Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh địa phương [Vigna radiata (L.) Wilczek ]

Đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là một trong ba cây đậu đỗ chính trong nhóm các cây đậu ăn hạt, đứng sau đậu tương và lạc. Ngoài ra, nó còn là một trong những mặt hàng xuất khẩu. Đậu xanh cũng ch

MỞ ðẦU

I LÝ DO CHỌN ðỀ TÀI

ðậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là một trong ba cây ñậu ñỗ chính

trong nhóm các cây ñậu ăn hạt, ñứng sau ñậu tương và lạc Ngoài ra, nó còn là một trong những mặt hàng xuất khẩu ðậu xanh cũng chính là cây trồng có vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp của nhiều nước, trong ñó có Việt Nam

Trồng ñậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu ñạm, ñáp ứng nhu cầu về dinh dưỡng của con người và vật nuôi, mà còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng ñất do rễ của cây ñậu xanh có các nốt sần chứa một số loài vi sinh vật cố ñịnh ñạm sống cộng sinh

Vấn ñề ñặt ra là cần nghiên cứu chọn tạo các giống ñậu xanh có chất lượng tốt, phục vụ nhu cầu trong nước cũng như xuất khẩu Hiện nay, việc nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng nói chung và ñậu xanh nói riêng nhờ chỉ thị phân tử ñã và ñang ñược áp dụng rộng rãi Các nhà khoa học ñã sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử như RAPD, AFLP, RFLP, SSR…ñể xác ñịnh quan hệ di truyền của cây trồng nhằm tạo cơ sở khoa học cho công tác chọn tạo giống cây trồng Trên thế giới, kỹ thuật RAPD ñã ñược nhiều tác giả sử dụng ñể nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống ñậu xanh như: Afzal và ñtg (2004), Betal và ñtg (2004), Lakhanpaul và ñtg (2000) [25], [27], [37] Ở Việt Nam, kỹ thuật RAPD cũng ñã ñược các tác giả Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, ðiêu Thị Mai Hoa sử dụng ñể xác ñịnh quan hệ di truyền của các giống ñậu xanh ñột biến, các giống ñậu xanh chịu hạn, các giống chín tập trung và không tập trung ở ñậu xanh [4], [16], [21]

Nhằm tạo cơ sở cho việc lựa chọn giống ñậu xanh có chất lượng tốt

phục vụ công tác lai tạo giống, chúng tôi lựa chọn và tiến hành nghiên cứu ñề

tài: “Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống ñậu xanh ñịa

phương [Vigna radiata (L.) Wilczek ]”

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 14 giống ñậu xanh

3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Tách chiết DNA tổng số của 14 giống ñậu xanh

- Sử dụng kỹ thuật RAPD ñể xác ñịnh quan hệ di truyền của các giống ñậu xanh nghiên cứu

- Sử dụng phần mềm NTSYSpc version 2.0 ñể xử lý số liệu

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÂY đẬU XANH

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây ựậu xanh

Cây ựậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczeck) thuộc ngành

Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Fabales, họ Fabaceae, chi Vigna Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ đậu, bao gồm 7 chi phụ: Vigna, Haydonia, Plactropic, Macrhyncha, Ceratotropic, Lasiospron, Sigmaidotrotopis đậu xanh theo quan ựiểm lấy hạt của nhân dân ta bao gồm

các loài thuộc hai chi phụ là Ceratotropic, còn ựược gọi là nhóm ựậu châu Á, bao gồm 16 loài hoang dại và 5 loài trồng trọt là V radiata, V mungo, V

aconitifolia, V angularis, V umbellata [6], [14]

đậu xanh có bộ NST 2n = 22, là loại cây ăn hạt, thân thảo Theo Vavilov, ựậu xanh có nguồn gốc từ Ấn độ, ựược phân bố rộng rãi ở các nước

đông và Nam Á, khu vực đông Dương Dạng dại của V radiata cũng ựược

tìm thấy ở Madagasca, bên bờ Ấn độ Dương, đông Phi [16].

1.1.2 đặc ựiểm nông sinh học của cây ựậu xanh

đậu xanh là loại cây trồng cạn thu quả và hạt, bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt

Rễ ựậu xanh thuộc loại rễ cọc, bao gồm rễ cái và rễ con Rễ cái sâu khoảng 20 - 30 cm, có khi sâu tới 70 - 100 cm [6] Rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ biến ựổi thành, có vai trò tăng cường sức hút nước và các chất dinh dưỡng cho cây đặc biệt, do rễ ựậu xanh có khả năng sống cộng sinh với vi khuẩn cố

ựịnh ựạm Rhizobium nên từ các kẽ nhánh rễ, nhất là ở sát rễ cái hình thành

những nốt sần Các nốt sần có khả năng cố ựịnh nitơ, thường có kắch thước

4 - 5 mm, có màu ñỏ, hồng hay nâu Nốt sần bé hơn, dạng que, ruột màu xanh hoặc ñen Tuy nhiên, bộ rễ của cây ñậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây ñậu ñỗ khác nên khi gặp úng dễ bị thối[14], [16], [22]

Thân ñậu xanh thuộc loại thân thảo, mọc thẳng ñứng hoặc hơi nghiêng, thân yếu có lớp lông mịn màu nâu sáng, chiều cao trung bình từ 40 - 70 cm, ñường kính trung bình từ 8 - 12 mm Thân cây gồm 7 - 8 ñốt Thân phân cành muộn và trung bình có từ 2 - 5 cành, một số giống có tới 9, 10 cành tùy giống và ñiều kiện chăm sóc [14]

