Luận văn các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào

LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. TS. Nguyễn Hoàng Lộc và PGS. TS. Cao Đăng Nguyên đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn tận tình. Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, giảng viên của Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế; Bộ môn Sinh lý-Sinh hóa, Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian th ực hiện đề tài. Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban Đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và Hợp tác Quốc tế, Phòng Đào tạo Sau đại học Trường đại học Khoa học; Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Khoa Sinh-Môi trường, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng đ ã có nhiều giúp đỡ quí báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi hoàn thành luận án. Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình đã đóng góp một phần không nhỏ trong việc hoàn thành luận án này. Huế, ngày 15 tháng 02 năm 2014 Tác giả Võ Châu Tuấn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Nếu có gì sai sót, tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả Võ Châu Tuấn MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU 1 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 3 4. ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 4 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT 5 1.1.1. Sơ lược lịch sử nuôi cấy tế bào thực vật 5 1.1.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật 6 1.1.2.1. Nuôi cấy callus 6 1.1.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 7 1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào 10 1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào 12 1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn 16 1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG TẾ BÀO THỰC VẬT NUÔI CẤY IN VITRO 19 1.2.1. Vai trò của các hợp chất thứ cấp ở thực vật 19 1.2.2. Các nhóm hợp chất thứ cấp chủ yếu ở thực vật 19 1.2.2.1. Nhóm terpene 20 1.2.2.2. Nhóm phenol 20 1.2.2.3. Các hợp chất chứa nitrogen 20 1.2.3. Những nghiên cứu sản xuất các hợp thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật 21 1.2.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước 21 1.2.3.2. Những nghiên cứu trong nước 25 1.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY NGHỆ ĐEN 28 1.3.2. Thành phần hóa học 28 1.3.3. Công dụng 30 1.3.3.1. Công dụng cổ truyền 30 1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học 30 1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệ đen 35 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.37 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 37 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 37 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.3.1. Nuôi cấy callus 39 2.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào 39 2.3.2.1. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác 39 2.3.2.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào trong hệ lên men 40 2.3.3. Xác định khả năng sinh trưởng của tế bào 40 2.3.4. Định lượng tinh dầu 41 2.3.5. Định lượng curcumin 41 2.3.6. Định lượng polysaccharide hòa tan trong nước 42 2.3.7. Xác định sesquiterpene 42 2.3.8. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu 43 2.3.9. Xử lý thống kê 43 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. NUÔI CẤY CALLUS NGHỆ ĐEN 44 3.2. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO TRONG BÌNH TAM GIÁC 47 3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy 47 3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc 49 3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST 51 3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA 51 3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D 52 3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA 52 3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon 54 3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose 54 3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose 56 3.3. NUÔI CẤY TẾ BÀO HUYỀN PHÙ TRONG HỆ LÊN MEN 59 3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào 59 3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 61 3.3.2.1. Cỡ mẫu 61 3.3.2.2. Tốc độ khuấy 62 3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí 63 3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆ ĐEN 65 3.4.1. Hàm lượng tinh dầu 65 3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số 67 3.4.3. Hàm lượng curcumin 68 3.4.4. Xác định sesquiterpene 73 3.5. HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU TẾ BÀO NGHỆ ĐEN 77 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 80 NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT BAP : 6-benzylaminopurine BA : 6-benzyladenine CIB : centrifugal impeller bioreator cs : cộng sự DMSO : dimethyl sulfoxide ĐC : đối chứng ĐHST : điều hòa sinh trưởng HPLC : high performance liquid chromatography (sắc ký hiệu năng cao áp) IAA : indoleacetic acid IBA : indolebutyric acid Kin : kinetin L : lít L-DOPA : L-3,4 -dihydrooxyphenylamine LPS : lipopolysaccharide MS : Murashige và Skoog (1962) NAA : naphthaleneacetic acid Nxb : nhà xuất bản TNF-α : tumor necrosis factor-alpha 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxyacetic acid DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 1 Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro 44 2 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của callus 46 3 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 48 4 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 50 5 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 51 6 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 52 7 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 53 8 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 54 9 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong bình tam giác 56 10 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào nuôi c ấy huyền phù trong bình tam giác 57 11 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 62 12 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 63 13 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L 64 14 Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 66 15 Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 67 16 Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 69 17 Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene trong tế bào nuôi cấy ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự nhiên 74 18 Bảng 3.18. Khả n ăng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệ đen 78 DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 1 Hình 2.1. Cây nghệ đen nuôi cấy in vitro 37 2 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm 38 3 Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro (A) callus trắng và xốp, (B) callus trắng và mọng nước 45 4 Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn, rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy 47 5 Hình 3.3. Dịch huyền phù tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong bình tam giác trên môi trường có 3% sucrose 55 6 Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA và 1,5 mg/L 2,4-D, lắc 120 vòng/phút 58 7 Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml đặ t trên máy lắc 59 8 Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L 60 9 Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút; sục khí 2,0 L/phút, cỡ mẫu 100 g 60 10 Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 L 61 11 Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men nuôi cấy trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 mg/L 2,4-D ; khuấy 150 vòng/phút; sục khí 2,5 L/phút, cỡ mẫu 200 g 65 12 Hình 3.10. Phổ HPLC của curcumin chuẩ n (0,5 mg/ml) 71 13 Hình 3.11. Phổ HPLC curcumin của củ nghệ đen 01 năm tuổi ngoài tự nhiên 72 14 Hình 3.12. Phổ HPLC curcumin của tế bào nghệ đen sau 2 đến 18 ngày nuôi cấy trong hệ lên men 10 lít 73 15 Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự nhiên; B: tế bào nghệ đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2 đến 18 ngày 76 16 Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệ đen 77 [...]... sinh trưởng và tổng hợp các chất trao đổi thứ cấp và (2) khả năng các sản phẩm thứ cấp tiết ra hoặc không tiết ra môi trường [23] 1.1.2.3 Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật, cần phải theo dõi chặt chẽ sự sinh trưởng và sức sống của tế bào để tăng hiệu suất nuôi cấy tế bào cũng như cải thiện điều kiện nuôi cấy [12] Một số chỉ tiêu dùng để đánh. .. tích chung của dịch huyền phù, bao gồm cả sinh khối tế bào Thể tích đóng gói của tế bào được xác định bằng cách tương tự sau khi tế bào được nén chặt bởi quay ly tâm Hai thông số này cho phép đánh giá nhanh sinh trưởng của tế bào trong khi vẫn duy trì được điều kiện vô trùng mẫu Các phương pháp này thuận lợi để giám sát sự sinh trưởng của tế bào suốt một chu kỳ nuôi cấy trong các bình tam giác với điều... cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi callus do những chuyển động xoáy của môi trường Sau một thời gian ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các khối tế bào với kích thước khác nhau và các tế bào chết Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù tốt, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào Khả năng tách rời của các tế bào trong môi trường có thể cải thiện bằng cách... thể đưa trở lại các điều kiện nuôi cấy trước đó Tuy nhiên, dựa vào thể tích tế bào có lẽ không phải là cách chính xác để kiểm tra sinh trưởng vì nó phụ thuộc vào hình thái tế bào [93] - Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào Khối lượng tươi và khối lượng khô của tế bào cho phép đánh giá sinh 11 trưởng của tế bào chính xác hơn các chỉ tiêu về thể tích tế bào Tuy nhiên, yêu cầu của các thao tác mẫu... cho sinh trưởng và tích lũy berberine của tế bào là 8 g/L, đạt 55 g/L sinh khối và 3,5 g/L berberine sau nuôi cấy [97] Lượng mẫu nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng tế bào được tìm thấy trong nuôi cấy tế bào cây Gymnema sylvestre Với lượng mẫu tế bào đưa vào nuôi cấy là 60 g/L thì khả năng sinh trưởng của tế bào là cao nhất, nếu lượng mẫu đưa vào nuôi cấy là 80 hoặc 100 g/L thì sinh trưởng tế bào. .. với các enzyme thủy phân như cellulase và pectinase Phương pháp sử dụng chromium trioxide thì nhanh hơn và ít phức tạp hơn dùng các enzyme thuỷ phân, tuy nhiên nó gây trở ngại trong ước tính các tế bào sống của cùng một mẫu Phương pháp dùng enzyme duy trì được các tế bào sống và đánh giá về số lượng các tế bào sống trong cùng một mẫu bởi nhuộm màu tế bào có thể thực hiện được [122] - Chỉ số sinh trưởng. .. nay, hầu hết các dịch huyền phù tế bào đã được nuôi cấy có sự hiện diện của cả những tế bào đơn và các khối tế bào Nhìn chung, môi trường thích hợp cho nuôi cấy callus thì cũng thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nồng độ của các auxin và cytokinin đòi hỏi cao hơn Thông thường, động học sinh trưởng của các tế bào nuôi cấy huyền phù là đường hàm mũ; các hợp chất... [12] Một số chỉ tiêu dùng để đánh giá động học sinh trưởng tế bào thực vật trong nuôi cấy, bao gồm thể tích lắng, thể tích đóng gói, khối lượng tươi và khối lượng khô, mật độ, chỉ số sinh trưởng, thời gian nhân đôi và một số chỉ tiêu khác của tế bào [135] - Thể tích lắng và thể tích đóng gói của tế bào Thể tích lắng của tế bào được xác định bằng cách cho các huyền phù tế bào trầm tích trong một cái ống... lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất (số lượng tế bào tăng theo hàm mũ); Pha ổn định: ở pha này, khả năng phân bào giảm mạnh, số lượng và khối lượng tế bào ổn định Pha suy vong: sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao, giảm xuống và dần đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyển [12] - Nuôi cấy mẻ có bổ sung chất dinh dưỡng Đây là một hình thức khác của phương thức nuôi cấy mẻ Sau khi tế bào. .. (2001) đã nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D và NAA phối hợp với BAP ở các nồng độ khác nhau lên sinh trưởng và tích lũy jaceosidin của tế bào cây hoa sen tuyết (Saussurea medusa) Kết quả cho thấy, các môi trường có sự phối hợp giữa BAP với 2,4-D thì không thích hợp cho sinh trưởng của tế bào; khi nồng độ 2,4-D gia tăng lên, khả năng sinh trưởng của tế bào giảm đi rõ rệt Sử dụng các môi trường bổ sung phối . Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào 10 1.1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào 12 1.1.2.5. Nuôi cấy tế bào thực vật ở qui mô lớn 16 1.2. SỰ TÍCH LŨY CÁC. cấp và (2) khả năng các s ản phẩm thứ cấp tiết ra hoặc không tiết ra môi trường [23]. 1.1.2.3. Các thông số đánh giá khả năng sinh trưởng của tế bào Trong nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật,. thước khác nhau và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù tốt, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Khả năng tách rời của các tế bào trong môi trường