ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ KHOẢNG CÁCH DI TRUYỀN CỦA 4 QUẦN THỂ BÒ VÀNG ĐỊA PHƯƠNG :HÀ GIANG, LẠNG SƠN, THANH HÓA VÀ NGHỆ AN Phạm Doãn Lân, Ng c Duy, Trần Thị Thu Thủy, Lê Quang Nam, Nguyễn Văn Ba, Lê Anh Quỳnh và Nguyễn Trọng Bình Phòng thí nghiệm trọng ñiểm công nghệ tế bào ñộng vật TÓM TẮT Nghiên cứu ñược thực hiện nhằm ñánh giá tính ña dạng di truyền và sai khác di truyền của 4 nhóm bò vàng ñịa phương: Hà Giang, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Nghệ An. Đồng thời, nghiên cứu ñược thực hiện trên một quần thể bò Brahman nhập ngoại ñể so sánh. Kết quả phân tích trên 27 microsatelite cho thấy các quần thể bò vàng có tính ña dạng di truyền cao với trung bình số alen trên một locus ở mỗi quần thể dao ñộng trong khoảng từ 8,3 ñến 9,7 và tần số dị hợp tử dao ñộng trong khoảng 0,70 ñến 0,74. Hệ số cận huyết của các nhóm bò vàng ñều thấp dao ñộng trong khoảng 0,055 ñến 0,081 và cao nhất là ở quần thể bò ngoại (Fis=0.115), trung bình là 0,077. Khoảng cách di truyền giữa các quần thể bò vàng dao ñộng trong khoảng 0,084 ñến 0,106. Kết quả kiểm ñịnh thống kê cho thấy sự sai khác di truyền giữa các nhóm bò vàng nghiên cứu là có ý nghĩa (P<0,05), tuy nhiên cây phân loại di truyền và kết quả phân tích bằng phương pháp PCA cho thấy các quần thể bò vàng không thực sự tách thành các nhóm riêng biệt ñiều này chỉ ra rằng mức ñộ sai khác giữa các quần thể bò vàng là không cao. Từ khóa: Đa dạng di truyền, bò vàng, ñịa phương, microsatellite 1.Đặt vấn ñề Ở Việt Nam hiện nay có khoảng 7 nhóm bò vàng ñịa phương, mỗi nhóm chúng mang những nét ñặc trưng ñược chọn lọc theo sở thích của người dân và ñáp ứng với ñiều kiện khí hậu ở từng vùng (Lê Viết Ly và cs 1999). Các nhóm bò này thường có kích thước nhỏ năng suất thịt, sữa thấp nhưng chúng lại có khả năng chịu ñược ñiều kiện khó khăn, khả năng kháng bệnh và sinh sản tốt. Đã có những quan ñiểm khác nhau về nguồn gốc và phân loại của những nhóm bò này, một số cho rằng những nhóm bò này ñều thuộc một giống bò vàng Việt Nam trong khi ñó một số khác lại cho rằng chúng là những giống ñịa phương khác nhau và ñược ñặt theo tên giống theo từng ñịa danh như: giống bò Mèo (Hmông), Lạng Sơn, Thanh Hóa, Nghệ An, Urìu, Phú yên và Bà Rịa. Tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào làm sáng tỏ về mối quan hệ di truyền của các nhóm bò này ở mức ñộ phân tử. Mặt khác, ñể nâng cao năng suất trong chăn nuôi bò nuôi ở Việt Nam nên ñã ñược lai với các giống bò ngoại, do ñó số lượng cá thể bò vàng bản ñịa ñang bị suy giảm nghiêm trọng. Các nhóm bò vàng bản ñịa thường mang tính ñặc thù rất lớn và có ý nghĩa trong việc duy trì ña dạng sinh học do ñó cần ñược duy trì và bảo tồn. Sử dụng các chỉ thị phân tử ñể ñánh giá ña dạng di truyền và mối quan hệ di truyền của các giống (quần thể) vật nuôi ñã ñược thực hiện nhiều trên thế giới. Trong ñó chỉ thị microsatellite là một trong những chỉ thị hữu hiệu và ñược sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu nhằm ñánh