Ảnh hưởng của sự phân cắt nơi sống đến tính đa dạng di tuyền của một số loài Tuế (Cycas, Cycadaceae) ở Việt Nam
bộ giáo dục Viện khoa học Và đào tạo và công nghệ Việt Nam Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật Nguyễn Minh Tâm ảnh hởng của sự phân cắt nơi sống đến tính đa dạng di truyền của một số loài tuế (Cycas, Cycadaceae) ở Việt Nam Chuyên ngành: Sinh thái học M số : 62.42.60.01 Tóm tắt luận án tiến sĩ sinh học Hà Nội, 2007 Công trình đợc hoàn thành tại: Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật Ngời hớng dẫn khoa học: GS. TSKH. Trần Đình Lý PGS. TS. Nông Văn Hải Phản biện 1: Phản Biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nớc họp tại Vào hồi giờ ngày tháng năm 2007 Có thể tìm hiểu luận án tại th viện: - Th viện Quốc Gia - Th viện Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Th viện Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Những công trình của tác giả đ công bố liên quan đến luận án 1. Nguyen Minh Tam, To Van Vinh, Vu Thi Ha Giang, Nguyen Thi Phuong Trang, Nguyen Tien Hiep, Ludwig Triest (2003), Population genetics of Cycas chevalieri and Cycas simplicipinna in tropical forests of Vietnam, Tạp chí Công nghệ Sinh học (J. Biotechnology), 1(4), pp. 503-518. 2. Nguyễn Minh Tâm, Nguyễn Thị Phơng Trang, Nguyễn Tiến Hiệp, Trần Đình Lý, Ludwig Triest (2005), Đánh giá đa dạng di truyền quần thể Tuế Cycas dolichophylla (Cycadaceae), Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(1), tr. 79-88. 3. Nguyễn Minh Tâm, Lê Xuân Cảnh, Đặng Tất Thế, Nông Văn Hải (2005), "Nghiên cứu đa dạng di truyền phục vụ công tác bảo tồn và duy trì tiến hoá loài quí hiếm ở Việt Nam, Hội nghị Khoa học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam,3, tr. 25-32. 4. Nguyen Minh Tam (2006), Conservation of genetic diversity in threatened cycads (Cycadaceae) of Vietnam, Advances in Natural Sciences, 7(1&2), pp. 121-129. 5. Nguyen Minh Tam, Nguyen Thi Phuong Trang, Vu Thi Ha Giang, L. Triest (2006), Effects of habitat fragmentation on genetic diversity in Cycas balansae (Cycadaceae), AJSTD, 23(3), pp. 193- 205. 6. Nguyễn Minh Tâm, Nguyễn Thị Phơng Trang, Nguyễn Tiến Hiệp, Trần Đình Lý, Nông Văn Hải (2006), Mối quan hệ di truyền của 2 loài Tuế (Cycas simplicipinna và C. chevalieri, Cycadaceae) trên cơ sở xác định trình tự nucleotide của vùng ITS1-rDNA, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 4(4), tr. 495-506. 1 A. giới thiệu chung luận án 1. Tính cấp bách của luận án Các mảnh rừng còn sót lại hiện nay là hệ quả của sự phân cắt và thờng bị giới hạn về kích thớc và suy giảm. Các mảnh rừng này chứa đựng những quần thể nhỏ và bị cô lập bởi khoảng cách lớn. Các quần thể nhỏ dễ bị tổn thơng và ít có khả năng thích nghi môi trờng sống thay đổi do cấu trúc hữu hiệu đợc thiết lập trong quá trình hình thành loài và quần thể bị phá vỡ. Các nghiên cứu đ chỉ ra rằng sự phân cắt nơi sống làm mất tính đa dạng di truyền liên qua đến quá trình thụ phấn cận non (Ellstrand và Elam, 1993). Nh vậy, duy trì tính đa dạng di truyền cao ở mức độ loài và quần thể đợc xem nh là nhiệm vụ u tiên trong công tác bảo tồn loài (Narain, 2000). Để đánh giá ảnh hởng của sự phân cắt nơi sống, điều tra tính đa dạng di truyền và sinh thái ở cả 2 mức độ loài và quần thể có vai trò rất quan trọng góp phần đa ra chiến lợc và các giải pháp bảo tồn loài hữu hiệu. Các nhà Thực vật đ chỉ ra rằng các loài Tuế ở Việt Nam đang bị đe dọa ở các mức độ khác nhau (Hill et al., 2004). Nơi sống của nhiều loài Tuế đang bị mất hoặc suy giảm nghiêm trọng, mặc dù, một số ít quần thể nhỏ của một số loài đ đợc quản lý trong khu bảo vệ, chúng vẫn đang trong tình trạng bị đe dọa. Hơn nữa, các loài này là đối tợng khai thác không hợp lý để làm cây cảnh hoặc làm thuốc đ làm tăng nguy cơ tuyệt chủng. Nh vậy, để bảo tồn hữu hiệu các loài Tuế ở Việt Nam, luận án sẽ cung cấp các thông tin về đa dạng di truyền ở cả 2 mức độ loài và quần thể. 2 2. Mục đích của luận án - Đánh giá hiện trạng quần thể (phân bố, kích thớc và nơi sống) của 4 loài Tuế Cycas dolichophylla, C. balansae, C. simplicipinna và C. chevalieri ở Việt Nam. - Đánh giá