Lá thuộc lá kép, mọc cách, lá chét có 3 thùy với các hình dạng như hình ôvan, thuôn dài, lưỡi mác, chẻ thùy Trên thân chính của cây có 7 - 8 lá, cả 2 mặt trên và dưới của lá ñều có lông bao phủ Số lượng lá, kích thước và hình dạng lá có thể thay ñổi tùy giống, ñất trồng và thời vụ Diện tích của các lá tăng từ các lá phía dưới lên các lá giữa thân rồi giảm dần lên các lá phía ngọn Chỉ số diện tích lá (m2 lá/m2 ñất) có ảnh hưởng lớn ñến hiệu suất quang hợp và năng suất thu hoạch [10], [22]

Hoa ñậu xanh ñược hình thành trên các trục hoa Mỗi trục hoa có thể phát triển thành 2 hàng hoa mọc ñối nhau, các hoa trên hàng xếp liên tục với nhau tạo cho trục hoa có hình dạng co rút Hoa ñậu xanh là hoa lưỡng tính, mọc thành chùm trên trục hoa ðậu xanh là loại cây sinh trưởng vô hạn, hoa có màu tím hoặc vàng nhạt với công thức hoa là K5C5A10G1 ðậu xanh là loài thực vật tự thụ phấn cao, tỷ lệ hoa thành quả chỉ từ 10 - 25 % Thụ tinh xong, tràng hoa rụng, quả hình thành và phát triển [14]

Quả ñậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹt, dài từ 8 - 10 cm, ñường kính từ 4 - 6 mm, có 2 gân nổi rõ dọc theo 2 bên cạnh quả Quả chín có màu vàng, nâu hoặc màu ñen Cũng như các bộ phận khác ở cây ñậu xanh, trên vỏ quả ñậu xanh thường bao phủ một lớp lông dài khoảng 0,3 - 0,4 mm Những giống thuộc nhóm kháng virus gây bệnh khảm vàng và

sâu ñục quả thì mật ñộ lông khá dày, màu trắng Mỗi cây có từ 8 - 35 quả, mỗi quả có từ 8 - 15 hạt [16], [22]

Hạt ñậu xanh có hình trụ, thuôn, tròn ñều, có màu xanh bóng, xanh xám, vàng, xanh mốc, hoặc ñen xám… nằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp của quả Khối lượng hạt ñược biểu thị bằng g/1000 hạt và khối lượng nghìn hạt có thể dao ñộng từ 25 - 70 g Số hạt trên quả và khối lượng hạt có tương quan thuận với năng suất ðậu xanh là cây trồng ngắn ngày, trồng vào mùa ấm áp, nhiệt ñộ tối ưu cho cây sinh trưởng và phát triển từ 20 - 300C [11], [16]

1.1.3 Tầm quan trọng của cây ñậu xanh

Cây ñậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao Hạt ñậu xanh là nguồn thực phẩm giàu ñạm (khoảng 24 - 28%), ngoài ra, còn có lipid khoảng 1,3%, glucid 60,2% và các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K, P… cùng nhiều loại vitamin hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C,… Protein ñậu xanh chứa ñầy ñủ các amino acid không thay thế như leucine, isoleucine, lysine, methyonine, valine… Hạt ñậu xanh không chỉ phù hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị Hạt ñậu xanh ñược dùng ñể chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè, xôi ñỗ và một số ñồ uống… Lá non và ngọn của cây ñậu xanh có thể ñược dùng ñể làm rau, muối dưa Thân, lá xanh có thể dùng làm thức ăn cho vật nuôi[14], [22]

Ngoài ra, ñậu xanh còn có giá trị trong y học Theo sách “Nam dược thần hiệu” của danh y Tuệ Tĩnh và “Bản thảo cương mục” của Lý Thờ Trân thì vỏ hạt ñậu xanh có vị ngọt, tính mát, không ñộc nên có tác dụng giải nhiệt, giải bách ñộc [15]

Cây ñậu xanh có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng sinh trưởng mạnh, mỗi chu kỳ sinh trưởng kéo dài từ 60 - 90 ngày Mặt khác, yêu cầu kỹ thuật canh tác ñơn giản, vốn ñầu tư ít, thu hồi nhanh, có thể trồng nhiều vụ trong

một năm Do ñó, cây ñậu xanh có thể ñược trồng xen, trồng gối, luân canh trên nhiều loại ñất canh tác khác nhau[22].