giá ña dạng di truyền và mối quan hệ di truyền của các giống (quần thể) vật nuôi. Trong vòng 15 năm trở lại ñây rất nhiều các nghiên cứu sử dụng chỉ thị microsatellite ñể ñánh giá ña dạng di truyền và mối quan hệ di truyền của các quần thể bò ñược thực hiện trên thế giới (MacHugh và cs,1998; kantanen và cs, 2000; Chikhi và cs, 2004; Gautier và cs, 2007; Li và cs, 2007; Zhang và cs, 2007; Flury và cs, 2009; Sodhi và cs, 2011). Trong khi ñó những nghiên cứu nhằm ñánh giá ña dạng di truyền và mối quan hệ di truyền ở các quần thể bò vàng ñịa phương con chưa ñược thực hiện. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng các chỉ thị phân tử microsatellite ñể ñánh sự ña dạng di truyền và sai khác di truyền của 4 nhóm bò vàng ñịa phương: Hà Giang, Lạng Sơn, Thanh Hóa và Nghệ An. 2. Vật liệu và phương pháp 2.1. Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu ñược thực hiện trên 4 nhóm bò vàng ñịa phương và 1 quần thể bò ngoại: bò vàng Lạng Sơn (LS), bò vàng Hà Giang (HG), bò vàng Thanh Hóa (TH), bò vàng Nghệ An (NA). Ngoài ra, một quần thể bò Brahman ngoại nhập (BN) ñược chúng tôi phân tích ñể so sánh. Địa ñiểm và số mẫu của mỗi nhóm ñược thể hiện ở bảng 1. ảng 1. Địa ñiểm và số lượng mẫu phân tích ở các nhóm bò Nhóm bò Địa ñiểm thu mẫu Số mẫu Bò vàng Hà Giang Đồng Văn- Hà Giang 100 Bò vàng Lạng Sơn Bình Gia- Lạng Sơn 100 Bò vàng Thanh Hóa Như Xuân- Thanh Hóa 100 Bò vàng Nghệ An Yên Thành- Nghệ An 100 Bò Brahman Củ Chi- TP HCM 100 Tổng 500 2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết ADN ADN ñược tách chiết theo quy trình bộ kít Bioneer (Hàn quốc) 2.2.2. Phản ứng PCR Hai mươi bảy cặp mồi microsatellite ñược chúng tôi sử dụng theo khuyến cáo của tổ chức Nông lương thế giới (FAO) và Hội di truyền học quốc tế (ISAG), ñược chuẩn hoá trong 6 phản ứng PCR ña mồi. Mỗi phản ứng PCR ña mồi (mix) ñược thực hiện trong thành phần phản ứng: Đệm PCR 10X: 2,0-2,5 µl, dNTP mix (2mM mỗi loại) 2,5 µl, Mg 2+ (25mM) 2,0-2,5 µl , mồi (mồi xuôi và mồi ngược 10 pM mỗi loại) 0,1-1µl, ADN Taq polymerase 0,3 µl, ADN 1,0 µl, H 2 O vô trùng thêm vào sao cho tổng thể tích cuối cùng là 25 µl. Phản ứng PCR ñược thực hiện theo chu trình nhiệt: 95 0 C trong 5 phút, 30-35 chu kỳ với: 94 0 C trong 30- 45 giây, 55 0 C-58 0 C trong 30-45 giây, 72 0 C trong 30-45 giây. 72 0 C trong 10 phút. 2.2.3. Phân tích ña hình các locus microsatellites 1µl của tất cả các sản phẩm multiplex-PCR sau khi bổ sung 25µl ñệm SLS (Sample Loading Solution Beckman Coulter) và 0.15µl thang ADN chuẩn (DNA Size standard Beckman Coulter) ñược tiến hành phân tách bằng hệ thống ñiện di mao quản trên máy giải trình tự tự ñộng CEQ8000 của hãng Beckman Coulter. Kích thước các alen ñược phân tích tự ñộng bằng phần mềm Genetics analysis system cho máy CEQ8000 (phiên bản 9.0). 2.2.4. Phân tích thống kê Một số chỉ số như: số lượng alen, trung bình số lượng alen trên mỗi locus, tần số dị hợp tử quan sát (Ho), dị hợp tử lý thuyết (He), các giá trị thống kê F theo Wright (Wright’F-statistics), khoảng cách di truyền, hệ số cận huyết Fis ñược ước lượng bằng phần mềm Genetix. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa, cây phân loại di truyền giữa các quần thể bằng phần mềm Population và Treeview. Khoảng cách di truyền ñược tính theo phương pháp của Nei (1972) và kiểm ñịnh sự sai khác di truyền theo tiêu chuẩn “khi bình phương” bằng phần mềm Genetix. Thực hiện phép phân tích PCA (Principal Coodinates Analysis) bằng phần mềm Genetix. 3. K t quả và thảo luận 3.1. Sự ña dạng di truyền Sự ña dạng di truyền của quần thể ñược ước lượng bởi các chỉ số như: tổng số alen thu ñược, số lượng các alen của mỗi locus microsatellite, ñộ phong phú của alen và tần số dị hợp tử. Kết quả phân tích trên toàn bộ 5 quần thể ñược thể hiện ở bảng 2. Tổng số 321 alen ñược xác ñịnh trên 27 locus microsatellite, số alen trên một locus dao ñộng từ 8 (locus INRA005 và ILSTS005) ñến 17 (locus ETH185) và trung bình số alen trên một locus của toàn bộ số mẫu phân tích là 11,9. Hầu hết các locus ñều có ñộ ña hình cao, tần số dị hợp tử lý thuyết (He) của các locus dao ñộng từ 0,49 (locus ETH3, TGLA22) ñến 0,865 (locus ETH185). Các alen ñặc trưng của các locus dao ñộng từ 4 ñến 5. Hệ số cận huyết của các locus nhìn trung là thấp, trung bình trên 27 locus là 0,077. Kết quả phép kiểm tra tính cân bằng di truyền cho thấy 19 trên 27 locus là ở trạng thái cân bằng di truyền Hardy-Weinberg. ảng 2: S alen, tần số dị hợp tử quan sát (Ho , dị hợp tử lý thuy t (He , ñộ phong phú alen (AR , alen c trưng, giá trị hệ số cận huyết (Fis và kết quả kiểm tra tính cân bằng di truyền Hardy Weinberg của từng locus trên toàn bộ quần thể Locus Số alen Ho He AR PA Fis Kiểm tra tính cân bằng HW CSRM60 12 0,648 0,833 11,200 0 0,188 ** CSSM66 11 0,570 0,713 8,890 2 0,161 ** HEL1 12 0,541 0,609 8,711 1 0,036 ** INRA063 10 0,595 0,766 8,873 1 0,148 ** INRA037 10 0,685 0,720 8,394 1 -0,011 NS HEL13 11 0,634 0,778 9,092 0 0,143 ** SPS115 14 0,661 0,832 11,118 0 0,181 ** TGLA12 9 0,580 0,716 7,321 0 0,171 ** INRA032 13 0,660 0,809 9,973 2 0,175 ** ETH3 10 0,414 0,495 7,355 0 0,115 ** ILSTS006 12 0,629 0,799 9,943 1 0,199 ** BM1818 10 0,773 0,783 8,720 1 -0,008 NS HEL9 16 0,769 0,857 13,001 2 0,059 ** ETH152 12 0,785 0,742 9,551 1 -0,078 NS INRA005 8 0,788 0,790 7,036 1 -0,048 NS HAUT27 13 0,874 0,807 11,557 1 -0,107 ** TGLA22 13 0,430 0,490 9,239 2 0,074 ** BM1824 9 0,625 0,724 7,496 1 0,092 ** INRA035 16 0,736 0,842 11,222 2 0,074 ** ILSTS005 8 0,487 0,564 6,651 1 0,110 ** MM12 14 0,784 0,796 11,054 3 0,002 NS ETH185 17 0,732 0,865 14,374 0 0,109 ** BM2113 11 0,717 0,811 9,938 0 0,043 ** ETH10 9 0,698 0,746 7,081 1 0,041 NS ETH225 15 0,771 0,795 10,317 3 0,015 NS TGLA122 14 0,766 0,834 11,889 0 0,033 NS INRA023 12 0,698 0,818 10,371 1 0,121 ** Trung bình 11,9 0,670 0,750 9,643 0,077 : cân bằng di truyền với P< ; NS: không cân bằng K t quả phân tích tính ña dạng di truyền của từng quần thể bò nghiên cứu ñược thể hiện ở bảng 3. Số lượng alen ñược xác ñịnh trên 27 