Berson Prior mô tả phương pháp miễn dịch có gắn chất phóng xạ (radioimmunoassay) dùng để xác định kháng nguyên, kháng thể Trong phương pháp này, kháng thể hay kháng nguyên có gắn chất đánh dấu phóng xạ diện chúng xác định thơng qua tín hiệu phóng xạ Tuy vậy, chất phóng xạ lại tiềm ẩn mối nguy hiểm người ta nghĩ đến phương pháp tín hiệu phát khơng phải nhờ phóng xạ Khi người ta biết số loại enzyme peroxidase phản ứng với số chất định Tetramethylbenzidine hay 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid phát màu Màu sinh từ phản ứng sử dụng làm tín hiệu nhận biết (tín hiệu thị) Tuy nhiên, để tín hiệu sử dụng chất phóng xạ radioimmunoassay, tín hiệu màu phát phải đồng nghĩa với có mặt kháng thể hay kháng nguyên Chính vậy, giải pháp đưa enzyme gắn với kháng nguyên hay kháng thể Kỹ thuật gắn kết enzyme với kháng nguyên hay kháng thể phát triển Stratis Avrameas G.B Pierce Tiếp sau đó, vào năm 1966, Wide Porath phát triển phương pháp gắn kháng nguyên kháng thể bề mặt rắn (bề mặt vi phiếm hay đĩa) nhờ mà kháng nguyên hay kháng thể không gắn kết dễ dàng rửa trôi Peter Perlmann Eva Engvall (Thụy Điển) với nhóm Anton Schuurs Bauke van Weemen (Hà Lan) công bố phương pháp đặt tên ELISA (EIA) dựa tất bước phát triển nói Phương pháp thức đời vào năm 1971 Khái niệm ELISA Định nghĩa: ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫu xét nghiệm *Chú thích: Kháng ngun (antigen) chất có khả huy động hệ miễn dịch gây phản ứng miễn dịch Kháng nguyên bao gồm protein lạ, acid nucleic, số lipide polysaccharide Chưa biết gắn bề mặt Kháng thể (antibody) tạo thành phần gramma globulin protein máu Kháng thể protein hòa tan tế bào B hay tương bào tiết để đáp ứng với kháng nguyên chúng gắn đặc hiệu với kháng nguyên Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể chất tạo màu; thực qua hai bước: - Phản ứng miễn dịch học: Là kết hợp kháng nguyên kháng thể - Phản ứng hóa học: Thơng qua hoạt tính xúc tác enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa chất thị màu, làm thay đổi màu hỗn hợp dung dịch thí nghiệm Enzyme thường sử dụng : + Peroxidase + Beta – galactoxidase + Alkaline phosphatase Ưu điểm hạn chế Kĩ thuật nhạy đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên kháng thể nồng độ thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIARadio Immuno Assay) kĩ thuật rẻ tiền an toàn mà đảm bảo độ xác ELISA dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh Ưu điểm: +Dễ thực + Có thể tiến hành đồng thời nhiều mẫu + Có thể phát kháng thể IgM, IgG, IgA IgE Hạn chế: + Địi hỏi thời gian (có kết sau 5h) + Thiết bị mắc tiền II Phân loại Direct ELISA (ELISA trực tiếp) Đây dạng đơn giản phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể phát kháng thể (kháng thể gắn enzyme) Quy trình thực hiện: Ưu nhược điểm:  Ưu điểm: + Đơn giản nhất, Nhanh chóng có kháng thể trải qua bước + Phản ứng kháng thể thứ cấp loại bỏ  Nhược điểm: + Độ đặc hiệu bị giới hạn thường kháng ngun có epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp sử dụng kháng thể gắn vào epitope + Phản ứng miễn dịch kháng thể ảnh hưởng bất lợi cách tác dụng với enzyme + Phải đánh dấu cho kháng thể chuyên biệt với đối tượng + Khơng có linh hoạt lựa chọn kháng thể từ thí nghiệm khác + Khuếch đại tín hiệu tối thiểu Áp