Trồng cây ñậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng ñất Nhờ hệ

rễ ñậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium

có khả năng cố ñịnh nitơ từ khí trời, cung cấp một phần ñạm cho cây và ñể lại lượng ñạm ñáng kể trong ñất sau khi thu hoạch Vì vậy, ñất sau khi trồng ñậu xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [22]

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT ðẬU XANH 1.2.1 Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống ñậu xanh

Ngay từ khi con người biết trồng trọt thì các phương pháp chọn lọc khác nhau ñã ñược ứng dụng nhằm tạo ra những cây trồng theo ý muốn Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ñặc biệt trong lĩnh vực công nghệ sinh học, chọn giống cây trồng bằng phương pháp sinh học phân tử ñã ñem lại những kết quả ñáng tin cậy và thay thế dần cho phương pháp chọn giống cổ truyền Phương pháp chọn tạo giống cây trồng nhờ chỉ thị phân tử ñã ñược áp dụng bởi nó có ưu ñiểm là nhanh chóng ñánh giá ñược bộ gen của các giống cây trồng với ñộ chính xác cao Một hướng nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử trong chọn tạo giống ñậu xanh là việc xây dựng bản ñồ di truyền phân tử Gần ñây, nhiều bản ñồ di truyền phân tử ñã ñược công bố bao gồm các chỉ thị phân tử RFLP, RAPD và một số chỉ thị khác [16]

Hiện nay, công tác chọn tạo giống ñậu xanh trên thế giới ñược tiến hành theo một số hướng chính: tạo giống cho năng suất cao, tạo giống nâng cao chất lượng [6], tạo giống có khả năng chống chịu tốt, tạo giống có khả năng kháng sâu, bệnh hại [28], [34]

Cùng với việc áp dụng sinh học phân tử vào nghiên cứu ñậu xanh của các nước trên thế giới, ở Việt Nam bước ñầu cũng có nhiều ứng dụng và ñã thu ñược những kết quả khá quan trọng

Từ sau cách mạng tháng 8 - 1945, chúng ta ựã xây dựng ựược nhiều trạm nghiên cứu thắ nghiệm về ựậu ựỗ nói chung và về ựậu xanh nói riêng ở nhiều nơi khác nhau như ở định Tường (Thanh Hoá), Mai Nham (Vĩnh Phúc), Pú Nhung (Lai Châu), Thất Khê (Cao Bằng) và ựã tiến hành thu thập, chọn tạo ra nhiều giống mới với các ựặc tắnh ưu việt hơn trước

Từ những năm 1980 ựến nay, nước ta có thêm nhiều cơ sở nghiên cứu về ựậu xanh như: Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện cây lương thực thực phẩm, các trường đại học Nông nghiệp, đại học Khoa học Tự nhiên cùng nhiều cơ sở nghiên cứu khoa học khác Các trung tâm này ựã tập trung và ựi sâu vào hai hướng nghiên cứu cơ bản trong sản xuất ựậu ựỗ nói chung và ựậu xanh nói riêng là:

- Chọn tạo giống thắch hợp cho từng vùng sinh thái, từng mùa vụ khác nhau, giống có năng suất cao, phẩm chất tốt, có khả năng chống chịu ựiều kiện ngoại cảnh bất lợi, ựặc biệt là các giống có giá trị thương mại cao [17]

- đưa cây ựậu xanh vào hệ thống trồng trọt nhằm cải tiến hệ thống trồng ựộc canh hoá ở các vùng và cải tạo các vùng ựất bị thoái hoá [17]

Trong tương lai, với sự phát triển ngày càng mạnh của khoa học kỹ thuật, các loại cây trồng nói chung và cây ựậu xanh nói riêng sẽ còn ựược nghiên cứu kỹ hơn, sâu hơn ựể có thể ựáp ứng ựược nhu cầu sử dụng ựậu xanh ngày càng lớn của con người

1.2.2 Tình hình sản xuất ựậu xanh

Trên thế giới, tình hình sản xuất ựậu xanh ngày một tăng đặc biệt, trong những năm gần ựây, do nhu cầu của con người về dinh dưỡng protein thực vật tăng nhanh ựã làm thúc ựẩy việc sản xuất ựậu xanh trên thế giới phát triển mạnh Bangladesh, Ấn độ, Pakistan, Philipin, Srilanca, đài Loan, Thái Lan ựược coi là các trọng ựiểm về diện tắch, năng suất và sản lượng, là những cường quốc về ựậu xanh trên thế giới [14]

Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu Á ñã có một bộ sưu tập giống ñậu xanh với khoảng 6000 mẫu giống, trong ñó có những giống cho năng suất cao từ 18 - 25 tạ/ha Gần ñây, một số nước láng giềng của Việt Nam như Thái Lan, Philipin, Trung Quốc,… ñã chọn ra ñược những giống ñậu xanh cho năng suất từ 10 - 12 tạ/ha trở lên, hạt to, màu hạt ñẹp, thời gian sinh trưởng ngắn, chín tập trung, có sức chống chịu tốt với các ñiều kiện cực ñoan của môi trường [14], [24]

Tính ñến năm 2001, Ấn ðộ là nước ñứng ñầu thế giới trong việc sản xuất ñậu xanh với diện tích gần 2887000 ha (chiếm trên 70% diện tích ñậu xanh toàn cầu), sản lượng ñạt trên 1 triệu tấn, tiếp theo là Trung Quốc (diện tích 772000 ha, sản lượng 0,891 triệu tấn) Trung Quốc là nước có năng suất sản xuất ñậu xanh cao nhất, ñạt 1,15 tấn/ha Thái Lan là nước ñứng ñầu thế giới về xuất khẩu ñậu xanh, chiếm khoảng 40% sản lượng ñậu xanh xuất khẩu trên thế giới Những nước nhập nhiều ñậu xanh là Nhật Bản (80 tấn/năm), Hoa Kỳ (50 tấn/năm) (Nguồn : FAOSTAT 2002) [24]

