1.3.2. Thành phần hóa học
Nghệ đen là loài cây thảo dược không độc, chứa nhiều các hợp chất hóa học có giá trị dược liệu cao. Nhiều nghiên cứu đã công bố về thành phần hóa học của cây nghệđen. Từ năm 1928, Rao và cs đã khảo sát sơ bộ thành phần hóa học tinh dầu từ thân rễ của nghệđen và tìm thấy các hợp chất như -pinen, camphen, cineol, camphor và borneol bên cạnh các sesquiterpene, tuy nhiên không phân lập và xác định được một sesquiterpene nào [131]. Shiobara và cs (1985) đã tách chiết từ củ nghệ đen được 3 loại sesquiterpenoid đó là curcumeone, curcumanolide-A, curcumanolide-B [143]. Xingyi (1999) đã nghiên cứu cho thấy, tinh dầu nghệđen có chứa 37 thành phần khác nhau, trong đó chủ yếu là curzerenone, curcumenol, b-elemene, isocurcumenol [179]. Singh và cs (2002) đã khảo sát thành phần tinh dầu của một số loài nghệ của Ấn Độ cho thấy, nó có chứa các thành phần chính như: 1,8 cineol, cymene, α-phellandrene (14,9%) [145]. Mau và cs (2003) đã xác định được 36 hợp chất từ nghệ đen gồm 17 terpenes, 13 alcohol, và 6 ketones [100]. Garg và cs (2005) đã nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu từ lá cây nghệ đen Ấn Độ. Kết quả cho thấy, tinh dầu có chứa 23 hợp chất khác nhau [46]. Makabe và cs (2006) đã xác định được hơn 10 loại sesquiterpene từ củ nghệ đen [94]. Champakaew và cs (2007) phân tích tinh dầu bay hơi của củ nghệ đen nhận thấy, thành phần chính của tinh dầu bao gồm β-tumerone, 1,8-cineole và 7- zingiberene [28].
29
Bên cạnh các nghiên cứu về thành phần hóa học của tinh dầu nghệ đen, các nghiên cứu về thành phần hợp chất màu vàng có trong nghệ đen cũng đã được tiến hành. Syu và cs (1998) đã nghiên cứu nhận thấy dịch chiết ethanol của củ nghệ đen có chứa curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin [152]. Paramapojn và Gritsanapan (2007) đã nghiên cứu về thành phần curcuminoid trong củ nghệ đen ở các vùng sinh thái khác nhau của Thái Lan. Kết quả cho thấy, hàm lượng curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin lần luợt từ 1,46% đến 5,73% w/w (trung bình 2,73% w/w); từ 3,15% đến 10,98% w/w (trung bình 7,37%) và từ 0,49% đến 2,99% w/w (trung bình 1,40% w/w) [119].
Ở nước ta, khảo sát thành phần hóa học của nghệ đen cũng đang rất được quan tâm. Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đánh giá thành phần hóa học của tinh dầu nghệ đen trồng ở các vùng khác nhau. Phan Minh Giang và cs (1997) đã công bố thành phần chính trong tinh dầu thân rễ nghệ đen ở Sóc Sơn (Hà Nội) là zurumbon (chiếm 79,08%) [2]. Lê Quý Bảo và cs (2004) đã công bố thành phần tinh dầu trong thân rễ nghệ đen ở Đô Lương (Nghệ An) và Hương Sơn (Hà Tĩnh) [1]. Trần Thị Việt Hoa và cs (2007) đã nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu củ nghệ đen trồng ở Đà Lạt được trích ly theo phương pháp gia nhiệt thông thường và phương pháp gia nhiệt bằng lò vi sóng. Kết quả nghiên cứu cũng đã chỉ ra sự khác biệt lớn về thành phần sesquiterpene của nghệ đen ở Việt Nam và các nước khác [3].
Tóm lại, nghệ đen là cây thảo dược có chứa các nhóm chất như tinh dầu bao gồm các chất thuộc sesquiterpene và monosesquiterpene; curcuminoid bao gồm: curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin. Ngoài ra, nghệ đen còn chứa các chất như tinh bột, chất dẻo và một số chất có vịđắng khác như tannin và flavonoiod [82].
