NGUYỄN THỊ THANH HÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ VI SINH Ở BỆNH NHÂN NHIỄM KHUẨN HUYẾT DO ACINETOBACTER BAUMANNII 2011 – 2012 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – NĂM 2015... Mục tiêu đề
Trang 1NGUYỄN THỊ THANH HÀ
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG VÀ
VI SINH Ở BỆNH NHÂN NHIỄM KHUẨN HUYẾT DO
ACINETOBACTER BAUMANNII
(2011 – 2012)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
HÀ NỘI – NĂM 2015
Trang 2Người hướng dẫn khoa học:
1 PGS.TS Nguyễn Trọng Chính
2 TS Phan Quốc Hoàn
Phản biện 1: PGS.TS Trần Viết Tiến
Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Vũ Trung
Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Xuân Thành
Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: ViệnNghiên cứu Khoa học Y Dược lâm sàng 108
Vào hồi 09 giờ ngày 08 tháng 03 năm 2015
Có thể tìm hiểu luận án tại:
1 Thư viện Quốc gia
2 Thư viện BV TWQĐ 108
Trang 3ĐẶT VẤN ĐỀ
Tính cấp thiết của đề tài
Nhiễm khuẩn huyết (NKH) là một trong 10 nguyên nhân thường gặp
ở bệnh nhân nằm viện Chi phí điều trị từ 10.000 - 50.000 đô la/ca bệnh
và lên đến 17 tỷ đô la/năm, thời gian nằm viện trung bình tăng thêm 19,6ngày Tác nhân gây NKH nổi lên hiện nay là vi khuẩn Gram âm, với bệnhcảnh lâm sàng nặng, tử vong cao và đa kháng kháng sinh (KS)
Acinetobacter baumannii (A baumannii) là một vi khuẩn Gram âm được
biết đến do khả năng gây bệnh nặng, đa kháng KS, chi phí điều trị, thờigian nằm viện và tử vong cao hơn so với NKH do những tác nhân khác
A baumannii mang nhiều gen kháng KS, quan trọng nhất là gen
oxacillinase (OXA), một gen có khả năng thủy phân và ly giải KS nhómβ-lactam, làm giảm tác dụng, gia tăng kháng KS, không chỉ với nhóm β-lactam mà còn với nhóm KS khác Ở Việt Nam hiện nay có ít nghiên cứuđầy đủ về vi khuẩn này về lâm sàng và vi sinh học
Ý nghĩa của đề tài
Việc nhận biết sớm lâm sàng, cận lâm sàng, sự kháng thuốc của A.
baumannii góp phần tiếp cận chẩn đoán sớm, điều trị hiệu quả.
Mục tiêu đề tài
Mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân nhiễm
khuẩn huyết do A.baumannii,
Đánh giá mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng A baumannii
phân lập được từ máu bệnh nhân,
Phát hiện gen OXA kháng nhóm carbapenem và tìm mối tương đồng
về kiểu gen của các chủng A baumannii phân lập được
và 127 tài liệu tiếng Anh
Trang 4Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1.Đặc điểm dịch tễ NKH do A baumannii ở Thế giới, Châu Á và
Việt Nam.
Nghiên cứu tại Mỹ cho thấy tỷ lệ mắc NKH chiếm 1,3% cho tất cả
các trường hợp nhiễm khuẩn mắc phải trong bệnh viện, thường gặp ở
khoa Hồi sức tích cực (HSTC) hơn là khoa khác Tỷ lệ tử vong cao khinằm ở ở khoa HSTC và dao động từ 34 - 43%, trong khi ở các khoa khác
16% Nghiên cứu tại Israel trong 3 năm có 219 trường hợp NKH do A.
baumanii và tỷ lệ tử vong là 36,5% và tỷ lệ BN sử dụng thủ thuật xâm lấn
(TTXL) chiếm đến 50%, do các vi khuẩn khác là 26%
Nghiên cứu (NC) ở Malaysia cho thấy NKH do A baumannii chỉ
chiếm 6,11% và có tỷ lệ cao ở HSTC hơn là khoa khác (53,4% so với
46,6%), thời gian xuất hiện NKH do A baumannii trung bình 16,6 ngày
Ở Việt Nam những năm gần đây, nhiều báo cáo báo động về tìnhtrạng gia tăng lây nhiễm vi khuẩn này, như NC của Phạm Hùng Vân
(2010), thực hiện ở 16 bệnh viện cho thấy tỷ lệ cấy máu (+) với A.