Ở Việt Nam, cây ñậu xanh cũng ñược trồng từ lâu ñời ở các vùng ñồng bằng, trung du và miền núi trên khắp cả nước Tuy nhiên, nó vẫn chỉ ñược xem như một loại cây trồng phụ nhằm tận dụng ñất ñai, lao ñộng dư thừa,… Vì thế, năng suất sản xuất ñậu xanh còn chưa cao Từ năm 1991 - 1995 năng suất sản xuất ñậu xanh ñạt từ 5,5 tạ/ha ñến 12 tạ/ha Từ năm 1996 - 2000 năng suất dao ñộng trong khoảng 15 - 20 tạ/ha ðến năm 2000, Việt Nam có diện tích và sản lượng ñậu xanh ñứng thứ 6 trên thế giới [7], [8], [9], [10], [11]

1.3 NGHIÊN CỨU QUAN HỆ DI TRUYỀN Ở ðẬU XANH

1.3.1 Một số phương pháp sinh học phân tử trong phân tích quan hệ di truyền ở thực vật

1.3.1.1 Kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - ña hình các ñoạn DNA ñược khuếch ñại ngẫu nhiên) do William phát minh năm 1990,

Welsh và cộng sự hồn thiện năm 1991 Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính đa hình các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc sử dụng mồi đơn chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên [19] ðến nay, kỹ thuật này đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử Người ta đã sử dụng kỹ thuật này để thiết lập bản đồ di truyền, đánh giá hệ gen của giống và sự đa dạng di truyền của tập đồn giống [27], [53]

- ðoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi đĩ là một oligonucleotide cĩ trật tự nucleotide ngẫu nhiên và cĩ chiều dài 8 - 10 nucleotide (thường sử dụng mồi dài 10 nucleotide) Nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng RAPD thấp (320 - 400C) Nồng độ mồi phải thích hợp để đảm bảo kết quả phản ứng (phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp) tạo nên lượng sản phẩm cần thiết Nếu nồng độ mồi quá cao cĩ thể làm cho hiệu quả phản ứng kém chính xác, do mồi bám vào các vị trí khơng đặc hiệu Nếu nồng độ mồi quá thấp sẽ khơng đảm bảo đủ lượng sản phẩm RAPD Nồng độ mồi thích hợp để

tiến hành phản ứng thường là 0,1- 0,5 µM Mồi ñược thiết kế ñảm bảo các yêu cầu sau:

+ Trình tự mồi phải có tính ñặc hiệu cao, bắt cặp tuyệt ñối với ñầu mạch khuôn, không có cấu trúc “kẹp tóc”, giàu G và C (chiếm 60%)

+ Nhiệt ñộ gắn mồi thấp hơn nhiệt ñộ nóng chảy (Tm) của mồi từ 10 - 20C [1], [2], [19]

- Taq-polymerase: là một enzyme quan trọng, có vai trò quyết ñịnh ñến

phản ứng PCR ðây là loại enzyme chịu ñược nhiệt ñộ cao trong các loại enzyme ðặc ñiểm của chúng là có khả năng kéo dài mồi ñể tạo một sản phẩm

có chiều dài 8 - 13 kb Taq-polymerase ñược tách chiết từ chủng vi khuẩn ở suối nước nóng Thermus aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt ñộ biến

tính DNA (92o - 950C) Taq - polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt ñộ cao, tồn

tại ở nhiệt ñộ ủ 950C kéo dài Enzyme này có hoạt tính cao ở 720 - 800C làm cho phản ứng xảy ra nhanh, hiệu quả và chính xác [1], [19]

- dNTP: là các nucleotide tự do ñược sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng RAPD, gồm bốn loại: dATP, dTTP, dGTP, dCTP Nồng ñộ dNTP mỗi loại thường dùng trong các phản ứng RAPD khoảng 50 - 200 µM Nếu nồng ñộ các loại dNTP quá ít thì tạo sản phẩm ít không ñủ ñể phát hiện, ngược lại, nồng ñộ dNTP quá cao thì phản ứng khó thực hiện [1], [19]

- Dung dịch ñệm: là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng ñến chất lượng và hiệu quả của phản ứng Dung dịch ñệm của phản ứng phải ñảm bảo thành phần các chất cần thiết cho hoạt ñộng của enzyme như: MgCl2, KCl, Tris HCl

Thành phần của dung dịch ñệm của phản ứng bao gồm: Tris HCl 10mM (pH = 8.3 ở nhiệt ñộ phòng) KCl 50mM

MgCl2 1,5mM khi ủ ở nhiệt ñộ phòng

Nồng ñộ MgCl2 có thể dao ñộng từ 0,5 - 5mM Thành phần này ñóng vai trò quan trọng ñến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn [1], [5], [19]

* Chu kỳ phản ứng

Phản ứng RAPD ñược tiến hành qua các giai ñoạn sau:

- Giai ñoạn biến tính DNA: Ở nhiệt ñộ 950C trong 30 - 60 giây làm cho các liên kết hydro giữa 2 mạch bị ñứt Khi ñó DNA sợi ñôi tách thành 2 sợi ñơn tạo ñiều kiện cho sự bắt cặp mồi

- Giai ñoạn tiếp hợp mồi: Nhiệt ñộ hạ xuống 320 - 400C, mồi bám vào ñầu 3’OH của mạch khuôn DNA và bắt ñầu quá trình tổng hợp sợi mới