đa dạng di truyền ở cả 2 mức độ quần thể và loài Tuế bằng phơng pháp điện di enzym trên cơ sở phân tích các thông số di truyền quần thể. Mối quan hệ giữa các quần thể trong mỗi loài về mặt di truyền và các yếu tố làm giảm tính đa dạng di truyền cũng đợc phân tích. - Xác định vị trí phân loại trên cơ sở xác định trình tự nucleotide của vùng ITS1-rADN của 2 loài Tuế C. Simplicipinna và C. chevalieri. Kết quả này cho phép chúng tôi hiểu biết rõ hơn về mức độ tiến hoá phân tử của một số loài Tuế. Kết quả nghiên cứu đ đề xuất các biện pháp hữu hiệu để bảo tồn loài thực vật, đặc biệt các loài đang bị đe doạ tuyệt chủng cao ở Việt Nam. 3. Những đóng góp mới của luận án - Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu mức độ quần thể và loài quý hiếm ở Việt Nam trên cơ sở kỹ thuật enzym và sử dụng các phần mềm chuyên dụng để phân tích các thông số về di truyền quần thể và loài. - Kết quả nghiên cứu đ xác định vị trí phân loại loài trên cơ sở giải m nucleotide của vùng ITS1 của 2 loài C. simplicipinna và C. chevalieri. - Kết quả nghiên cứu đ xác định các nguyên nhân làm suy giảm nguồn gen của các loài thực vật quý hiếm và đa ra các giải pháp bảo tồn và phục hồi hữu hiệu loài. 3 - Kết quả nghiên cứu sẽ nâng cao nhận thức cho các nhà quản lý trên quan điểm di truyền quần thể để đa ra các biện pháp hữu hiệu bảo tồn loài Tuế, cũng nh áp dụng cho các loài thực vật quý hiếm đang bị đe dọa ở Việt Nam. 4. ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Luận án cho phép các nhà khoa học hiểu biết rõ hơn về sự tuyệt chủng và mức độ tiến hoá phân tử loài không chỉ cho các loài Tuế mà còn áp dụng cho các loài quý hiếm khác ở Việt Nam. - Luận án cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhật thông tin về giá trị bảo tồn và nâng cao sự hiểu biết của ngời dân sống gần rừng về sự tuyệt chủng loài cần bảo vệ. Nh vậy, luận án đóng góp cho công tác bảo tồn và quản lý hữu hiệu nguồn gen của các loài thực vật quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng, nâng cao hiểu biết rõ hơn về phơng thức sinh sản và mức độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể Tuế và thu thập thông tin về ảnh hởng của ngời dân địa phơng đến tính đa dạng di truyền. 5. Cơ sở dẫn liệu Luận án đợc xây dựng trên cơ sở dẫn liệu thực tế của tác giả thực hiện đề án RE-VNM-03: Đánh giá ảnh hởng của sự phân cắt nơi sống đến sự tuyệt chủng của các loài Tuế (Cycas, Cycadaceae) ở Việt Nam, đợc tài trợ bởi EC thông qua ARCBC. Tôi đ thu thập đợc 408 mẫu lá cây thuộc 16 quần thể (4 loài Tuế Cycas dolichophylla, C. balansae, C. chevalieri và C. simplicipinna) thuộc các 7 tỉnh Tuyên Quang, Quảng Ninh, Hòa Bình, Ninh Bình, Thanh Hóa, Hà Tĩnh và Quảng Trị. Tại mỗi địa điểm khảo sát, tôi thu thập các thông tin về đặc điểm sinh học sinh thái quần thể, điều kiện tự 4 nhiên và kinh tế x hội liên quan đến các loài Tuế nghiên cứu. Công việc thực nghiệm đợc thực hiện tại phòng Sinh học phân tử (Viện Sinh thái và Tài ngyên Sinh vật). Các kết quả nghiên cứu đợc phân tích theo phần mềm chuyên dụng FSTAT, TFPGA, MEGA và một số phần mềm khác. 6. Bố cục luận án Luận án gồm 151 trang in, trong đó phần mở đầu 4 trang, tổng quan tài liệu 35 trang, địa điểm và phơng pháp nghiên cứu 18 trang, kết quả và thảo luận 68 trang, và kết luận và kiến nghị 2 trang với 16 bảng, 19 hình và 260 tài liệu tham khảo. Luận án đợc hoàn thành tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, đợc sự hớng dẫn của giáo s Tiến sĩ khoa học Trần Đình Lý và Phó Giáo s Tiến sĩ Tiến sĩ Nông Văn Hải. B. Nội dung luận án Chơng 1. Tổng quan tài liệu Nhiều nghiên cứu đ đề cập đến mức độ suy giảm tính đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể thực vật liên quan đến quá trình phân cắt nơi sống (Lande, 1999; Jorge và Juan, 2001; Keller và Waller, 2002; Bahulikar et al., 2004). Các tác giả đ chỉ ra rằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra liên quan đến số lợng cá thể rất thấp trong quần thể. Hệ số thụ phấn cận non cao là yếu tố làm suy giảm tính đa dạng di truyền. Phân cắt nơi sống có thể hạn chế mức độ trao đổi di truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác nhau giữa chúng. 