baumannii 9,5% Đoàn Mai Phương (2012), nhiễm A baumannii tăng từ
24,9% (2002) lên 42% (2009) và NKH là 11,8% và gia tăng tỷ lệ khángvới các KS điều trị một cách nhanh chóng
1.2.Đặc điểm lâm sàng của NKH do A baumannii
Hiệp hội lồng ngực và Nội khoa Mỹ đưa ra định nghĩa về NKH vớiHội chứng đáp ứng viêm toàn thân (SIRS) và bằng chứng NK như sau:
- Cấy máu 2 lần dương tính với A.baumannii,
- Có SIRS: 2/4 tiêu chuẩn, 1 trong 2 tiêu chuẩn bắt buộc là có bấtthường về thân nhiệt và bạch cầu máu ngoại vi:
+ Nhiệt độ tăng > 38°C hoặc < 36 °C
+ Tần số tim > 90 lần/phút ở người lớn và trên 2 độ lệch chuẩn (2SD)
so với giá trị bình thường theo tuổi ở trẻ em
+ Tần số thở > 20 lần/phút hoặc PaCO2 < 32 mmHg (tự thở) ở ngườilớn và trên 2 độ lệch chuẩn (2SD) so với giá trị bình thường theo tuổi
ở trẻ em
+ Bạch cầu >12 000 hoặc < 4000/mm3, hoặc > 10% bạch cầu non ở máungoại vi
Trang 51.3. Đặc điểm cận lâm sàng NKH do A baumannii:
Có nhiều rối loạn đi kèm từ huyết học, đông máu và sinh hóa như:
Huyết học: Bạch cầu trung tính thường tăng >12.000/mm3 hoặc giảm
< 4.000/mm3 hoặc có > 10% bạch cầu non ở máu ngoại biên Hồngcầu, Hemoglobin bình thường hoặc giảm trong NKH nặng, SNK.Tiểu cầu bình thường hoặc giảm <100.000/mm3 hoặc giảm >30 % giátrị bình thường khi có NKH nặng và SNK
Chức năng đông máu: bị rối loạn như giảm tỷ lệ Prothrombin < 70%,Thời gian máu đông > 15 giây, aPTT > 60 giây, INR > 1.5
Sinh hóa máu: CRP bình thường nồng độ <7 mg/dl Trong NKH, tăngtrong 4-6 giờ đầu, tăng gấp đôi mỗi 8 giờ và đạt nồng độ đỉnh sau 35-
50 giờ Creatinin tăng cao > 2,0 mg/dl khi NKH có suy thận, NKHnặng và SNK Lactate bình thường hoặc tăng cao gấp 2 lần bìnhthường và có giá trị tiên lượng NKH và SNK
Procalcitonin đặc hiệu cho chẩn đoán NKH, bình thường PCT < 0,5ng/ml khi PCT 2,0-10 ng/ml tương ứng với SIRS nghiêm trọng
Các xét nghiệm khác: XQ tim phổi, siêu âm có thể giúp ích khi truytìm các ổ nhiễm khuẩn tiên phát, thứ phát…
1.4 Một số yếu tố nguy cơ dễ nhiễm A baumannii
Một số đối tượng dễ mắc bệnh: trẻ sơ sinh, người lớn > 65 tuổi, bệnhnhân mạn tính và đặc biệt trên bệnh nhân phải chịu thủ thuật xâm lấn(đặt catheter trong lòng mạch, đặt thông tiểu, thở máy, phẫu thuật) và phải
điều trị tại khoa Hồi sức tích cực kéo dài.