dụng: - Phát nhiễm HIV trẻ sơ sinh sinh từ mẹ nhiễm HIV - Phát sớm giai đoạn nhiễm HIV (giai đoạn cửa sổ) kết phát KT không rõ ràng - Theo dõi diễn tiến bệnh, đánh giá hiệu điều trị thuốc kháng virút mục đích nghiên cứu khác Indirect ELISA (ELISA gián tiếp) Phương pháp khác Direct ELISA chỗ kháng thể bắt kháng ngun khơng gắn enzyme mà mục tiêu gắn đặc hiệu kháng thể khác (kháng thể kháng thể gắn với enzyme) Quy trình thực hiện: - Chuyển kháng nguyên biết lên bề mặt cứng ( gọi chung đĩa) Kháng nguyên cố định bề mặt Nồng độ mẫu kháng nguyên dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ kháng nguyên mẫu chưa biết - Chuyển mẫu kháng nguyên chưa biết vào giếng khác Kháng nguyên chưa biết hòa tan loại dung dịch đệm giống mẫu KN chuẩn - Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) albumin huyết bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất mẫu (kể mẫu chuẩn) Bước gọi "blockin" protein huyết có tác dụng ngăn cản hấp phụ protein khác lên bề mặt đĩa - Rửa bề mặt đĩa sau chuyển kháng thể (biết trước) vào tất giếng đĩa Kháng thể kết hợp với kháng nguyên cố định mà không kết hợp với protein huyết - Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp kết hợp với kháng thể dư (bước bỏ qua kháng thể dùng để phát kháng nguyên gắn với enzyme) - Rửa đĩa, kháng nguyên gắn enzyme dư loại bỏ - Thêm chất Enzyme làm biến đổi chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng yếu tố khuyếch đại) Ưu nhược điểm:  Ưu điểm: + Bước cố định kháng nguyên tính đặc hiệu nên protein gắn với bề mặt đĩa kháng thể (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với protein khác huyết gắn kết với bề mặt đĩa Sandwich ELISA hạn chế nhược điểm + Kháng thể gắn enzyme sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa + Linh hoạt kháng thể nhiều thực loài kháng thể thứ cấp sử dụng để phát + Độ nhạy sáng tăng lên kháng thể chứa epitope số ràng buộc kháng thể thứ cấp , cho phép khuếch đại tín hiệu  Nhược điểm: + Độ đặc hiệu kháng huyết khác Điều dẫn đến kết khác thí nghiệm cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết khác để kết tin tưởng + Phản ứng xảy với kháng thể thứ cấp, dẫn đến tín hiệu khơng đặc hiệu + Một bước ủ bệnh thêm cần thiết thủ tục Sandwich ELISA Đây dạng ELISA sử dụng phổ biến thực tiễn cho phản ứng mạnh nhạy Được gọi “sandwich” kết thí nghiệm đánh giá thơng qua kết hợp hai loại kháng thể kháng thể bắt (capture antibodies) kháng thể phát (detection antibodies) Kỹ thuật phân làm hai dạng Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich) 3.1 Sandwich ELISA trực tiếp - Ưu điểm: Có thể phát khác biệt nhỏ kháng nguyên sử dụng kháng thể bắt kháng thể phát khác - Vì phương pháp có ưu điểm hẳn phương pháp khác mà chọn phương pháp để chẩn đoán bệnh virus nghiên cứu Chú ý: sử dụng kháng thể bắt kháng thể phát giống dẫn đến vấn đề có giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát Mối quan hệ kích thước vị trí khơng gian epitope có ảnh hưởng đến thử nghiệm 3.2 Sandwich ELISA gián tiếp Chuyên biệt Direct sanwich ELISA antispecies kháng thể gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên ELISA cạnh tranh Quy trình thực hiện: + “Ủ” kháng thể không đánh dấu với kháng nguyên + Đưa hỗn hợp vào giếng vi phiếm có chứa kháng nguyên + Rửa đĩa, kháng