5 Một trong những hậu quả của quần thể nhỏ và cô lập là xuất hiện mối quan hệ cận non giữa các cá thể trong quần thể (Lande, 1999). ảnh hởng này có thể làm mất tính đa dạng di truyền nếu tần số và cờng độ quan hệ cận non cao và cuối cùng giảm khả năng thích nghi của quần thể trong điều kiện môi trờng biến đổi và tăng khả năng nhạy cảm đối với dịch bệnh (Bijlsma et al., 2000). Sự phiêu bạt di truyền trong quần thể nhỏ và cô lập thờng làm tăng khả năng tuyệt chủng cục bộ của loài (Lande, 1999; Keller v Waller, 2002). Hamrick và Godt (1989) đ tập hợp t liệu của 449 loài thực vật thuộc 165 chi và so sánh mức độ đa dạng di truyền giữa các nhóm loài khác nhau về đặc điểm sinh thái nh dạng sống, phân bố, vị trí phân loại, phơng thức sinh sản, cơ chế phát tán hạt và mức độ thành công của loài qua các thời kỳ địa chất. Mức độ trung bình của lô cút đa hình và đa dạng di truyền trên cơ sở của 473 loài thực vật là 50% và 0.149, tơng ứng (Hamrick et al., 1991). Loài phân bố rộng duy trì hệ số đa dạng di truyền cao gấp đôi so với loài đặc hữu. Các loài có đặc điểm sinh thái nh chu kỳ sống dài (lâu năm), sinh sản hữu tính và phát tán hạt nhờ động vật duy trì tính đa dạng di truyền cao hơn các loài với đặc điểm sinh thái khác. Đối với quần thể, giá trị trung bình của hệ số đa dạng di truyền và lô cút đa hình là 0,113 và 34%, tơng ứng. Mức độ di truyền cao đợc duy trì đối với quần thể của loài thụ phấn nhờ động vật (côn trùng). Tuy nhiên, có sự khác nhau đáng kể về giá trị đa dạng di truyền giữa các quần thể ở các loài khác nhau. Loài tự thụ phấn duy trì hệ số đa dạng di truyền cao giữa các quần thể trong loài. Nhiều công trình điều tra vào các năm tiếp theo về tính đa dạng di truyền đ khẳng định kết quả đánh giá trên (Young et al., 2002; Mattner et al., 2002; Giang et al., 2003). Đa dạng di truyền là điều kiện cần thiết để duy trì sự tồn tại của loài trong môi trờng sống, bởi vì nó cho phép cá thể thuộc các thế hệ hiện tại và tơng lai đều thích nghi với điều kiện môi trờng sống 6 của chúng. Đa dạng di truyền quần thể đợc xác định bởi 4 yếu tố: Chọn lọc tự nhiên, biến di, phiêu bạt và trao đổi di truyền. Trao đổi di truyền đợc thực hiện giữa các quần thể với nhau và tính biến di di truyền sẽ làm tăng mức độ đa dạng di truyền quần thể (Maria et al., 2003). Nh vậy, di truyền quần thể khác nhau và phụ thuộc vào mức độ đóng góp của mỗi yếu tố. Trong quần thể nhỏ và cô lập, giá trị phiêu bạt di truyền và thụ phấn cận non sẽ ảnh hởng phổ biến đến tính đa dạng di truyền. Các yếu tố này ảnh hởng phổ biến trong kích thớc quần thể sinh sản (Tero et al., 2002; Wilson và Provan, 2003; Bahulikar et al., 2004). Đ có một số công trình nghiên cứu về mức độ đa dạng di truyền của một số loài Tuế. Mức độ đa dạng di truyền đ đợc xác định thấp trong các quần thể và cao giữa các quần thể của mỗi loài Tuế (Ellstrand et al., 1990; Byrne và James, 1991; Yang và Meerow, 1996; Gonzalez-Astorga et al., 2003; Xiao et al., 2004, Jianguang et al., 2005). Kết quả phản ánh mức độ suy giảm tính đa dạng ở mức độ quần thể và loài Tuế liên quan đến sự hạn chế về dẫy phân bố địa lý, kích thớc quần thể nhỏ và mức độ cô lập của chúng. Chơng 2. Địa điểm và phơng pháp nghiên cứu 2.1 Địa điểm nghiên cứu Bốn loài Tuế Cycas balansae, C. dolichophylla, C. simplicipinna và C. chevalieri (Cycadaceae) đ đợc nghiên cứu tại Tuyên Quang, Ninh Bình, Hoà Bình, Hà Nam, Quảng Ninh, Thanh Hoá, Hà Tĩnh, Quảng Trị (Hình 2). Đây là những khu vực còn tồn tại loài Tuế trong rừng tự nhiên. Về mặt địa hình, khu vực nghiên cứu gồm các thung lũng tơng đối bằng phẳng với các đồi núi thấp dới 500 m so với mặt biển. Có 2 loại đất, đất đỏ màu mỡ chứa sắt và đất nâu trên đá granite hoặc đá phiến. 