1.5. Vấn đề kháng kháng sinh của A.baumannii
Có bốn cơ chế thường gây hiện tượng đa kháng thuốc ở
A.baumannii: (i) Thay đổi vị trí đích tác động (thay đổi đích PBP) (ii) Đột
biến mất kênh porin không cho KS qua màng vào bên trong vi khuẩn, (iii)Bất hoạt KS qua các bơm đẩy KS ra ngoài và (iv) tiết enzyme để phá hủy
KS Trong đó cơ chế bơm đẩy đóng vai trò quan trọng nhất Tính kháng
thuốc được mã hóa trên plasmid và nhiễm sắc thể, giúp A baumannii có
Trang 6thể di truyền và phát tán yếu tố kháng thuốc trong cùng, khác loài và nguy
cơ gây dịch
1.5.1 Đặc điểm gen kháng nhóm β- lactam củaA.baumannii
Sự kháng KS của A baumannii chủ yếu do các gen có chứa gen mã
hóa enzyme thuộc lớp D (viết tắt là CHLDs - carbapenem-hydrolyzingclass D beta-lactamases) của vi khuẩn có khả năng thủy phân và ly giảicác KS nhóm β_lactam Men lactam Men β-lactamase thuộc lớp D kháng với nhóm
carbapenem của A baumannii phát hiện đầu tiên ở Scottland và được đặt
tên OXA_lactam Men 23, tiếp theo nhiều gen khác được phát hiện OXA_lactam Men 23,OXA_lactam Men 24/40 OXA_lactam Men 58, OXA_lactam Men 143, OXA_lactam Men 51,…
1.5.2 Nghiên cứu về gen kháng thuốc của A baumannii trên thế giới
Có nhiều nghiên cứu về kháng KS của A.baumannii ở nhiều quốc
gia trên thế giới Các gen OXA_lactam Men 51, OXA_lactam Men 23 và OXA_lactam Men 58 đã phát hiện ởnhiều quốc gia trên thế giới Trong đó, gen OXA_lactam Men 51, là gen kháng nội tại
tự nhiên và gắn nhiễm sắc thể A.baumannii Gen OXA_lactam Men 23 được mã hóa
trên nhiễm sắc thể và plasmid, đã phát hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới,gần đây đã tìm thấy ở nhiều quốc gia Châu Á như Trung Quốc, HànQuốc, Thái Lan, Đài Loan Gen OXA_lactam Men 58 cũng là một gen kháng thuốc
mã hóa trên nhiễm sắc thể, plasmid và có khả năng kháng thuốc rất cao,thường tìm thấy ở các nước châu Âu, tại Mỹ, Kuwait, Afganistant và đâychính là mối đe dọa đến công tác điều trị tại các bệnh viện
1.5.3 Nghiên cứu về gen kháng KS của A baumannii trong nước
Hiện vẫn chưa có nhiều nghiên cứu đầy đủ về lâm sàng, kháng kháng
sinh của nhiễm khuẩn huyết do A.baumanniii và nhất là phát hiện gen
OXA kháng carbapenem (OXA_lactam Men 51, OXA_lactam Men 23, OXA_lactam Men 58) ở quy mô nhiềubệnh viện tại Việt Nam
1.6 Kỹ thuật đánh giá tính kháng kháng sinh của A baumannii
Khoanh giấy khuyếch tán Đo nồng độ ức chế tối thiểu và kỹ thuậtbằng E-test
Trang 71.7. Kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định yếu tố dịch tễ
Kỹ thuật Multiplex –PCR (Polymerase Chain Reaction): giúp pháthiện gen kháng kháng sinh của vi khuẩn
Kỹ thuật điện xung trường (Pulse field gel electrophoresis-PFGE):
tìm mức tương đồng về kiểu gen của vi khuẩn, thành lập cây phả hệ,phát hiện yếu tố dịch tễ, giúp điều trị và ngăn ngừa lây nhiễm
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Địa điểm nghiên cứu: 6 bệnh viện ở 3 miền của Việt Nam: Trung
ương Quân đội 108 (BVTW108), Bạch Mai (BM), Trung ương Huế(TWH), Chợ Rẫy (CR), Trưng Vương (TV), Nhi Đồng 1(ND)
2.2 Đối tượng nghiên cứu: 287 những bệnh nhân được chẩn đoán
NKH cấy máu dương tính với A baumannii tại 6 bệnh viện trên
2.3 Tiêu chuẩn chọn bệnh: Theo Hội nghị của Hiệp hội các thầy thuốc
lồng ngực Mỹ, Hội Hồi sức cấp cứu người lớn và nhi khoa:
- Cấy máu 2 lần dương tính với A.baumannii,
- Và có SIRS: có ít nhất 2/4 tiêu chuẩn chẩn đoán SIRS
2.4 Tiêu chuẩn loại trừ
Loại khỏi nghiên cứu những bệnh nhân NKH có kết quả cấy máudương tính với nhiều loại vi khuẩn và không được theo dõi, thực hiện đầy