- Giai ñoạn tổng hợp: Nhiệt ñộ ñược nâng lên 720C thì các ñoạn mồi ñã

bắt cặp với các mạch ñơn sẽ ñược kéo dài với sự tham gia của Taq -

polymerase

Một chu kỳ trên xảy ra, 1 ñoạn DNA ñược nhân lên thành 2, các ñoạn DNA ñược nhân tiếp tục ñược coi là mạch khuôn ñể tổng hợp cho chu kì sau Vậy, sau n chu kỳ thì sẽ tạo ra 2n các ñoạn DNA giống hệt ñoạn DNA khuôn ban ñầu Phản ứng RAPD có thể thực hiện 40 - 45 chu kỳ

1.3.1.2 Kỹ thuật RFLP

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - ña hình ñộ dài các ñoạn cắt giới hạn) là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA hệ gen ở trình tự nhận biết ñặc trưng tạo ra hàng loạt ñoạn DNA có ñộ dài xác ñịnh, số lượng các ñoạn phụ thuộc vào số ñiểm nhận biết trong hệ gen Sử dụng kỹ thuật RFLP có thể xác ñịnh một tính trạng ở trạng thái ñồng hợp hoặc dị hợp trong một cá thể Vì vậy, RFLP là một chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược ñiểm là tốn kém và mất thời gian Kỹ thuật này ñòi hỏi phải có một lượng DNA lớn (50 - 200 ng từ mỗi cá thể) [13].Bằng kỹ thuật RFLP, Young và ñtg (1992) ñã thành công

trong việc lập bản ñồ kháng mọt ở ñậu xanh [54] Với kỹ thuật RFLP và RAPD, Lambrides C J và ñtg ñã lập ñược bản ñồ gen của ñậu xanh [38]

1.3.1.3 Kỹ thuật AFLP

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - ña hình ñộ dài các ñoạn ñược nhân bản chọn lọc) là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR Kỹ thuật này cho phép phát hiện một cách có chọn lọc các ñoạn DNA hệ gen ñã ñược cắt bởi enzyme giới hạn và gắn với ñoạn tiếp hợp

Về nguyên tắc, kỹ thuật AFLP tương tự như kỹ thuật RAPD, chỉ có ñiểm khác biệt là mồi trong phản ứng AFLP gồm hai phần: phần cố ñịnh dài khoảng 15 bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay ñổi dài khoảng 2 - 4 bp Sản phẩm PCR ñược ñiện di trên gel polyacrylamide có ñộ phân giải cao Sự ña hình ñược xác ñịnh bởi sự có mặt hay vắng mặt của một phân ñoạn DNA

Kỹ thuật AFLP có ưu ñiểm là phân tích ña hình di truyền trong khoảng thời gian ngắn, lượng DNA ñòi hỏi ít, cho sự ña hình cao Kỹ thuật này ñược ñánh giá là nhanh chóng và có hiệu quả trong việc xác ñịnh tính ña dạng di truyền ở cây trồng, như lúa, lạc…[49]

1.3.1.4 Kỹ thuật SSR

SSR (Simple Sequence Repeats - trình tự lặp lại ñơn giản) hay còn gọi là vi vệ tinh (microsatellites) Kỹ thuật này ñược Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của phản ứng PCR Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn tồn tại một loạt các trình tự nucleotide lặp lại, chúng ñặc trưng cho loài SSR gồm 2 - 5 nucleotide lặp lại nhiều lần Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của NST, như vùng tâm ñộng hoặc các ñầu mút Chúng giữ vai trò quan trọng trong việc ñiều hòa hoạt ñộng của các gen, góp phần làm tăng tính ổn ñịnh cơ học của NST trong các quá trình phân bào và có thể chứa ñựng những thông tin di truyền liên quan ñến sự xác

ñịnh giới tính ở cả ñộng vật và thực vật Do sự khác nhau về số lượng nucleotide trong mỗi ñơn vị lặp lại mà sự ña hình về ñộ dài của SSR ñược nhân bản sẽ ñược phát hiện sau quá trình ñiện di trên gel agarose hay polyacrylamide SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen và chọn giống cây trồng, do khả năng phát hiện tính ña hình rất cao Song chỉ thị này có nhược ñiểm là sự phức tạp trong thiết kế mồi và giá thành thiết kế mồi cao Trong thực tế, chỉ thị này ñã ñược sử dụng ñể nghiên cứu một số tính trạng liên quan ñến năng suất, bệnh hại, xác ñịnh giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản ñồ gen…[48] Nguyễn Vũ Thanh Thanh ñã sử dụng kỹ thuật SSR ñể nghiên cứu tính ña dạng di truyền của một số giống ñậu xanh chịu hạn khác nhau [21]

1.3.1.5 Bản ñồ QTL

Bản ñồ QTL (Quantitative Trait Loci - bản ñồ các locus tính trạng số lượng) xác ñịnh mối liên kết giữa các chỉ thị phân tử với một tính trạng hình thái ñang ñược quan tâm Qua bản ñồ QTL có thể xác ñịnh ñược những vùng trên NST có liên quan ñến một tính trạng hình thái ðể lập bản ñồ QTL, cần tiến hành:

- Xác ñịnh cặp lai

- Lai và tạo quần thể cho lập bản ñồ

- Theo dõi sự phân ly của các chỉ thị trong quần thể - Xử lý thống kê và lập bản ñồ