30
1.3.3. Công dụng
Ngoài nghệ vàng, loài cây được nghiên cứu liên tục và được xem là loại thảo dược tiềm năng có nhiều hoạt chất sinh học, nghệđen cũng đang được quan tâm ngày càng nhiều nhờ các hoạt chất mới được xác định từ nó [32].
1.3.3.1. Công dụng cổ truyền
Cây nghệđen được trồng rộng rãi dùng làm rau hoặc đồ gia vịở các quốc gia Đông, Nam và Đông Nam Á bao gồm Trung Quốc, Việt Nam, Ấn Độ, Nhật Bản và Thái Lan [137], [58]. Từ lâu, nghệđen đã được con người dùng trong bài thuốc Đông y cổ truyền để chữa bệnh. Nghệ đen có trong Dược điển XIII của người Nhật Bản và sử dụng trong thuốc cổ truyền của người Trung Quốc. Nghệ đen đã từng được kê trong các đơn thuốc dùng để chữa bệnh dạ dày, điều kinh, điều trị hội chứng “Oketsu” gây ra do tắt ngẽn mạch máu và cải thiện kinh nguyệt trong nhiều dạng thuốc pha chế khác nhau [98], [99], [182]. Từ lâu ở Thái Lan, nghệ đen đã được dùng để làm dịu cơn đau dạ dày, chống tiêu chảy, chống nôn mửa và sốt. Nó cũng được dùng ngoài da như chất làm se các vết thương [137]. Người Ấn Độ đã dùng củ nghệ đen để trị chứng viêm da, bong gân, ung nhọt và vết thương. Củ nghệđen giàu tinh bột, được dùng như là nguồn thay thế cho tinh bột của cây hoàng tinh, lúa mạch và được chú ý dùng làm thực phẩm cho trẻ sơ sinh, người đang dưỡng bệnh. Bột màu đỏ gọi là “Abir” làm từ củ nghệđen khô xử lý với nước sắc cây tô mộc được dùng trong nghi lễ tôn giáo Hindu. Nó cũng được dùng để sản xuất rượi, nhiều loại nước hoa, mỹ phẩm và các loại hương liệu khác [36]. Ngoài ra, củ nghệ đen còn được dùng để chữa giun sán ở trẻ em; bột nghệ dùng để chống dị ứng; lá nghệ có tác dụng chữa bệnh phù [108], phong hủi [68].
1.3.3.2. Các hoạt tính sinh học
- Hoạt tính giảm đau
31
cuzerenone (I) và curcumenol (II) từ củ nghệ đen. Kết quả cho thấy, cả hai chất này đều thể hiện hoạt tính giảm đau tương đối. Nghiên cứu khác cũng cho thấy, hợp chất curcumenol có tác dụng giảm đau cao gấp mấy lần so với các loại thuốc giảm đau thông thường. Dịch chiết dichloromethane từ củ nghệ đen thu được trong mùa thu và mùa đông đều có tác dụng ức chế sự co thắt ở bụng [142].
- Hoạt tính kháng ung thư
Nghiên cứu của Hong và cs (2002) cho thấy, dịch chiết nghệ đen có hoạt tính chống ung thư và kháng viêm [58]. Dịch chiết bằng nước của củ nghệ có hoạt tính chống lại di căn phổi của các tế bào khối u ác tính B16 [139]. Priosoeryanto và cs (2001) nghiên cứu khả năng ức chế sinh trưởng các dòng tế bào ung thư của dịch chiết ethanol và chloroform củ nghệ đen nhận thấy, dịch chiết chloroform đã ức chế sinh trưởng tế bào myeloma và tế bào carcinoma; dịch chiết ethanol ức chế sinh trưởng tế bào myeloma và tế bào carcinoma [126]. Syu và cs (1998) nghiên cứu nhận thấy các curcuminoid có hoạt tính chống các tế bào ung thư buồng trứng OVCAR-3 ở người [152]. Jang và cs (1997); Hanif và cs (1997) cũng đã nhận thấy, các curcuminoid phân lập từ nghệ đen có khả năng ức chế sinh trưởng khối u và gây độc cho các dòng tế bào ung thư ruột kết và ung thư biểu mô gan ở người.