đủ các dữ liệu đã được chấp nhận của hội đồng khoa học
2.5 Thiết kế nghiên cứu: mô tả, tiến cứu có theo dõi dọc.
2.6 Thời gian nghiên cứu: từ 01/01/2011 – 30/6/2012.
2.7 Cỡ mẫu nghiên cứu: Lấy mẫu thuận tiện,
- Cỡ mẫu mục tiêu 1: thu được 287 bệnh nhân NKH có cấy máu dương
tính với A baumannii.
- Cỡ mẫu mục tiêu 2: 81 chủng A baumannii từ 287 bệnh nhân NKH để
đo MIC từ những bệnh nhân NKH do A baumannii
- Cỡ mẫu mục tiêu 3: 62 chủng A baumannii để phát hiện gien OXA, 73 chủng A baumannii tìm mối tương đồng kiểu gen (80 chủng đo MIC).
Trang 82.8 Nội dung nghiên cứu và các dữ liệu nghiên cứu
2.8.1 Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng NKH do A baumannii Nghiên cứu đặc điểm chung của NKH do A.baumannii: Giới tính, tuổi,
các khoa lâm sàng, bệnh viện, ngày nằm viện, tự đến hay chuyển viện, ổnhiễm khuẩn ban đầu
Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng NKH do A.baumannii:
Lâm sàng: Từ lúc nhập viện đến cấy máu dương tính với A baumannii,
khi có SNK và ra viện Tất cả đánh giá theo nhóm BN trẻ em và ngườilớn Bao gồm nhiệt độ, nhịp tim, nhịp thở (hỗ trợ hô hấp như thở máy, đặtnội khí quản bóp bóng, mở khí quản), huyết áp động mạch ở BN ngườilớn, mức độ nặng: hôn mê, SIRS và APACHE II
Các thủ thuật xâm lấn: thở máy, mở khí quản, catheter mạch máu trung
tâm, thận nhân tạo, lọc máu, đặt thông tiểu, phẫu thuật
Nghiên cứu đặc điểm cận lâm sàng NKH A.baumannii: bằng các xét
nghiệm theo diễn tiến lâm sàng:
- Huyết học: Hồng cầu, Bạch cầu, Hemoglobin (g/l), Tiểu cầu (G/l)
- Rối loạn đông máu: Prothrombin (%), thời gian máu đông (giây),aPTT (giây), INR
- Sinh hóa máu: Creatinin máu (mg/dl), Lactate (mmol/l), CRP (mg/dl),
Procalcitonin (ng/dl)
Diễn tiến điều trị: bệnh nhân còn sống hay tử vong,
2.8.2. Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của A.baumannii
Kỹ thuật nuôi cấy định danh vận chuyển và lưu trữ: Kỹ thuật nuôi
cấy thường qui của WHO Môi trường nuôi cấy: Blood Agar của hãngBioRad và môi Mac conkey Lưu mẫu tủ (-700C) và chuyển vềBV108 và Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Hà nội (VSDTTWHN)
Kỹ thuật đo MIC: đo tự động bằng máy Phoenix 100 Điểm gẫy
MIC, MIC50 và MIC90 xác định theo CLSI 2012 và WHONET 5.6
Trang 92.8.2 Phát hiện gen kháng OXA và tìm mối tương đồng về kiểu gen
của các chủng A baumannii phân lập được
Kỹ thuật PCR-Multiplex phát hiện gen kháng OXA: thực hiện tại