locus ở mỗi quần thể dao ñộng từ 225 (bò ngoại) ñến 261 (Hà Giang, Thanh Hóa). Trung bình số alen trên một locus ở mỗi quần thể dao dộng từ 8,3 ñến 9,7. Tần số dị hợp tử (He) dao ñộng từ 0,70 (bò ngoại) ñến 0,75 (Hà Giang). Hệ số cận huyết thể hiện rất thấp ở mỗi quần thể bò vàng (dao ñộng từ 0,055 ñến 0,081). Hệ số cận huyết thể hiện cao nhất ở quần thể bò ngoại (0,115). ảng 3. S alen, tần số dị hợp tử quan sát (Ho , dị hợp tử lý thuyết (He , alen ñặc trưng, giá trị hệ số cận huyết (Fis và trung bình số alen/locus ở mỗi quần thể bò nghiên cứu Quần thể Số alen PA He Ho Fis Trung bình số alen/locus BN 225 4 0,70 0,63 0,15 8,3 HG 261 6 0,74 0,69 0,075 9,7 LS 240 6 0,72 0,67 0,081 8,8 NA 248 5 0,72 0,70 0,059 9,2 TH 261 7 0,72 0,69 0,055 9,7 Kết quả phân tích ở trên cho thấy cả 27 chỉ thị microsatellite ñược sử dụng nghiên cứu ñều phù hợp vì có tính ña hình cao số alen ñược xác ñịnh ở mỗi locus ñều nhiều hơn 4, theo Barker và cs (1994) thì chỉ những locus có số alen từ 4 trở lên mới phù hợp ñể nghiên cứu ña dạng di truyền. Trung bình số alen trên một locus ở mỗi quần thể bò vàng nghiên cứu thể hiện tương ñối cao và nằm trong khoảng kết quả nghiên cứu trên các giống (quần thể) bò khác nhau của một số tác giả trên thế giới như: nghiên cứu của Canon và cs (2001) trên các giống bò Châu Âu (MNA=6,5); Beja-pereire và cs (2003) trên các giống bò tây nam Châu Âu (MNA=6,5); Zhang và cs (2007) trên bò vàng trung quốc (MNA=29,33); Sodhi và cs (2011) trên bò Ấn Độ (MNA= 2,84). Mặt khác, với tần số dị hợp tử (He) trung bình là 0,73 ñã chỉ ra rằng tính ña dạng di truyền cao ở các quần thể bò vàng Việt Nam. Kết quả này của chúng tôi tương ñương với kết quả nghiên cứu của một số tác giả trên các quần thể bò ở các nước ñang phát triển như Trung Quốc (Zhang và cs 2007; Sun và cs 2008) (He= 0,725); Ethiopia (Dadi và cs 2008) (He=0,726); Ấn Độ (Sodhi và cs 2011) (He=0,769) và cao hơn các kết quả nghiên cứu trên các quần thể bò ở các nước Châu Âu (Canon và cs 2001; MacHugh và cs 1998) (He=0,6-0,71). Hệ thống và phương thức chăn nuôi là một trong những yếu tố ảnh hưởng nhiều ñên mức ñộ ña dạng di truyền, ở các nước ñang phát triển trong ñó có Việt Nam thì bò thường ñược nuôi bởi các hộ gia ñình nhỏ lẻ và với phương thức chăn thả tự nhiên, ít sử dụng cac biện pháp thụ tinh nhân tạo và chọn lọc vì vậy nên vẫn giữ ñược tính ña dạng di truyền cao. 3.2. Khoảng cách và mối quan hệ di truyền Khoảng cách di truyền giữa các quần thể bò phân tích ñược ước lượng theo phương pháp chuẩn của Nei (1972) và ñược thể hiện ở bảng 4. Khoảng cách di truyền giữa các quần thể bò dao ñộng trong khoảng 0,084 ñến 0,242. Qua phép kiểm ñịnh thống kê cho thấy sai khác di truyền giữa quần thể bò ñều có ý nghĩa (P<0,05). Khoảng cách di truyền thể hiện cao nhất giữa quần thể bò ngoại (BN) và các quần thể bò vàng, khoảng cách di truyền giữa các quần thể bò vàng dao ñộng trong khoảng 0,084 ñến 0,106. Từ kết quả phân tích cho thấy, mặc dù sai khác di truyền giữa các quần thể bò vàng ñều