Moon và cs (1985) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khối u của polysaccharide nghệ đen. Kết quả cho thấy, polysaccharide ức chế dòng tế bào ung thư sarcoma 180 với tỷ lệ là 61,1% [105]. Theo Kim và Kim (2000), polysaccharide nghệ đen làm giảm kích thước khối u trên chuột đã được cấy tế bào sacrom 180 với tỷ lệ 52% và ngăn chặn đột biến nhiễm sắc thể [75]. Wang và cs (2004) đã thử hoạt tính kích thích miễn dịch, chống oxy hóa và ung thư trên chuột của polysaccharide nghệđen. Kết quả nghiên cứu cho thấy, polysaccharide có hoạt tính kháng ung thư, oxy hóa và tăng cường miễn dịch [170].
Lee và cs (2002) nghiên cứu ảnh hưởng của một số sesquitertene phân lập từ các cây họ Gừng lên hoạt tính của các enzyme: cyclooxygenase (COX-2) và
32
nitric oxide synthase (iNOS) trong nuôi cấy đại thực bào chuột được kích hoạt bởi lipopolysaccharide. Các sesquiterpenoid của nghệ đen có khả năng ức chế mạnh hoạt tính các enzyme: cyclooxygenase và nitric oxide synthase. Các tác giả này cũng cho rằng, các sesquiterpene phân lập từ nghệ đen có thể phát triển thành các chất ức chế COX-2 và iNOS, sản xuất các tác nhân phòng ngừa ung thư và kháng viêm [80]. Carvalho và cs (2010) nghiên cứu nhận thấy có sự tăng đáng kể lượng tế bào hồng cầu và bạch cầu tổng số; giảm số tế bào màng bụng và kích thước khối u trên chuột được tiêm dịch chiết của nghệ đen so với đối chứng [27].
- Hoạt tính bảo vệ gan
Matsuda và cs (1998) đã nhận thấy dịch chiết acetone-nước của củ nghệ đen có hoạt tính bảo vệ gan. Các sesquiterpene và curcumin bảo vệ chống lại sự hình thành D-galactosamine/lipopolysaccharide, giảm tổn thương gan ở chuột [99]. Kết quả nghiên cứu của Kim và cs (2005) cho thấy, nghệ đen thể sử dụng như thuốc tiềm năng cho điều trị chứng xơ gan mãn tính [73].
- Hoạt tính kháng loét
Nghệ đen được sử dụng như là phương thuốc chủ yếu trong việc điều trị các chỗ loét trong hệ tiêu hóa. Tác động của bột rễ nghệđen lên dịch dạ dày, pH dạ dày, acid tự do và acid tổng số trong hệ thống tiêu hóa của chuột đã được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu của
Raghuveer và cs (2003) cho thấy, dịch chiết nghệ đen có khả năng chống lại tình trạng tiết nhiều acid và viêm loét trong dạ dày [127]. Watanabe và cs (1986) đã nghiên cứu hoạt tính kháng loét của 8 dịch chiết từ nghệ đen trên chuột gây viêm loét dạ dày cấp tính. Các hợp chất furanogermenone và (4S, 5S)- (+) germencrone 4,5-epoxide của tinh dầu nghệ có hoạt tính ức chế sự hình thành vết loét trên chuột thực nghiệm [175].