Viện Quốc gia các bệnh truyền nhiễm Nhật Bản và ViệnVSDTTWHN, sử dụng các đoạn mồi có trình tự theo trình tự của
Woodford và CS (2006), chứng dương là ADN khuôn mẫu được tách chiết từ chủng A Baumannii mang các gen OXA được nghiên cứu từ
Viện Quốc gia các bệnh truyền nhiễm Nhật Bản
Bảng 2.5: Trình tự các đoạn mồi phát hiện gen OXA
Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Kỹ thuật
OXA_lactam Men 58-F 5’-AAG TAT TGG GGC TTG TGC TG-3’
599OXA_lactam Men 58-R 5’-CCC CTC TGC GCT CTA CAT AC-3’
OXA_lactam Men 51-F 5’-TAA TGC TTT GAT CGG CCT TG-3’
353OXA_lactam Men 51-R 5’-TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG-3’
OXA_lactam Men 23-F 5’-GAT CGG ATT GGA GAA CCA GA-3’
501OXA_lactam Men 23-R 5’-ATT TCT GAC CGC ATT TCC AT-3’
Kỹ thuật PFGE tìm mối tương đồng các chủng A baumannii
phân lập được: thực hiện tại Viện VSDTTWHN Vi khuẩn cố định
trong thạch ly giải bằng Protein K, cắt bởi enzym XbaI, điện di bằngmáy điện trường xung (PFGE), chụp bằng máy GelDoc (BIO-RAD)
và phân tích bằng phần mềm Fingerprinting II (BIO-RAD) Kiểu gentương đồng ≥ 90% là có quan hệ di truyền chặt chẽ
2.9 Phương pháp xử lý số liệu
2.9.1 Phương pháp thu nhập thông tin: Tất cả được huấn luyện và thu
thập theo phiếu điều tra được thiết kế đã được thông qua
2.9.2 Quản lý, phân tích dữ liệu: Bằng phần mềm Microsoft Excel
2010, Epidata, STATA 10 Quản lý tài liệu tham khảo bằng Endnote X4
2.10 Vấn đề y đức: nghiên cứu có sự xin phép và được đồng ý của Ban
Gíam Đốc các bệnh viện nơi tiến hành nghiên cứu
Trang 10Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1.1 Đặc điểm chung của NKH do A baumannii
Biểu đồ 3.1: Phân bố theo bệnh viện Biểu đồ 3.2: Phân bố theo giới và lứa tuổi
Có 287 BN NKH do A.baumannii, phân bố lần lượt ở BVNĐ1,
BVCR, BVTV (54,7%, 21,6%, 6,62%); BVTWH (6,97%); BV BM(5,23%) và BV108 (4,88%) Trong đó 167 trẻ em (58,2%), 120 người lớn(41,8%) Nam nhiều hơn nữ ở cả hai lứa tuổi
Bảng 3.1: Phân bố NKH do A baumannii theo diễn tiến điều trị
Tỷ lệ tử vong người lớn (50,83%) cao hơn trẻ em (20,36%)
Bảng 3.2: Ổ nhiễm khuẩn ban đầu
Ổ nhiễm khuẩn ban đầu Trẻ em
Từ nhiễm khuẩn thần kinh 9 (5,39) 0 (0,0) 9 (3,14)
Nhiễm khuẩn vết phỏng 12 (7,2) 24 (20,0) 36 (12,54)Không rõ đường vào 60 (35,93) 23 (19,17) 83 (28,92)
Ổ nhiễm khuẩn ban đầu chiếm tỷ lệ cao nhất ở trẻ em và người lớn là từ đường
hô hấp, kế đến là đường tiêu hóa Ở trẻ em 35% không rõ ổ nhiễm khuẩn ban đầu.