thể không gắn kết bị rửa trôi Lượng kháng nguyên lớn, lượng kháng thể gắn thành công với kháng nguyên đĩa thấp “cạnh tranh” + Thêm kháng thể thứ cấp (kháng thể kháng thể bước 1) Kháng thể thứ cấp gắn với enzym + Thêm chất Lượng enzym dư giải phóng tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu màu Trong phương pháp này, hàm lượng kháng nguyên gốc cao, tín hiệu sản sinh yếu Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp III Ảnh hưởng đến độ nhạy  Số lượng kháng thể thứ gắn vào đáy giếng  Ái lực kháng thể thứ kháng nguyên  Ái lực kháng thể thứ hai kháng nguyên Ảnh hưởng đến kết Nếu đối chứng âm cho kết dương tính nhiễm từ chất tạo  màu từ kháng thể đánh dấu đối chứng bị nhiễm Nếu màu không xuất đối chứng dương mẫu phải  kiểm tra lại tất hoá chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản Nếu màu xuất thấp đối chứng dương mẫu kiểm tra phải  kiểm tra lại kháng thể gắn enzyme nồng độ chất tạo màu Nếu có tạo màu mẫu không tạo màu với đối chứng dương  kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng điều kiện bảo quản Khi chạy lại thử nghiệm điều kiện gặp cố nên thay đổi  yếu tố thí nghiệm Một số thiết bị sử dụng phương pháp ELISA IV - Khay nhựa có giếng - Máy quang phổ với bước sóng khác - Micropipette - Máy rửa khay nhựa Ứng dụng V Trong thực phẩm -Phương pháp Elisa phát định lượng vi sinh thực phẩm thời gian vài sau tăng sinh -Phát yếu tố gây dị ứng thực phẩm sữa, đậu phộng, óc chó, hạnh nhân trứng -Phát độc tố tảo -Phát vi khuẩn E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus,sán gan… thực phẩm -Phát chất chloramphenicol (chất khơng phép có tôm, cá sản phẩm thuỷ sản khác) -Kiểm tra dư lượng kháng sinh thực phẩm,tàn dư thuốc diệt cỏ,thuốc trừ sâu… Trong nông nghiệp -Chuẩn đoán bệnh Tristeza(tác nhân gây bệnh héo rũ) cam quýt -Giám định diện BBTV(Banana Bunchy Top Virus) gây bệnh chùn đọt chuối -Phát kháng thể chống Mycoplasma hyopnewmonia(MH) heo -Giám định bệnh lùn xoắn lúa phương pháp DAS ELISA cải tiến Trong y học -Chuẩn đóan điều trị bệnh viêm gan siêu vi B C,bệnh ung thư -Ứng dụng để phát bệnh A cantonensis (bệnh viêm màng não) loại giun kí sinh phổi chuột gây - Xác định tỉ lệ nhiễm kí sinh trùng sốt rét miền Trung-Tây Nguyên Ứng dụng ELISA xét nghiệm HIV VI Về HIV/AIDS 10 AIDS(Acquired Immuno-Deficiency Syndrome) hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải gây HIV (Human Immuno-Deficiency virus) AIDS xảy công HIV vào tế bào hệ miễn dịch Trước hết làm suy giảm số lượng rối loạn chức tế bào miễn dịch dẫn dến hàng loạt rối loạn khác hệ miễn dịch, gây suy giảm miễn dịch nghiêm trọng, tạo điều kiện cho nhiễm trùng hội phát triển, cuối tử vong Cấu trúc HIV: HIV có đặc điểm chung họ retroviridae Hạt virus hồn chỉnh (virion) có cấu trúc gồm lớp - Lớp vỏ (vỏ peplon): lớp màng lipid kép có kháng nguyên chéo với màng nguyên sinh chất tế bào Gắn lên màng nhú, phân tử Glycoprotein có trọng lượng phân tử 160 kilodalton (gp160) Nó gồm có phần: + Glycoprotein màng ngồi :có trọng lượng phân tử 120 kilodalton (gp120) GP120 kháng nguyên biến đổi nhất, gây khó khăn cho phản ứng bảo vệ thể chế vaccin phịng bệnh +Glycoprotein xun màng: có trọng lượng phân tử 41 kilodalton - Vỏ (vỏ capsid): vỏ gồm lớp protein: + Lớp ngồi hình cầu, cấu tạo protein có trọng