7 Hình 2. Địa điểm nghiên cứu 4 loài Tuế Cycas dolichophylla, C. balansae, C. simplicipinna và C. chevalieri: DNC: Nậm Chang, DBC: Bản Chủ, DCP: Cúc Phơng, DBE: Bến En, BTD: Tân Dân, BYT: Yên Tử, BPT: Phú Thành, BBS: Ba Sao, BDT: Đồng Tâm, BCP: Yên Quang, CKN: Khe Nậm, CNS: Nớc Sốt, CSK: Sơn Kim, STH: Tân Hợp, SDR: Đắc Krông và STT: Tân Thành Khí hậu vùng nghiên cứu đợc phản ánh bởi đặc điểm địa hình với độ ẩm và lợng ma cao. Lạnh và khô vào mùa đông, nóng và ẩm vào mùa hè. Nhiệt độ trung bình hàng năm là 23,3 o C ở Cúc Phơng và Bến En. Giá trị này là 23,7 o C, 22,3 o C và 27,8 o C ở Hơng Sơn, Hớng Hoá và Na Hang, tơng ứng (Vân, et al., 2000). Lợng ma trung bình hàng năm dao động từ 1710,8 mm ở Yên Tử đến 2386 mm ở Hơng Sơn và tập trung chủ yếu vào các tháng mùa hè với độ ẩm trên 80%. 8 2.2 Khảo sát ngoài thực địa Kích thớc quần thể Tuế của 4 loài nghiên cứu là rất nhỏ, do đó các thông số hình thái ngoài trong mỗi quần thể nghiên cứu đợc xác định trực tiếp tại hiện trờng. Nơi sống của mỗi quần thể cũng đợc mô tả bao gồm kiểu thảm thực vật, cấu trúc phân tầng của thảm thực vật. Loài thực vật đặc trng cho mỗi kiểu thực vật. Các đặc trng về đặc điểm khí hậu và loài đất cũng đợc ghi nhận. Ngoài ra, tại thực địa ngời dân địa phơng cũng đợc phỏng vấn về nghề nghiệp, thu nhập và nhận thức bảo tồn loài quý hiếm đang bị đe doạ tại khu vực nghiên cứu. Vị trí nghiên cứu đợc xác định trên cơ sở bản đồ địa hình tỉ lệ 1:50.000 và định vị khu vực nghiên cứu bằng máy định vị GPS. Để phân tích tính đa dạng di truyền cả hai mức độ quần thể và loài, 408 mẫu lá non thuộc 4 loài Tuế nghiên cứu đ đợc thu thập. Mẫu đợc đánh số, gói trong giấy bạc và đợc bảo quản trong hộp CO2 nén ở nhiệt độ âm 70 o C tại hiện trờng và sau đó chuyển ngay về phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử và đặt trong tử lạnh sâu -80 o C cho đến khi mẫu đợc lấy ra để phân tích isozym. 2.3 Điện di enzym Điện di đợc thực hiện trên bản gel polyacrylamide đứng với hệ thống dung dịch đệm theo Triest (1989). 12 enzym đ đợc nghiên cứu, trong đó 6 enzym có kết quả rõ ràng và đợc sử dụng để phân tích đa dạng di truyền quần thể, bao gồm Isocitrate dehydrogenase (IDH), Shikimate dehydrogenase (SKDH), Aspartate aminotransferase (GOT), 6-P-Gluconate dehydrogenase (6PGDH), -Esterase (-EST), Leucine aminopeptidase (LAP). 9 2.4 Kỹ thuật ADN Tách chiết ADN tổng số từ lá non của 2 loài Tuế C. chevalieri và C. simplicipinna thu đợc ở Hơng Sơn và Hớng Hoá theo phơng pháp của Xavier và Karine (2000). Cặp mồi đợc thiết kế dựa trên trình tự nucleotide các vùng rADN (đoạn cuối 18S, ITS1, 5.8S, ITS2 và đoạn đầu 26S) thuộc Cycas multipinna đ đợc lu trữ trong GenBank. Nhân bản đợc tiến hành trên máy PCR-Thermal Cycler. Vùng ADN quan tâm sau khi nhân bản đợc tinh sạch bằng QIAGEN Extraction Kit, sau đó đợc tiến hành nối ghép vào véc tơ tách dòng PCR TM 2.1. Sản phẩm PCR sau khi nối vào trong véc tơ tách dòng sẽ đợc tiến hành biến nạp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5. Tiếp theo, plasmid tái tổ hợp đợc chọn lọc trên môi trờng nuôi cấy có chứa X-gal và ampicilline. ADN plasmid mang véc tơ tái tổ hợp đợc tinh sạch và đọc trình tự nucleotide vùng rADN với mồi xuôi hoặc ngợc (M13 forward và M13 reverse) trên máy 3100-Avant Genetic Analyser với kít của hng Applied Biosystems tại Viện Công nghệ Sinh học. Trình tự nucleotide của ITS1-rADN có kết quả rõ ràng đợc sử dụng để phân tích cây phát sinh phả hệ giữa các loài Tuế. Tất cả các hoá chất sử dụng trong phân tích phân tử đợc mua từ hng Sigma, Invitrogen và Pharmacia (Mỹ). 2.5 Phân tích số liệu Tất cả các thông số các thông số quan trọng trong nghiên cứu di truyền quần thể đợc tính toán và phân tích bằng phần mềm FSTAT và TFPGA (Goudet, 1995; Millier, 1997). Giá trị trao đổi di truyền giữa các quần thể (Nm) đợc xác định theo công thức: Nm = (1- Fst)/4Fst. Phân tích trình tự nucleotide vùng ITS1-rADN, phần mềm ClustalW (Thompson et al., 1994), và GenDoc (Nicholas và 10 Nicholas, 1997) đợc sử dụng để so sánh sự khác nhau về số nuleotide của vùng ITS-rADN. MEGA3 dùng để phân tích số liệu. Chơng3. Kết quả và thảo luận 3.1 Cấu trúc quần thể và nơi sống của 4 loài Tuế Nơi sống của 4 loài Tuế C. dolichophylla, C. balansae, C. simplicipinna và C. chevalieri rất đa dạng, bao gồm các thảm thực vật trên đồi núi thấp nh ở Đồng Tâm, Ba Sao, Phú Thành, Đắc Krông và Tân Hợp, mà ở đó rừng nguyên sinh bị tổn thơng rất nặng hoặc phá huỷ hoàn toàn, đất bị xói mòn đến khu rừng thứ sinh ở Bến En, Bản