- Hoạt tính kháng viêm
33
heptatrien-3-one, procurcumenol và epiprocurcumenol từ dịch chiết củ nghệđen có hoạt tính kháng viêm bởi khả năng ức chế sự giải phóng yếu tố TNF-αở đại thực bào chuột [63]. Makabe và cs (2006) nghiên cứu khả năng kháng viêm của các sesquiterpene phân lập từ dịch chiết ethanol của củ nghệ đen cho thấy, hai hợp chất curzenone và dehydrocurdione có tác dụng ức chế sự hình thành chất 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (chất tạo thành khi chuột bị viêm tai) với hiệu quả ức chế tương ứng là 75% và 53% [94]. Yoshioka và cs (1998) đã dùng chất dehydrocurdione, một sesquiterpene chiết tách từ cây nghệ đen để khảo sát hoạt tính kháng viêm in vivo và in vitro ở chuột. Kết quả cho thấy, dehydrocurdione, thành phần chính của nghệ đen có tiềm năng kháng viêm đi cùng với tác dụng chống oxy hóa [182].
- Hoạt tính chống oxy hóa
Mau và cs (2003) nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu nghệ đen. Ở nồng độ 20 mg/ml, tinh dầu nghệ đen có hoạt tính tốt trong việc quét gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl [100]. Các hợp chất curcuminoid phân lập từ nghệ đen được công bố có hoạt tính chống oxy hóa và kháng viêm tương đương với các chất này tách từ cây nghệ vàng [96]. Kết quả nghiên cứu của Paramapojn và cs (2009) đã chứng minh rằng, dịch chiết ethanol củ nghệ đen có hoạt tính quét gốc tự do. Khả năng quét gốc tự do của các curcuminoid nghệ đen cao nhất là curcumin rồi đến demethoxycurcumin và thấp nhất là bisdemethoxycurcumin [120].
Ở nước ta, Trần Thị Việt Hoa và cs (2007) cũng đã khảo sát hoạt tính chống oxy hóa và nhận thấy tinh dầu nghệ đen trồng ở Đà Lạt ở nồng độ 20 mg/ml có khả năng chống oxy hóa tương đối cao từ 74,8-77,8%. Cao ether dầu hỏa của củ nghệđen có khả năng chống oxy hóa cao nhất từ 61,4-84,5%, với nồng độ từ 5-20 mg/ml [3].
- Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm
34
của nghệ đen đã được nhiều nghiên cứu đề cập. Wilson (2005) đã khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của dịch chiết từ củ nghệ đen trên 6 loài vi khuẩn và 2 loài nấm. Kết quả cho thấy, các loại dịch chiết của củ nghệ đen đều có khả năng ức chế sinh trưởng của các loài vi khuẩn và nấm kiểm định (trừ Staphylococcus aureus) [176]. Nghiên cứu của Ficker và cs (2003) về khả năng kháng nấm gây bệnh ở người của các loại dịch chiết từ 11 loài cây họ Gừng cho thấy, dịch chiết từ củ nghệ đen có khả năng chống lại các loại nấm gây bệnh ở người, gồm những loài nấm chống chịu với các chất diệt nấm phổ biến như amphotericin B và ketoconazole [43]. Joshi và cs (1989) nghiên cứu nhận thấy, tinh dầu của nghệ đen chứa methyl-p-methoxy-cinnamate là thành phần kháng các nấm gây bệnh ở người [67]. Philip và cs (2009) nghiên cứu khả năng kháng khuẩn 32 loại dịch chiết từ 8 loài dược liệu trong các bài thuốc cổ truyền ở Malaysia trên các loài vi khuẩn nhận thấy dịch chiết của củ nghệ đen ức chế sinh trưởng của các loài vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa,
S. aureus, Bacillus. subtilis và không ức chế sinh trưởng của vi khuẩn E. coli
[124]. Dịch chiết nghệ đen Thái Lan có hoạt tính kháng 3 chủng vi khuẩn E. coli, 2 chủng vi khuẩn Salmonella typhimurium, B. cereus, Listeria monocytogenes, S. aureus, 1 chủng vi khuẩn B. subtilis, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica, và 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas
sp. [155]. Hiệu quả kháng khuẩn của dịch chiết nghệ đen tương đương với các sản phẩm kháng khuẩn thương mại và sự phối hợp dịch chiết nghệ đen với các sản phẩm kháng khuẩn đã cải thiện hiệu quả của các sản phẩm này [25]. Singh và cs (2002) đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu bay hơi của củ cây nghệ đen nhận thấy, tinh dầu ức chế hoàn toàn khả năng sinh trưởng của các sợi nấm Colletotrichum falcatum [145]. Srvidya và cs (2009) nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết củ nghệ đen. Kết quả cho thấy, dịch chiết hydro ethanolic của nghệ đen có khả năng kháng B. cereus và ức chế tương đối với K. pneumonia và C. albicans [149].