lượng phân tử 18 kilodalton (p18) + Lớp hình trụ, cấu tạo phân tử có trọng lượng phân tử 24 kilodalton (p24) Đây kháng nguyên quang trọng để chẩn đoán nhiễm HIV/AIDS - Lõi: Là thành phần bên vỏ capsid, bao gồm: + Hai phân tử ARN đơn, gen di truyền HIV(genom).Genom HIV chứa gen cấu trúc: Gag (group specific antigen) gen mã hoá cho kháng nguyên đặc hiệu capsid cuả virus; Pol (polymerase) mã hoá cho Enzym: reverve transcriptase (RT:Enzym mã ngược), protease endonuclease (còn gọi kháng nguyên integrase); EnV (envelop) mã hoá cho glycoprotein lớp vỏ peplon HIV Nguyên lý phương pháp ELISA phát kháng thể kháng HIV 11 Elisa gián tiếp Kháng thể kháng HIV có máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên virút HIV cố định sẵn giá đỡ (các giếng phản ứng phiến nhựa) Phức hợp kháng nguyên -kháng thể nhận biết đặc hiệu cộng hợp kháng thể kháng immunoglobuline người (Ig) có gắn enzyme cho phản ứng màu với chất thích hợp Giá trị mật độ quang phản ứng màu (OD: optical density) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV diện mẫu thử Elisa cạnh tranh Nguyên tắc kỹ thuật dựa cạnh tranh kháng thể kháng HIV có mẫu thử với cộng hợp kháng thể kháng HIV gắn với enzyme để gắn lên kháng nguyên cố định giếng Giá trị mật độ quang (OD) tỷ lệ nghịch với lượng kháng thể mẫu thử Sanwich elisa Kháng thể kháng HIV mẫu thử kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên cố định giếng phát cộng hợp kháng nguyên virút gắn enzyme Giá trị mật độ quang phản ứng màu (OD) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV diện mẫu thử Các hệ sinh phẩm Sinh phẩm hệ thứ sử dụng kháng nguyên vi rút toàn phần ly giải tinh chế từ tế bào gây nhiễm với HIV Các sinh phẩm có độ nhạy độ đặc hiệu hạn chế Sinh phẩm hệ thứ hai dùng kháng nguyên protein tái tổ hợp protein tổng hợp Sinh phẩm có độ nhạy độ đặc hiệu cao Sinh phẩm hệ ba xử dụng kháng nguyên tái tổ hợp proteine tổng hợp kháng thể phát theo nguyên tắc ELISA sandwich Độ nhạy độ đặc hiệu cải thiện rõ rệt Sinh phẩm hệ thứ tư phát đồng thời kháng nguyên kháng thể có mẫu thử Sinh phẩm cho phép phát nhiễm HIV trước có chuyển đổi huyết sinh phẩm khuyến cáo nên lựa chọn cho kiểm tra an toàn truyền máu Các sinh phẩm ELISA ngày hồn thiện để phát sớm xác 12 kháng thể kháng HIV, rút ngắn thời gian cửa sổ huyết Các sinh phẩm dùng kháng nguyên có epitop tạo kháng thể sớm có loại kháng nguyên cho phép phát kháng thể kháng virút HIV & 2, thứ type virút virút HIV nhóm O Chế phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát nhiễm HIV 3.1 Nguyên tắc Là phản ứng ELISA “Sandwich “ bước - Kháng nguyên gắn giếng protein vỏ gp160 HIV-1 ANT70 (nhóm O); gp36 HIV2 - Nếu mẫu thử có kháng thể kháng HIV, kháng thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên cố định giếng Đồng thời khối cầu cộng hợp kháng nguyên HIV gắn men có sẵn giếng tạo phức hợp kẹp chả: Kháng nguyên - Kháng thể - Cộng hợp - Phức hợp Kháng nguyên - Kháng thể - Cộng hợp phát phản ứng màu với chất 3.2 13 Quy trình thực Ưu điểm hạn chế  14 Ưu điểm: + Cho phép thực đồng thời nhiều mẫu Có thể dùng máy tự động giảm bớt thao tác cho người làm xét nghiệm, tránh sai sót lây nhiễm + Đọc kết máy không phụ thuộc vào chủ quan người làm xét nghiệm + Có thể lưu bảng kết thông số kỹ thuật thuận lợi cho việc