có ý nghĩa thống kê, tuyên nhiên mức ñộ sai khác di truyền là không cao. Bảng 4. Ma trận khoảng cách di truyền giữa các quần thể bò nghiên cứu ñược tính theo phương pháp của Nei BN HG LS NA TH BN 0,000 HG 0,242 0,000 LS 0,315 0,084 0,000 NA 0,242 0,106 0,102 0,000 TH 0,283 0,103 0,097 0,103 0,000 Cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các quần thể bò ñược xây dựng theo phương pháp UPGMA dựa trên khoảng cách di truyền ñược thể hiện ở hình 1. Qua hình 1 cho thấy cây phân loại ñược chia thành 2 nhánh chính phân tách giữa quần thể bò ngoại và các quần thể bò vàng. Sự phân tách giữa các quần thể bò vàng trên cây phân loại là không thực sự rõ ràng. Tương tự, ở kết quả phân tích sử dụng phương pháp PCA (Principle Coordinates Analysis) dựa trên khoảng cách di truyền của tât cả các cá thể phân tích (Hình 2) cũng cho thấy quần thể bò vàng không thực sự tách biệt với nhau. nh 1. Cây phân lo i di truyền gi a các quần th bò ñược xây d ng theo phương pháp UPGMA d a trên khoảng cách di truyền Nei ( Hình 2. Mô ph ng k t qu phân tích PCA (Principle Coordinates Analysis của các quần thể bò nghiên cứu 4. K t luận và ñề nghị 4.1. K t luận Bốn quần thể bò vàng ñịa phương (Hà Giang, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Nghệ An) ñều có tinh ña dạng di truyền cao. Mặc dù sự sai khac di truyền giữa 4 quần thể bò vàng ñều có ý nghĩa thống kê (P<0,05) tuy nhiên mức ñộ sai khác này là không cao. 4.2. Đề nghị Cần tiếp tục phân tích bằng các phần mềm thống kê khác ñể xác ñịnh các quần thể bò vàng nói trên thuôc một giống hay là các giống khác nhau. Tài liệu tham khảo 1. Lê Viết Ly và cộng sự ( Chuyên khảo bảo tồn nguồn gen vật nuôi ở Việt Nam. Tập I: Phần gia súc. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. 2. Barker, J.S.F., 1994. A global protocol for determining genetic distances among domestic livestock breeds. In: Proceedings of the 5th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production, Guelph and Ontario, Canada. 21, 501-508. 3. eja Pereira, A., Alexandrino, P., essa, I., Carretero, Y., unner, S., Ferrand, N., ordana, ., Laloe, ., Moazami Goudarzi, ., Sanchez, A., Canon, ., 2003. Genetic characterization of southwestern European bovine breeds: a historical and biogeographical reassessment with a set of 16 microsatellites. J Hered 94, 243- 250. 4. Canon, ., Alexandrino, P., essa, I., Carleos, C., Carretero, Y., unner, S., Ferran, N., Garcia, ., ordana, ., Laloe, ., Pereira, A., Sanchez, A., Moazam Goudarzi, ., . Genetic diversity measures of local European beef cattle breeds for conservation purposes. Genet Sel Evol 33, 311-332. 5. Chikhi, L., Goossens, ., reanor, A., ruford, M.W., 2004. Population genetic structure of and inbreeding in an insular cattle breed, the Jersey, and its implications for genetic resource management. Heredity 92, 396-401. 6. adi, H., ibbo, M., akahashi, Y., Nomura, ., Hanada, H., Amano, ., 2008. Microsatellite analysis reveals high genetic diversity but low genetic structure in Ethiopian indigenous cattle populations. Anim Genet 39, 425-431. 