Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.9. Kết quả cho thấy, tế bào sinh trưởng tương đối thấp khi được nuôi trong môi trường có glucose 20-30 g/L. Ở nồng độ glucose từ 40-60 g/L, sinh trưởng của tế bào tăng lên và sinh khối đạt cực đại là 7,32 g tươi (0,59 g khô), chỉ số sinh trưởng là 2,44. Glucose ở nồng độ 70 g/L đã ức chế sinh trưởng của tế bào.
Một số kết quả nghiên cứu cho thấy, bên cạnh đường sucrose, glucose cũng là nguồn carbon thích hợp thường được sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào của nhiều loài thực vật (Kato và cs 2007, Sturn và cs 1999, Koch 2004). Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, glucose không phải là nguồn carbon thích hợp cho sinh trưởng của tế bào cây nghệ đen, kết quả này cũng tương tự như nuôi cấy tế bào cây Ficus deltoidea (Ling và cs 2008) [84] và cây Psoralea corylifolia (Shinde và cs 2009).
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù
trong bình tam giác
Glucose (g/L) FW DW GI 20 3,15cd 0,22c 1,05 30 6,05c 0,42bc 2,02 40 7,12a 0,53b 2,37 50 7,20a 0,55b 2,40 60 7,32a 0,59a 2,44 70 6,65b 0,53b 2,22
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
57
3.2.4.3. Ảnh hưởng của fructose
Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào nghệđen được trình bày ở bảng 3.10. Kết quả nghiên cứu cho thấy, fructose có ảnh hưởng đáng kể lên sinh trưởng của tế bào hơn glucose. Khi tăng nồng độ fructose trong môi trường từ 20- 60 g/L, sinh khối tế bào tăng theo và đạt cực đại là 8,40 g tươi (0,62 g khô). Tuy nhiên, khi fructose bổ sung lên đến 70 g/L thì sinh trưởng của tế bào chậm lại và chỉ còn 7,65 g tươi (0,57 g khô).
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của fructose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền
phù trong bình tam giác
Fructose (g/L) FW DW GI 20 6,72b 0,35c 2,24 30 7.34b 0,55b 2,45 40 7,70ab 0,57b 2,57 50 7,72ab 0,59b 2,57 60 8,40a 0,62a 2,80 70 7,65b 0,57b 2,55
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI: chỉ số sinh trưởng
Mặc dù sucrose và glucose được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy tế bào thực vật. Tuy nhiên, mỗi loài lại thích hợp với một nguồn carbon khác nhau cần cho quá trình hình thành các sản phẩm trao đổi chất của chúng [101]. Trong nuôi cấy tế bào thực vật, nhiều loại đường đơn cũng đã được sử dụng như glucose, fructose, sorbitol, galactose... Abdullah và cs (1998) khi nuôi cấy tế bào cây Morinda elliptica đã cho thấy, fructose 5% giúp tăng khả năng sinh trưởng của tế bào. Felker và cs (1989) khi nuôi cấy tế bào cây ngô nhận thấy, fructose được vận chuyển nhanh nhất, tiếp đến là glucose và sau cùng là
58
sucrose. Một số nghiên cứu khác cũng thu được kết quả tương tư, chẳng hạn ở tế bào của các cây Solanum eleagnifolium (Nigra và cs 1990), Ficus deltoide
(Ling và cs 2008) và Tinospora cordifolia [130].
Mặc dù fructose có tác dụng tốt cho sinh trưởng tế bào của nhiều loài thực vật, tuy nhiên nếu sử dụng ở nồng độ cao nó sẽ gây ra ức chế chẳng hạn như trường hợp nuôi cấy tế bào cây thuốc lá và cây Cinchona succirubrum
(Nigra và cs 1990). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy, fructose là nguồn carbon khá thích hợp cho sinh trưởng của tế bào cây nghệ đen, hỗ trợ sinh trưởng tế bào mạnh hơn glucose nhưng thấp hơn sucrose.
Từ các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện (cỡ mẫu, tốc độ lắc) và môi trường (chất ĐHST, nguồn carbon) nuôi cấy lên sinh trưởng của tế bào cây nghệđen, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy và thiết lập đường cong sinh trưởng của tế bào trong điều kiện thích hợp trên môi trường MS có 30 g/L sucrose, 2,4-D 1,5 mg/L và BA 0,5 mg/L, tốc độ lắc 120 vòng/phút, cỡ mẫu 3 g trong 18 ngày (Hình 3.4). Sinh khối cực đại của tế bào thu được chỉ sau 14 ngày nuôi cấy là 10,44 g tươi; cao gấp hơn 3 lần so với lượng sinh khối tế bào ban đầu.
0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Kh ố i l ượ ng kh ô t ế bà o (g ) Kh ố i l ượ ng t ươ i t ế bào (g )
Thời gian nuôi cấy (ngày)
Khối lượng tươi tế bào Khối lượng khô tế bào
Hình 3.4. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi cấy trong bình tam giác trên môi
59
Hình 3.5. Nuôi cấy tế bào nghệđen trong bình tam giác 250 ml đặt trên máy lắc
Nghiên cứu của Mello và cs (2001a) ở nghệđen cho thấy, khi bổ sung 0,5 g tế bào trong 10 ml môi trường MS có 3% sucrose, 13,4 µM NAA và 2,2 µM BA, tốc độ lắc 60 vòng/phút sẽ thu được 6 g sinh khối tươi sau 35 ngày [101]. Trong khi Miachir và cs (2004) đã nuôi cấy 1 g tế bào nghệđen trong 75 ml môi trường MS có 1 mg/L NAA, tốc độ lắc 100 vòng/phút, sau 20 ngày thu được 8 g sinh khối tươi [103]. Một số nghiên cứu khác, thời gian để tế bào sinh trưởng cực đại dài hơn tế bào nghệ đen, chẳng hạn như tế bào cây Solanum eleagnifolium là 26 ngày (Nigra và cs 1989), Solanum aviculare 28 ngày (Kittipongpatana và cs 1998), Taxus willichiana 32 ngày [112], Solanum chrysotrichum 22 ngày (Rodríguez-Monroy và cs 2004) [134], Psoralea corylifolia 20 ngày (Shinde và cs 2009), Solanum hainanense 28 ngày (Loc và cs 2009), Withania somniera 28 ngày (Nagella và Murthy 2010) [109].