kiểm tra đánh giá chất lượng xét nghiệm + Giá thành xét nghiệm tương đối rẻ  Hạn chế: + Cần có đầu tư cho trang thiết bị ban đầu bảo dưỡng máy móc + Các sinh phẩm phải bảo quản nhiệt độ lạnh (4-80C) + Thời gian thực xét nghiệm 2-3 + Khơng thích hợp cho nơi số lượng mẫu phải làm nhiều chứng Các kết bất thường Một kết dương tính khơng thiết nghĩa người bị nhiễm HIV có số bệnh lý gây dương tính giả(như bệnh lý hạch lymphơ, giang mai, lupus) Khi kết ELISA dương tính, thử nghiệm xác định Western blot ln ln phải thực sau Western blot dương tính nhìn chung cho chắn có nhiễm HIV Kết âm tính khơng thể loại trừ nhiễm HIV, cần khoảng thời gian cho từ lúc nhiễm HIV đến xuất đủ nồng độ kháng thể kháng HIV để đo được(do gọi giai đoạn cửa sổ) Vì vậy, người bị ngi ngờ nhiễm HIV cấp hay ngun phát nghĩa có giai đoạn cửa sổ, kết ELISA Western blot âm tính khơng thể loại trừ chẩn đoán Nên cần thực thêm xét nghiệm bổ sung xét nghiệm tìm kháng nguyên p24 hay độ dung nạp virus HIV Hoặc phải xét nghiệm lại sau – tháng 15 Kết luận ELISA phương pháp có nhiều ưu điểm trội so với phương pháp khác, cho phép thực đồng thời nhiều mẫu, dùng máy tự động giảm bớt thao tác cho người làm xét nghiệm, tránh sai sót lây nhiễm, kết đọc máy khơng phụ thuộc vào chủ quan người làm xét nghiệm nên kết đo có độ xác cao Hơn giá thành xét nghiệm rẻ, thời gian thu kết không lâu Vậy nên phương pháp nên sử dụng phổ biến rộng rãi để nâng cao kết điều trị bệnh, suất trồng chất lượng thực phẩm xã hội Đặc biệt, ELISA giúp xét nghiệm HIV/AIDS – bệnh kỉ người Trong trình làm tiểu luận này, hẳn cịn nhiều thiếu sót hạn chế kiến thức thời gian, vậy, mong cô giáo bạn giúp đỡ để tiểu luận hoàn thiện Xin chân thành cảm ơn! 16 Tài liệu tham khảo Vi sinh vật học, Nguyễn Lân Dũng, NXB Giáo dục, 1997 Molecular Biotechnology, Glick BR and Jackj P, 1994 Genetic Engineering and Biotechnology, Chopra BL and Anwan N, 1990 Hướng dẫn quốc gia xét nghiệm HIV, Bộ Y Tế, 2009 www.sinhhocvietnam.com www.genprice.com 17 Mục Lục Giới thiệu phương pháp ELISA I Lịch sử phát triển Khái niệm ELISA Ưu điểm hạn chế Phân loại II Direct ELISA (ELISA trực tiếp) Indirect ELISA (ELISA gián tiếp) Sandwich ELISA 3.1 Sandwich ELISA trực tiếp 3.2 Sandwich ELISA gián tiếp ELISA cạnh tranh Các yếu tố ảnh hưởng đến phương pháp III Ảnh hưởng đến độ nhạy Ảnh hưởng đến kết Một số thiết bị sử dụng phương pháp ELISA IV Ứng dụng 10 V Trong thực phẩm 10 Trong nông nghiệp 10 Trong y học 10 Ứng dụng ELISA xét nghiệm HIV 10 VI Về HIV/AIDS 10 Nguyên lý phương pháp ELISA phát kháng thể kháng HIV 11 Chế phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát nhiễm HIV 13 3.1 Nguyên tắc 13 3.2 Quy trình thực 13 Ưu điểm hạn chế 14 Các kết bất thường 15 Kết luận 16 Tài liệu tham khảo 17 18 ... dụng phương pháp ELISA IV - Khay nhựa có giếng - Máy quang phổ với bước sóng khác - Micropipette - Máy rửa khay nhựa Ứng dụng V Trong thực phẩm -Phương pháp Elisa phát định lượng vi sinh thực. ..Weemen (Hà Lan) công bố phương pháp đặt tên ELISA (EIA) dựa tất bước phát triển nói Phương pháp thức đời vào năm 1971 Khái niệm ELISA Định nghĩa: ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent... Giới thiệu phương pháp ELISA I Lịch sử phát triển Khái niệm ELISA Ưu điểm hạn chế Phân loại II Direct ELISA (ELISA