Chủ và Hơng Sơn và rừng nguyên sinh đang phục hồi ở Bống và Nậm Chang. Tuế cũng tồn tại trong khu vực đất nông nghiệp ở Tân Thành và rừng trồng Thông ở Tân Dân. Tác động của con ngời trong nhiều năm từ cuối những năm 1970 và đầu những năm 1980 lên thảm thực vật ban đầu đ tạo ra nhiều thay đổi về nơi sống của chúng. Nh vậy, Tuế đợc ghi nhận trong nhiều mảnh rừng thứ sinh bao gồm cả trong khu bảo vệ. Tổng số cá thể là nhỏ trong tất cả các đợt khảo sát thực địa tại các khu vực nghiên cứu. Số lợng trung bình 25 cá thể (3-37) cho mỗi quần thể đối với C. dolichophylla; 58,8 (25-87) - C. balansae; 28,7 (22-41) - C. simplicipinna; 26,7 (23-33) - C. chevalieri. Tuế trong mỗi quần thể nghiên cứu phân bố tản mạn hoặc thành những cụm nhỏ. Phần lớn các cá thể của 4 loài Tuế nghiên cứu đều phân bố ở tầng cây bụi với độ che phủ cao. Dẫn liệu về cấu trúc tuổi trong mỗi quần thể đ chỉ ra rằng số cá thể non đợc sản sinh từ các cá thể cái trởng thành là khác nhau và phụ thuộc vào điều kiện môi trờng và nơi sống của chúng. Tỉ lệ cá thể non đợc xác định là 35% ở Ba Sao đối với C. balansae. Giá trị này cao hơn đợc ghi nhận ở Tân Thanh (95,8%), và Cúc Phơng (70,27%) cho các loài C. simplicipinna và C. dolichophylla, tơng 11 ứng. Có sự khác nhau về một số đặc điểm hình thái ở mức độ quần thể cho 4 loài Tuế. Kết quả này có thể liên quan đến cấu trúc tuổi trong mỗi quần thể. Rất khó phân biệt giới tính của cá thể non, thậm trí cá thể trởng thành nếu không tham gia hoạt động sinh sản. Số lợng quan sát số cây đực hoặc cái trong mỗi quần thể là rất ít. Do sự tác động của con ngời lên nơi sống của Tuế và mức độ khai thác quá mức, những yếu tố này đ ảnh hởng đến cấu trúc quần thể Tuế. Sinh sản dinh dỡng cũng đ đợc phát hiện ở một số quần thể và thờng xuất hiện ở những cá thể bố hoặc mẹ bị chặt. Số cá thể sản sinh từ phơng thức này chiếm trung bình 6,7 (2 26) ở Tân Hợp. Đối với các loài khác tỉ lệ này thấp hơn. Rõ ràng, điều này sẽ ảnh hởng rất lớn đến phơng thức sinh sản trong mỗi quần thể Tuế. Trên cơ sở mức độ tơng đồng về một số đặc điểm hình thái trong mỗi quần thể tuế, phân tích PCA và UPGMA đ chỉ ra sự khác nhau giữa các quần thể cho mỗi loài Tuế đ đợc khảo sát. Một nhóm bao gồm 2 quần thể DBC và DCP. Chúng chỉ ra giá trị cao của chiều cao cây, nhng thấp về chiều rộng lá khi so sánh với 3 quần thể còn lại (DNC, DTY và DBE). 3.2 ảnh hởng phân cắt nơi sống đến đa dạng di truyền 48 vùng hoạt động của 6 enzym khác nhau cung cấp 11 lô cút của 4 loài Tuế Cycas dolichophylla, C. balansae, C. chevalieri và C. simplicipinna ở Việt Nam. Lô cút đa hình đều đợc tìm thấy ở cả 4 loài Tuế nghiên cứu, tuy nhiên mức độ khác nhau và phụ thuộc vào mỗi loài. Got-1 và 2 đều có 3 allen đợc tìm thấy ở C. simplicipinna, C. chevalieri và C. dolichophylla. Trong khi đó, ở C. balansae số allen đợc tìm thấy tại Got-1 và Got-2 là 3 và 2, tơng ứng. Số alen đợc xác định 5 ở lô cút 6pgdh, -est-3 và 4 cho C. balansae, -est-1 (C. simplicipinna), - est-1 và 2 (C. chevalieri) và Idh (C. dolichophylla); 4 alen ở lô cút 12 Idh, Lap-1 và 2, Skdh, -est-1 và 2 cho C. balansae. Lô cút ở tất cả các quần thể của 4 loài nghiên cứu đều là đa hình. Số lô cút và số alen tơng ứng ở mức độ quần thể và loài là khác nhau. 10 lô cút cho 88 cá thể từ 4 quần thể Cycas dolichophylla, 80 cá thể từ 3 quần thể C. chevalieri, 11 lô cút từ 152 cá thể từ 6 quần thể C. balansae và 9 lô cút từ 86 cá thể cho 3 quần thể C. simplicipinna ở Việt Nam đ đợc xác định với số alen là 36 cho loài C.dolichophylla và C. chevalieri, 43 và 32 cho loài C. balansae và C. simplicipinna, tơng ứng. Mỗi lô cút thờng duy trì 1 alen chiếm u thế và đặc trng cho mỗi loài, quần thể hoặc một nhóm cá thể nào đó. Alen phổ biến với tần số trên 80% xuất hiện ở một số quần thể của một số loài Tuế. Chẳng hạn, tần số này đợc tìm thấy ở alen C của Got-1 trong 3 quần thể BPT, BDT và BBS ở C. balansae; alen B của Got-2 ở BBS và alen A cũng lô cút này ở BYT. Không tìm thấy tần số trên 80% ở bất kỳ alen nào ở C. chevalieri. Alen hiếm với tần số dới 10% cũng đợc tìm thấy ở một số quần thể của 4 loài Tuế nghiên cứu. Giá trị alen trung bình cho