7. Flury, C., Ngandolo, .N.R., Müller, ., Zinsstag, ., adarmideen, H.N., Molecular characterization of two common Chadian cattle breeds. AGRI 44, 67- 76. 8. Gautier, M., Faraut, ., Moazami Goudarzi, ., Navratil, V., Foglio, M., Grohs, C., oland, A., Garnier, .G., oichard, ., Lathrop, G.M., Gut, I.G., ggen, A., 2007. Genetic and haplotypic structure in 14 European and African cattle breeds. Genetics 177, 1059-1070. 9. Gutierrez, .P., Royo, L. ., Alvarez, I., Goyache, F., 2005. MolKin v2.0: a computer program for genetic analysis of populations using molecular coancestry information. J Hered 96, 718-721. 10. antanen, ., Olsaker, I., Holm, L. ., Lien, S., Vilkki, J., Brusgaard, K., ythorsdottir, ., Danell, B., Adalsteinsson, S., 2000. Genetic diversity and population structure of 20 North European cattle breeds. J Hered 91, 446-457. 11. Li, M.H., apio, I., Vilkki, ., Ivanova, Z., iselyova, ., Marzanov, N., Cinkulov, M., Stojanovic, S., Ammosov, I., Popov, R., antanen, ., 2007. The genetic structure of cattle populations ( os taurus) in northern Eurasia and the neighbouring Near Eastern regions: implications for breeding strategies and conservation. Mol Ecol 16, 3839-3853. 12. MacHugh, . ., Loftus, R. ., unningham, P., Bradley, D.G., Genetic structure of seven European cattle breeds assessed using 20 microsatellite markers. Anim Genet 29, 333-340. 13. Nei, M., Genetic distance between populations. American Naturalist 106, 283-292. 14. Sodhi, M., Mukesh, M., Mishra, .P., Ahlawat, S.P., Prakash, ., Sobti, R.C., Microsatellite analysis of genetic population structure of zebu cattle (Bos indicus) breeds from north-western region of India. Anim Biotechnol 22, 16-29. 15. Sun, W., Chen, H., Lei, C., Lei, X., Zhang, Y., 2008. Genetic variation in eight Chinese cattle breeds based on the analysis of microsatellite markers. Genet Sel Evol 40, 681-692. 16. Zhang, G.X., Wang, Z.G., Chen, W.S., Wu, C.X., Han, X., Chang, H., Zan, L.S., Li, R.L., Wang, .H., Song, W. ., Xu, G.F., Yang, H. ., Luo, Y.F., 2007. Genetic diversity and population structure of indigenous yellow cattle breeds of China using 30 microsatellite markers. Anim Genet 38, 550-559. Weir, .S., Cockerham, C.C Estimating F-statistics for the analysis of populations structure. Evolution 38, 1358-1370. . hiện trên 4 nhóm bò vàng ñịa phương và 1 quần thể bò ngoại: bò vàng Lạng Sơn (LS), bò vàng Hà Giang (HG), bò vàng Thanh Hóa (TH), bò vàng Nghệ An (NA). Ngoài ra, một quần thể bò Brahman ngoại. ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ KHOẢNG CÁCH DI TRUYỀN CỦA 4 QUẦN THỂ BÒ VÀNG ĐỊA PHƯƠNG :HÀ GIANG, LẠNG SƠN, THANH HÓA VÀ NGHỆ AN Phạm Doãn Lân, Ng c Duy, Trần Thị Thu Thủy, Lê Quang Nam,. 4. K t luận và ñề nghị 4. 1. K t luận Bốn quần thể bò vàng ñịa phương (Hà Giang, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Nghệ An) ñều có tinh ña dạng di truyền cao. Mặc dù sự sai khac di truyền giữa 4 quần thể