Lập bản ñồ QTL nhằm xác ñịnh vị trí, hiệu quả gen và hoạt ñộng của các locus liên quan trong tương tác gen và tương tác QTL với môi trường, từ ñó chọn lọc nhờ sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS - Marker Assisted Selection) Sholihin và ñtg (2002) ñã nghiên cứu lập bản ñồ QTL liên kết với tính chịu hạn ở ñậu xanh [49] Bản ñồ QTL liên quan tới khối lượng hạt ñậu xanh ñã ñược Humphry và ñtg (2005) mô tả [34]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu quan hệ di truyền ở cây ñậu xanh sử dụng kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD ñược sử dụng khá phổ biến trong phân tích và xác ñịnh mối quan hệ di truyền giữa các loài hay giữa các cá thể nhằm phục vụ công tác lai tạo, chọn giống hoặc phân loại thực vật

Ở Việt Nam, quan hệ di truyền ở cây ñậu xanh cũng ñã ñược nghiên cứu, tuy nhiên số lượng các nghiên cứu chưa nhiều Chu Hoàng Mậu (2001) sử dụng các mồi ngẫu nhiên ñể nghiên cứu sự ña hình DNA của các dòng ñậu xanh ñột biến so với giống gốc [16]

ðiêu Thị Mai Hoa (2006) cũng sử dụng kỹ thuật RAPD với 12 mồi ngẫu nhiên ñể xác ñịnh mức ñộ tương ñồng di truyền của 57 giống ñậu xanh có thời gian chín quả khác nhau, tạo cơ sở cho việc chọn giống có thời gian chín ngắn, chín tập trung Kết quả thu ñược 121 băng DNA nhân bản, trong số ñó có 88 băng (73%) thể hiện sự ña hình Từ ñây, thiết lập ñược cây phát sinh chủng loại [4]

Nguyễn Vũ Thanh Thanh ñã sử dụng kỹ thuật RAPD với 20 mồi ngẫu nhiên, trong ñó có 18 mồi thể hiện tính ña hình và kỹ thuật SSR với 10 mồi ngẫu nhiên ñể nghiên cứu sự ña dạng di truyền của các giống ñậu xanh có khả năng chịu hạn khác nhau Kết quả nhận ñược 79 phân ñoạn DNA với 18 mồi RAPD và 91 phân ñoạn với 10 mồi SSR Từ ñó thiết lập biểu ñồ hình cây xác ñịnh quan hệ di truyền của các giống ñậu xanh [21]

Trên thế giới, việc áp dụng kỹ thuật RAPD ñể nghiên cứu quan hệ di truyền có phần ña dạng hơn Năm 1998, Santalla M và ñtg nghiên cứu tính ña dạng di truyền ở cây ñậu xanh bằng kỹ thuật này với 60 mồi ngẫu nhiên Kết quả ñiện di cho thấy tổng số có 246 phân ñoạn DNA ñược khuếch ñại, trong ñó có 229 phân ñoạn thể hiện tính ña hình [47] Cũng trên ñậu xanh,

Saini A và đtg đã sử dụng các mồi ngắn (10 nucleotide) trong phản ứng RAPD và để đánh giá quan hệ di truyền của 46 giống đậu xanh [45]

Năm 2000, Lakhanpaul và đtg sử dụng kỹ thuật RAPD nhằm phân tích đa hình DNA của các giống đậu xanh Ấn ðộ Nhĩm tác giả sử dụng 21 mồi ngẫu nhiên và thu được 267 băng DNA, trong đĩ 64% là đa hình [37]

Betal và đtg (2004) đã sử dụng 14 giống đậu xanh cùng 14 mồi ngẫu nhiên để phân tích mối quan hệ di truyền nhờ kỹ thuật RAPD Kết quả cho thấy các giống cĩ năng suất cao cĩ liên quan chặt chẽ với tính trạng mùi thơm của hạt Kết quả nghiên cứu của tác giả cũng chỉ ra rằng tính trạng năng suất cĩ mối liên quan với đặc điểm hình thái như chiều cao cây, kích cỡ và màu sắc hạt [27]

Afzal và đtg (2004) nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đồn giống đậu xanh nhờ kỹ thuật RAPD Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng 21 giống đậu xanh với 34 mồi ngẫu nhiên kết quả thu được tổng số 204 phân đoạn DNA được nhân bản, trong đĩ cĩ 75% phân đoạn thể hiện tính đa hình Sự tương đồng di truyền nhận được trong nghiên cứu này cĩ thể được sử dụng để chọn dịng bố mẹ phục vụ mục đích chọn giống [25]

Năm 2006, Karuppanapandian T và đtg đã xác định quan hệ di truyền

của các giống đậu xanh (Vigna radiata L.) được lựa chọn từ những vùng khác

nhau ở Nam Tamil Nadu (Ấn ðộ) bằng kỹ thuật RAPD với 20 mồi ngẫu nhiên Kết quả thu được 200 đoạn gen khuếch đại khác nhau, trong đĩ cĩ 83% thể hiện sự đa hình [36]

* Ngồi ra, việc ứng dụng kỹ thuật RAPD để nghiên cứu quan hệ di truyền cũng đã được nhiều nhà khoa học khai thác cĩ hiệu quả trên nhiều đối tượng thực vật khác như: cà phê, ngơ, chè, lạc, lúa, các cây họ đậu…

Orozco C và đtg (1994) đã ứng dụng kỹ thuật RAPD để khảo sát mối quan hệ di truyền và tiến hĩa của các giống cà phê được lai tạo từ các lồi bố,

mẹ ở các vùng sinh thái khác nhau, làm cơ sở cho việc ghép cặp lai với mục ñích tạo con lai có ñặc ñiểm quý [41]