Trang 113.1.2 Đặc điểm lâm sàng nhiễm khuẩn huyết do A baumannii Bảng 3.8: Lâm sàng của NKH do A baumannii theo tuổi
Nhanh 69 (41,32) 25(20,83)
Tình trạng tim mạch (n=287)
Nhịp chậm 7 (4,19) 0 (0,00)
0,00* Bình thường 108 (64,67) 30 (25,00)
Nhịp nhanh 52 (31,14) 90 (75,00)
SIRS lúc nhập viện (n=287)
Có SIRS 111 (66,47) 58 (48,33)
0,00* Không SIRS 56 (33,53) 62 (51,67)
Sốc nhiễm khuẩn (n=287)
Có sốc 44 (26,35) 55 (45,83) 0,00* Không sốc 123(73,65) 65 (54,17)
Trang 12Bảng 3.5: Lâm sàng NKH do A baumannii theo diễn tiến bệnh
Lâm sàng
n = 287
Nhóm BN trẻ em Nhóm BN người lớn Còn sống
n=133 (%) n=34 (%)Tử vong p Còn sốngn=59 (%) n=61 (%)Tử vong p
Hôn mê lúc lúc nhập viện
Có 9 (6,77) 14 (41,18)
0,00 12 (20,34) 20 (32,79) 0,12 Không 124 (93,23) 20 (58,8) 47 (79,66) 41 (67,21)
SIRS (n=287)
Có 80 (60,15) 31 (91,82)
0,00
7 (11,85) 51 (83,61) 0,00Không 53 (39,85) 3 (8,82) 52 (88,14) 10 (16,39)
Có thủ thuật xâm lấn
Có 40 (30,08) 27 (79,41)
0,00
35 (59,32) 58 (95,08) 0,00Không 93 (69,92) 7 (20.59) 24 (40,68) 3 (4,92)
(*): Chi – square test, p<0,05 có ý nghĩa thống kê
Trẻ em tử vong có hôn mê, SIRS, thân nhiệt 38,5 0C, phải hỗ trợ hôhấp, nhịp tim nhanh, SNK, suy đa tạng, thủ thuật xâm lấn cao hơn nhómsống (41,1%, 91,8%, 38%, 64,7%, 52,9%, 85,2%, 100%, 79,4% so với6,7%, 60,1%, 25,5%, 11,2%, 25,5%, 11,2%, 14,2%, 30,8%) với p < 0,05
Trang 13Người lớn tử vong có hôn mê, SIRS, thân nhiệt > 38,5 0C, hỗ trợ hô hấp,nhịp tim nhanh, SNK, suy đa tạng, thủ thuật xâm lấn cao hơn nhóm sống(32,7%, 83,6%, 57,3%, 59%, 86,8%, 75,4%, 78,6%, 95% so với 20,4%,11,8%, 52,5%, 20,3%, 62,7%, 12%, 11,8% 59,3%) với p <0,05.
3.1.3. Đặc điểm cận lâm sàng NKH do A.baumannii
Bảng 3.8: Xét nghiệm huyết học NKH do A baumannii theo diễn tiến bệnh
*Chi square test, p<0,05 có ý nghĩa thống kê
Ở trẻ em và người lớn tử vong giá trị Bạch cầu giảm, Hb < 100 g/l, khi NKH và SNK cao hơn so với BN còn sống, với p > 0,05 Riêng tiểu cầu <
100 G/l ở trẻ em tử vong cao hơn trẻ còn sống với p < 0,05
Trang 14Bảng 3.9: Xét nghiệm đông máu NKH do A baumannii ở trẻ em và người lớn
(a) t-test; *Chi square test, p<0,05 có ý nghĩa thống kê
Có tình trạng rối loạn đông máu ở cả trẻ em và người lớn với trungbình của máu đông, aPTT ở trẻ em cao hơn người lớn trong NKH và SNK(19,7 ± 11,05 và 31,3 ± 26,9 so với 17,0 ± 4,5 và 20,5 ± 7,6; với p< 0,05) Các giá trị trung bình của Prothrombin, INR cũng bị rối loạn và tăngcao hơn giá trị bình thường, nhưng tất cả đều không có ý nghĩa thống kêvới p > 0,05
Bảng 3.16: Giá trị sinh hóa máu NKH A baumannii theo tuổi
n = 48 49,5 (13-146)
n = 19 25,6 (8,3-103)
n = 38
36 (16,6-195)