mỗi lô cút (A), tỉ lệ phần trăm lô cút đa hình (P), hệ số gen dị hợp tử quan sát và kỳ vọng (Ho và He, tơng ứng) đ đợc tìm thấy cho mỗi loài và quần thể. Số alen đ đợc tìm thấy ở mức độ loài trung bình 3 cho mỗi lô cút ở mỗi loài C. dolichophylla, C. balansae, C. simplicipinna và C. chevalieri ở Việt Nam. Tuy nhiên, có sự khác nhau về số alen này nhng không đáng kể. Giá trị A đợc xác định là cao ở tất cả các quần thể của 4 loài nghiên cứu. Tuy nhiên, số alen thấp (dới 3.0) cũng đợc tìm thấy ở quần thể DBC, DCP (C. dolichophylla) và BYT (C. balansae). Giá trị A cao nhất (4,45 alen) đợc tìm thấy ở BCP (C. balansae). Giá trị P cao ở tất cả các quần thể của 4 loài (>80%). Giá trị Ho khác nhau giữa các loài Tuế và dao động từ 0,326 (C. dolichophylla) đến 0,403 13 (C. chevalieri). Trong khi đó, giá trị He dao động từ 0,571 (C. balansae) đến 0,598 (C. chevalieri). Ho và He cao nhất đợc tìm thấy ở C. chevalieri, với giá trị 0,403 và 0,598, tơng ứng. Dẫn liệu về sự phân bố genotyp đ chỉ ra rằng mức độ cao của gen đồng hợp tử cho các allen phổ biến nhất trong tất cả các quần thể. ở mức độ loài, giá trị này trung bình 41,8% (5,7% tại Skdh - 67,9% tại Got-1) cho C. dolichophylla; 32,6% (11,1% tại Lap-1 và 2 - 74,2% tại Got- 2) cho C. chevalieri; 35,9% (8,3% tại -est-1 - 85,1% tại Got-2) cho C. simplicipinna; 36,4% (6,1% tại -est-1 - 75,6% tại -est-2) cho C. balansae. ở mức độ quần thể, giá trị này cũng đợc xác định. Các giá trị Fis (hệ số cận non), Fit (hệ số sai khác trong quần thể) và Fst (hệ số sai khác giữa các quần thể trong loài) cũng đợc tìm thấy tại mỗi lô cút và chỉ ra mức độ thiết hụt gen dị hợp tử theo phơng trình Hardy-Weinberg. Giá trị Fis cho tất cả các quần thể, trung bình 0,469 (0,388 ở DBC - 0,490 ở DBE) cho C. dolichophylla; 0,343 (0,218 ở SDR - 0,404 ở STH) cho C. simplicipinna. Giá trị này là 0,306 (0,281 ở CKN - 0,401 ở CNS), 0,386 (0,244 ở BBS - 0,470 ở BYT) và 0,453 (0,388 ở DBC - 0,490 ở DBE) cho các loài C. chevalieri, C. balansae và C. dolichophylla, tơng ứng. Kết quả này chỉ ra ảnh hởng của mối quan hệ sinh sản cận non giữa các cá thể trong mỗi quần thể là rất lớn. Fit chỉ ra mức độ suy giảm gen dị hợp tử theo phơng trình Hardy-Weinberg là 52,2%, 43%, 35,9% và 30,8% đối với các loài C. dolichophylla, C. balansae, C. simplicipinna và C. chevalieri, tơng ứng. Tuy nhiên, có sự khác nhau về số lô cút duy trì giá trị dơng cao trong mỗi quần thể. Hệ số đa dạng di truyền đợc tính trên cơ sở khác nhau giữa các cá thể trong quần thể (Hs) hoặc trong loài (Ht) đ đợc xác định. Giá trị Hs trung bình 0,587 (0,484 tại Got-1 - 0,712 tại Idh) cho C. dolichophylla. Tơng tự, Hs trung bình 0,589 (0,226 tại Got-2 - 14 0,698 tại -est-1); 0,579 (0,371 tại -est-2 - 0,711 tại Skdh) cho C. simplicipinna và C. balansae, tơng ứng. Ht trung bình 0,621 (0,490 tại Got-1 - 0,732 tại Idh và -est-1), 0,697 (0,232 tại Got-2 - 0,719 tại -est-1), 0,619 (0,394 tại -est-2 - 0,743 tại -est-3) cho các loài C. dolichophylla, C. simplicipinna và C. balansae, tơng ứng. Giá trị Hs và Ht là tơng đơng nhau (0,604) cho loài C. chevalieri. Giá trị Dst và Gst chỉ ra sự khác nhau giữa các quần thể trong loài là thấp. Dst trung bình 0,009; 0,034 và 0,039 cho các loài C.simplicipinna, C.dolichophylla và C. balansae, tơng ứng. Tơng tự, Gst trung bình 0,015; 0,056 và 0,064 tơng ứng với các loài C. simplicipinna, C. dolichophylla và C. balansae. Giá trị Dst và Gst là 0 cho loài C. chevalieri. Mối quan hệ giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý là yếu, r 2 =0,154 và 3,93 cho 2 loài C. dolichophylla và C. balansae, tơng ứng. Sự khác nhau giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý của 2 loài này là không có ý nghĩa (p>0,05). Phân tích NJ (Neighbor Joining) trên cơ sở khoảng cách di truyền theo Nei (1972) đ tìm thấy mối quan hệ giữa các nhóm quần thể với nhau cho mỗi loài nghiên cứu (Hình 3.1). Quần thể DBC đợc tách riêng và chỉ ra mức độ cao của giá trị hệ số gen dị hợp tử quan sát và kỳ vọng ở C. dolichophylla. Tơng tự, 2 nhóm quần thể đợc tách biệt rõ ràng ở cả 3 loài C. balansae, C. simplicipinna và C. chevalieri. ở C. balansae, một nhớm gồm có 3 quần thể BPT, BDT và BBS. Cả 3 quần thể này đều duy trì mức độ gen dị hợp tử kỳ vọng thấp. Nhóm khác gồm có 3 quần thể còn lại và đều duy trì hệ số gen dị hợp tử kỳ vọng cao hơn, trung bình 0,599. Quần thể trồng BYTđợc tách ra từ nhóm này và có mức độ thấp hơn về gen dị hợp tử quan sát và kỳ vọng, Ho = 0,318 và He = 0,587, và số alen cho một lô cút thấp nhất (2,54). 