Trên ñối tượng là các cây họ ñậu, Doldi M L và ñtg (1997) sử dụng 33 mồi ngẫu nhiên ñể phân nhóm 18 giống ñậu tương có ñặc tính chín sớm Kết quả ñã phân nhóm ñược một số giống có hàm lượng protein cao, sử dụng cho chương trình nghiên cứu nhằm mục ñích nâng cao hàm lượng ñạm các giống ñậu tương thích nghi với ñiều kiện Châu Âu [30]

Ranade R và ñtg (2001) sử dụng 40 mồi ngẫu nhiên ñể nghiên cứu ñặc ñiểm của 12 giống ñậu ñen (black gram) Kết quả phân tích sản phẩm RAPD chỉ ra ñược một số băng ñặc hiệu tương ứng với các mồi ngẫu nhiên ñể phân biệt một số giống trong nhóm nghiên cứu [44]

Năm 2003, Jorge và ñtg ñã ñánh giá sự tương ñồng di truyền giữa các giống chè ở Hy Lạp nhờ kỹ thuật RAPD Họ sử dụng 25 mồi ngẫu nhiên ñể khuếch ñại các ñoạn DNA của 7 giống chè Kết quả cho 282 băng, trong ñó có 195 băng thể hiện tính ña hình Nghiên cứu cho thấy những giống chè ở Hy Lạp có thể hiện tính ña dạng di truyền [35]

Paulo S (2004) xác ñịnh mối quan hệ di truyền của 81 giống ngô (Zea

mays) ở phía Nam Brazil nhờ chỉ thị RAPD Trong nghiên cứu này, tác giả sử

dụng 32 mồi ngẫu nhiên và kết quả thu ñược 225 băng, trong ñó có 184 băng thể hiện tính ña hình (chiếm 72,2%) Từ kết quả này, cây phả hệ ñược thành lập bằng cách sử dụng phần mềm UPGMA Kết quả nghiên cứu này sẽ ñược sử dụng ñể chứng minh và duy trì nguồn gen từ ngô [42]

Dey N và ñtg (2005) nghiên cứu tính ña dạng di truyền của 38 dòng lúa thơm và 2 dòng ñối chứng Nhóm tác giả ñã tiến hành phản ứng RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên Kết quả khuếch ñại ñược 44 băng DNA, với kích thước từ 500 - 3500 bp Trong 44 băng có 41 băng thể hiện tính ña hình [29]

Subramanian V và ñtg (2006) ñã nghiên cứu tính ña hình DNA ở cây lạc nhờ kỹ thuật RAPD Nhóm tác giả ñã sử dụng 48 mồi ngẫu nhiên và xác ñịnh ñược 7 mồi (14,6%) ña hình Tổng số băng DNA ñược tạo ra từ 7 mồi ñó là 408 băng, trong ñó có 27 băng thể hiện tính ña hình [51]

Awan F S (2007) sử dụng kỹ thuật RAPD ñể xác ñịnh mối quan hệ di truyền của 7 giống lúa mì ở Pakistan (6 giống nhập nội và 1 giống khác) Kết quả có 112 băng DNA ñược tạo ra từ 15 mồi ngẫu nhiên, trong ñó có 50 băng thể hiện tính ña hình, mối tương ñồng di truyền là 86,2 - 93% ðiều này cho biết mối quan hệ gần gũi của các giống lúa mì này [26]

Venkata C L và ñtg (2007) ñã xác ñịnh tính ña hình DNA ở 21 giống chuối ở Nam Ấn ðộ nhờ chỉ thị RAPD và ISSR Phản ứng RAPD ñược thực hiện với 50 mồi và ISSR với 12 mồi Kết quả thu ñược 641 băng DNA, có kích thước 200 - 3100 bp, trong ñó có 382 băng thể hiện tính ña hình, tương ứng với 60% tính ña dạng sinh học [52]

Raghunathachari P và ñtg ñã xác ñịnh ñược sự ña dạng di truyền của 18 giống lúa nhờ kỹ thuật RAPD Họ sử dụng 10 mồi và thu ñược 144 băng DNA, trong ñó các băng thể hiện tính ña hình chiếm 95,1% [43]

Năm 2008, Trương Quang Vinh và ñtg ñánh giá sự ña hình DNA của một số giống khoai tây nhập nội và của Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD Kết quả, phân tích ña hình 8 giống khoai tây thu ñược 78 băng DNA, có kích thước từ 0,25 - 3 kb, ñược tạo ra từ 14 mồi ngẫu nhiên, ñã xác ñịnh có 11 mồi cho tính ña hình Hệ số sai khác di truyền giữa 8 giống khoai tây nghiên cứu từ 4,5 - 31,1% [23]

* Kỹ thuật RAPD không những ñược ứng dụng ở thực vật, mà hiện nay kỹ thuật này ñược ứng dụng trên nhiều ñối tượng khác nhau