35
1.3.4. Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro của cây nghệđen
Mello và cs (2001b) đã thành công trong tái sinh chồi từ callus nghệ đen trên môi trường lỏng có bổ sung 13,4 mM NAA và 2,2 mM BAP sau 70 ngày nuôi cấy [102]. Miachir và cs (2004) đã nghiên cứu nhân giống in vitro
cây nghệ đen ở từ chồi của thân củ [103]. Bharalee và cs (2005) cũng đã nghiên cứu nhân giống bằng chồi củ của cây nghệ đen, các cây tạo rễ in vitro
có thể đưa ra trồng ngoài đất [21]. Loc và cs (2005) đã thành công trong nhân giống in vitro cây nghệ đen và có hơn 95% cây in vitro hình thành rễ sinh trưởng tốt trong chậu [90]. Anisuzzaman và cs (2008) đã nghiên cứu tạo củ in vitro cây nghệ đen ở Bangladesh. Chồi in vitro khoảng 10-12 tuần tuổi được nuôi cấy trên môi trường MS với nồng độ khác nhau của BA, NAA và các nguồn carbon khác nhau. Củ hình thành tốt nhất trên môi trường có 4,0 mg/L BA và 6% sucrose sau 7-9 tuần nuôi cấy [18]. Stanly và cs (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro cây nghệ đen ở Malaysia thông qua nhân nhanh chồi in vitro trên môi trường rắn; nuôi cấy lắc trong bình tam giác và nuôi cấy ngập chìm tạm thời [150].
Ngoài các nghiên cứu nhân giống in vitro, nghiên cứu nuôi cấy callus và huyền phù tế bào cây nghệ đen cũng đã được công bố. Mello và cs (2001a, b) đã tạo callus từ đoạn rễ của cây nghệ đen in vitro trên môi trường MS có 3% sucrose, 13,4 μM NAA và 2,2 μM BAP trong điều kiện tối [101], [102]. Theo Miachir và cs (2004), callus không hình thành từ mô lá và rễ của cây nghệ đen in vitro trên môi trường có 2,4-D. Callus hình thành tốt nhất từđoạn rễ trên môi trường MS bổ sung 1 mg/L NAA và nuôi cấy trong tối [103 ]. Mello và cs (2001a) đã nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ đen. Kết quả cho thấy, với 0,5 g tế bào trong bình tam giác 125 ml chứa 10 ml môi trường MS có 3% sucrose, 13,4 μM NAA và 2,2 μM BAP, tốc độ lắc 60 vòng/phút đã thu được khoảng 6 g sinh khối tươi của tế bào sau 35 ngày nuôi cấy. Kết quả cũng cho thấy, sucrose là nguồn carbon thích hợp cho sinh
36
trưởng của tế bào nghệ đen, các nguồn carbon khác như galactose glycerol và sorbitol không có vai trò đáng kể trong kích thích sinh trưởng của tế bào [101]. Miachir và cs (2004) cũng đã thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệ trong bình tam giác 250 ml trên máy lắc. Nuôi cấy 1 g tế bào trong 75 ml môi trường MS có bổ sung 1 mg/L NAA đã thu được sinh khối tế bào cao nhất là 8 g sau hơn 20 ngày nuôi cấy ở tốc độ lắc 100 vòng/phút [103].
37
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu là cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc chi nghệ (Curcuma), họ Gừng (Zingiberaceae), bộ Gừng (Zingiberales).
Nguyên liệu nghiên cứu là các tế bào callus được tạo ra từ bẹ lá của cây nghệđen in vitro (Hình 2.1) [90].
Hình 2.1. Cây nghệđen nuôi cấy in vitro