15 Hình 3.1. Phân tích NJ trên cơ sở khoảng cách di truyền giữa các quần thể của 4 loài C. dolichophylla, C. balansae, C. simplicipinna và C. chevalieri theo công thức Nei (1972) Phân tích UPGMA trên cơ sở ma trận của genotyp cho mỗi cá thể trong các quần thể theo công thức Roger (1972) cũng d chỉ ra mối quan hệ giữa các cá thể trong quần thể. Dẫn liệu thu thập đợc đ chỉ ra mức độ cao của lô cút đơn hình cho mỗi nhóm cá thể. Dẫn liệu này đ phản ánh mối quan hệ cận non trong mỗi nhóm cá thể trong quần thể và chúng có quan hệ gần gũi về không gian địa lý. Tất cả các kết quả trình bày ở trên đ chỉ ra rằng tính đa dạng di truyền cao ở cả 2 mức quần thể và loài của 4 loài Tuế. Điều này có thể phản ánh đặc điểm sinh học sinh thái và đặc điểm lịch sử tồn tại của các loài. 4 loài Tuế nghiên cứu đều duy trì mức độ cao về tính đa dạng di truyền khi so sánh với một số loài khác có cùng phơng thức sinh sản. Ví dụ, Picea abies duy trì A = 5,3; P =76,4%; Hs = 0,408 và Ht = 0,420 (Lundkvist 1979), loài Pinus longoeva: 2,64; 94,5%; 0,465 và 0,484, tơng ứng (Hichert và Hamrick, 1983). Tuy nhiên, CSK CKN CNS 0 .00 5 DBE DCP DNC DBC 0 . 0 2 BDT BBS BPT BYT BCP BTD 0 . 05 SDR STH STT 0 .0 1 16 mức độ thấp cũng đợc tìm thấy ở một số loài Tuế. Cycas debaoensis: 57,4% và 0,215 (Jianguang et al., 2005), C. seemannii: 50% và 0,138 (Keppel et al.,2002), C. guizhouensis: 35,9% và 0,108 (Xiao et al., 2004), C. siamensis: 58,9% và 0,134 (Yang and Meerow, 1996), Dioon edule: 54,78% và 0,240 (Gonzalez-Astorga et al., 2003), Macrozamia riedlei: 93% và 0,274 (Byne and James, 1991) và Zamia pumila: 16,7% và 0,041 (Walters and Decker- Walters, 1991). Nói chung, các loài Tuế nghiên cứu đều duy trì mức độ đa dạng di truyền cao khi so sánh với các loài có phơng thức thụ phấn nhờ đồng vật (côn trùng) với các giá trị tơng ứng 3,37; 63,3%; 0,238 và 0,352, các loài thụ phấn nhờ gió: 3,29; 73,7%; 0,248 và 0,256, hoặc các loài duy trì cả 2 phơng thức sinh sản vô tính và hữu tính: 3,3; 73,2%; 0,257 và 0,325 (Hamrick, 1983). Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu phản ánh ngợc lại với một số kết quả khác khi nghiên cứu về một số loài Tuế trên thế giới. Mức độ đa dạng di truyền thấp và sự khác nhau di truyền giữa các quần thể cao. Chẳng hạn, phân tích lô cút enzym đ xác định Ht = 0,08 và Gst = 0,27 đối với Macrozamia communis (Ellstrand et al., 1990) và Ht = 0,049 và Gst 0,345 (Yang và Meerow, 1999) và Ht = 0,138 và Fst = 0,594 cho C. seemannii (Keppel et al., 2002). Kết quả tơng tự, khi phân tích lô cút ISSR cho loài C. guizhouensis (Ht = 0,108 và Gst = 0,432) bởi Xiao và cộng sự (2004). Nh vậy, kết quả nghiên cứu có thể phản ánh nguồn gốc tiến hoá của Tuế. Tuế tồn tại và phổ biến vào kỷ Mesozoic và sống trên 2500 năm. Tất cả các quần thể nghiên cứu đều chỉ ra mức độ gen dị hợp tử quan sát thấp hơn gen dị hợp tử kỳ vọng. Kết quả này phản ánh sự thiếu hụt lớn của gen dị hợp tử có thể liên quan đến mối quan hệ cận non giữa các cá thể trong mỗi quần thể (Fis > 0,2) hoặc do cấu trúc tuổi quần thể đợc sản sinh từ thế hệ bố mẹ. Do đặc điểm phân bố ở vùng núi đất thấp, các loài Tuế thờng xuyên bị tác động mạnh bởi [...]... đe doạ lo i v quần thể Tuế 1 - Mất nơi sống đợc xác định l yếu tố quan trọng dẫn đến l m suy giảm nhanh số lợng cá thể trong mỗi quần thể Tuế, đôi khi dẫn đến sự tuyệt chủng cục bộ của một số lo i Tuế Phá rừng l m nơng rẫy v hình th nh các khu dân c l hình thức phổ biến ở khu vực Tân Thanh, nơi sống của C simplicipinna, di n tích rừng gần khu dân c v dọc theo các con đờng dẫn đến khu dân c đều bị chặt... cứu đều duy trì mức độ đa dạng di truyền cao Một số yếu tố có thể đóng góp để duy trì tính đa dạng di truyền cao ở cả 2 mức độ quần thể v lo i, bao gồm phơng thức sinh sản hữu tính khác gốc, khả năng phát tán hạt phấn nhờ côn trùng v mức độ phức tạp về không gian nơi sống, kết hợp với chu kỳ sống lâu năm v tiềm năng đột biến Tuy nhiên, cả lo i 4 lo i Tuế nghiên cứu đều có hệ số sinh sản cận no n cao... nghiêm túc để nơi sống phù hợp cho sự tồn tại của các quần thể Tuế Khai thác Tuế phải đợc hạn chế v cấm Ng nh Bảo vệ rừng nên thiết lập các hợp đồng với ngời dân địa phơng về việc bảo tồn các quần thể Tuế v nơi sống của chúng Hợp đồng phải đợc thiết lập cho tất cả các mảnh rừng tự nhiên, m ở đó Tuế đang tồn tại - Bảo tồn chuyển vị các lo i Tuế cần phải đợc tiến h nh c ng sớm c ng tốt Đây l nơi bảo tồn... thụ phấn của Tuế Để đánh giá tầm quan trọng của yếu tố di truyền liên quan đến mức độ suy giảm quần thể của 4 lo i Tuế, chúng tôi đ tập trung nghiên cứu tác động của số lợng cá thể đến khả năng thụ phấn trong mỗi quần thể Không có số liệu về kích thớc quần thể của 4 lo i Tuế n y ở nớc ta v o các năm trớc Tuy nhiên, kết quả điều tra đ chỉ ra rằng cả 4 lo i Tuế đều suy giảm nghiêm trọng cả về số 19 20... cùng một lo i có thể phản ánh mức độ khác nhau về di truyền v môi trờng sống (Liengsin et al., 1998, Coates v Hamley, 1999, Lee, 2000) Liengsin v cộng sự (1998) đ giả thiết rằng mức độ khác nhau về giá trị thụ phấn chéo của 11 quần thể của lo i Pterocarpus macrocarpus liên quan đến mức độ suy giảm nơi sống, kích thớc v phân bố cây ra hoa trong mỗi quần thể Rõ r ng, đối với C dolichophylla, nơi sống của. .. thể Nơi sống của các quần thể Tuế nghiên cứu bị rối loại v suy giảm mạnh, đặc biệt ở những mảnh rừng thứ sinh v rừng trồng đ ảnh hởng rất lớn đến số lợng lo i v mật độ côn trùng thụ phấn với đặc điểm thích nghi cao dới tán rừng v tất nhiên cũng góp phần l m suy giảm hệ số thụ phấn chéo ở các quần thể nghiên cứu 21 3.4 Quan hệ giữa các lo i Tuế trên cơ sở giải mã vùng ITS1-rADN Trình tự nucleotide của. .. trong mỗi quần thể đợc tìm thấy ở quần thể Tân Dân, Khe Nậm v Tân Hợp Hệ số thụ phấn chéo (Tm) thờng cao ở nhóm cá thể trởng th nh v thấp ở nhóm cá thể non trong mỗi quần thể Tuế Giá trị Tm khác nhau ở mức độ quần thể Chẳng hạn, Tm ở nhóm cá thể trởng th nh dao động từ 0,375 ở quần thể Nậm Chang đến 0,449 ở Bến En cho C dolichophylla, từ 0,445 ở Yên Quang đến 0,682 ở Ba Sao cho C balansae Kết quả nhận...17 18 các hoạt động của con ngời Hậu quả, rừng tự nhiên, nơi ở của chúng bị tổn thơng nặng Cấu trúc rừng bị thay đổi Nói chung, thảm thực vật rừng, nơi tồn tại của các lo i Tuế đ bị biến đổi v đang đe doạ đến sự tồn tại của chúng Thêm v o đó, Tuế còn đợc thu thập với mục đích nh cây cảnh hoặc trang trí trong nh v o các ng y lễ v tết Tất cả các quần thể Tuế nghiên cứu đều có kích thớc rất... quần thể Đây l hậu quả nơi sống của chúng bị phân cắt v suy giảm mạnh v khai thác không hợp lý với các mục đích khác nhau v o cuối những năm 1980 v đầu những năm 1990 v vẫn còn tiếp di n v o các năm gần đây Kết quả n y thờng dẫn đến l m tăng nhanh của mối quan hệ cận no n giữa các cá thể trong quần thể Tuế Hơn nữa, số cá thể đợc sinh ra từ một cá bố hoặc mẹ bị đốn ngang (sinh sản dinh dỡng) l khá cao... Trình tự nucleotide của vùng ITS1 v một phần 18S v 5,8S-rADN của 2 lo i Tuế Cycas simplicipinna v C chevalieri ở Việt Nam đ đợc xác định Chiều d i vùng ITS1-rADN l 654bp v 700bp cho 2 lo i Tuế nghiên cứu C simplicipinna v C chevalieri, tơng ứng 7 lo i Tuế thuộc chi Cycas ở Trung Quốc đợc nghiên cứu bởi Chaw v cộng sự (2005), trung bình 682,8bp (670bp - 731bp Trong chi Tuế (Cycas), th nh phần G+C trung . nghệ Việt Nam Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật Nguyễn Minh Tâm ảnh hởng của sự phân cắt nơi sống đến tính đa dạng di truyền của một số loài tuế (Cycas, Cycadaceae) ở Việt Nam. liệu thực tế của tác giả thực hiện đề án RE-VNM-03: Đánh giá ảnh hởng của sự phân cắt nơi sống đến sự tuyệt chủng của các loài Tuế (Cycas, Cycadaceae) ở Việt Nam, đợc tài trợ bởi EC thông qua. các loài Tuế ở Việt Nam đang bị đe dọa ở các mức độ khác nhau (Hill et al., 2004). Nơi sống của nhiều loài Tuế đang bị mất hoặc suy giảm nghiêm trọng, mặc dù, một số ít quần thể nhỏ của một số