Sử dụng kỹ thuật RAPD ñể ñánh giá dịch tả phân tử gữa các chủng V

cholerae: 25 chủng phân lập trong vụ dịch tả năm 2002 ở Việt Nam ñược chia

thành 5 dòng vi khuẩn tả khác nhau Phổ biến nhất là dòng vi khuẩn có kiểu mẫu RAPD giống với hai chủng chuẩn typ huyết thanh Inaba và Ogawa ñã

từng gây bệnh ở Việt Nam trước năm 2002 Kết quả chỉ ra rằng, chủng Vibrio

cholerae gây bệnh ở Việt Nam có quan hệ di truyền rất gần với các chủng gây

ñại dịch tả 6 và 7 dựa trên phân tích trình tự nucleotide của hai gen housekeeping mã hoá cho hemolysin (hlyA) và malat dehydrogenaza (mdh) [18]

Nguyễn Thị Thanh Bình và ñtg (2004) ñã phân tích tính ña dạng di truyền của 8 giống tằm dâu nuôi ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên Kết quả thu nhận ñược 67 băng DNA, trong ñó có 41 (61,2%) băng ña hình Kết quả phân tích NTSYS-SIMQUAL cho thấy các giống tằm nghiên cứu có mối tương ñồng di truyền trong khoảng 0,547 ñến 0,984 [3]

Bảng 2.1 ðặc ñiểm của 14 giống ñậu xanh nghiên cứu Ký

hiệu

Tên

giống Nguồn gốc

Khối lượng 1000 hạt (g)

Màu vỏ hạt

Sử dụng các hóa chất tinh khiết của các nước và các hãng nổi tiếng như

Taq-polymerase, buffer PCR của hãng Invitrogen, EDTA, Tris, Agarose,…

của ðức

2.2.2 Máy móc và thiết bị

Máy quang phổ UV-Visible Spectrometer (cintra 40) của Australia, cân ñiện tử của Thụy Sĩ, máy li tâm lạnh eppendorf của ðức, máy PCR-PTC100 (MJ Research) của Mĩ, bộ ñiện di DNA của hãng Bio - Rad, Mĩ và một số thiết bị khác

H7

2.2.3 ðịa ñiểm nghiên cứu

Các thí nghiệm ñược hoàn thành tại các phòng thí nghiệm: Phòng thí nghiệm Sinh học - Khoa Khoa học Tự nhiên và Xã hội - ðH Thái Nguyên, Phòng thí nghiệm Di truyền - Khoa Sinh - KTNN - Trường ðH Sư phạm - ðH Thái Nguyên, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Tách chiết DNA tổng số

Chúng tôi ñã tiến hành tách chiết DNA từ lá non của cây ñậu xanh theo phương pháp của Gawel et al [32] có cải tiến Quy trình tách chiết gồm các bước sau:

- Lấy 200 mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn

- Bổ xung 800 µl ñệm rửa (Tris HCl 1M, EDTA 0,5 M, pH = 8, Sorbitol 2M, NaH2PO4 0,4%, H2O), li tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi (bước này làm 2 lần)

- Thêm 700 µl ñệm tách (Tris HCl 1M, pH = 8, EDTA 0,5M, pH = 8, NaCl 5M, CTAB 4%, H2O), trộn nhẹ, ủ ở 650C trong khoảng 2 - 3 giờ, cứ sau 5 - 10 phút lấy ra lắc ñều 1 lần Lấy ra ñể ở nhiệt ñộ phòng trong 5 phút

- Thêm 600 µl chloroform : isoamin (24:1), trộn ñều trong 20 phút - Li tâm khoảng 13000vòng/phút trong 10 phút

- Hút 500 µl dịch trong ống sang ống 1,5 ml, bỏ tủa

- Thêm 500 µl isopropanol, mix nhẹ, ñặt lên ñá (ñể tủ lạnh qua ñêm) chờ có tủa trắng

- Li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô - Bổ sung 300 µl cồn 70%, búng nhẹ

- Li tâm 13000 vòng/phút trong 5phút, loại bỏ cồn (làm 2 lần) - Làm khô DNA

- Hòa tan DNA trong 30 µl H2O khử ion

2.3.2 ðịnh lượng và kiểm tra ñộ tinh sạch của DNA tổng số

Chúng tôi tiến hành ñịnh lượng và kiểm tra ñộ tinh sạch của DNA tách chiết ñược bằng 2 phương pháp

* Phương pháp ñiện di

ðiện di kiểm tra DNA tổng số của mẫu thí nghiệm trên gel agarose 0,8% (0,8 g agarose trong 100 ml dung dịch TAE 1X) Sản phẩm ñiện di ñược nhuộm bằng dung dịch ethydium bromide, soi và chụp ảnh dưới ánh sáng cực tím Dựa vào hình ảnh ñiện di có thể ñánh giá nồng ñộ và ñộ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm ñã tách chiết

* Phương pháp ño trên máy quang phổ

Nguyên tắc: Dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các base purin và pyrimidin Giá trị mật ñộ quang ở bước sóng 260 nm (A260) của các mẫu cho phép xác ñịnh hàm lượng acid nucleic trong mẫu dựa vào mối tương quan: một ñơn vị A260 tương ứng với nồng ñộ 50 ng/µl cho dung dịch chứa DNA sợi ñôi

Hàm lượng DNA (ng/µl) = A260 x 50 x hệ số pha loãng

ðể kiểm tra ñộ tinh sạch của mẫu DNA tách chiết ñược, chúng tôi tiến hành ño thêm giá trị mật ñộ quang ở bước sóng 280 nm (A280) ðộ tinh sạch ñược thể hiện ở tỷ số A260/A280 Một dung dịch acid nucleic ñược coi là sạch khi tỷ số A260/A280 dao ñộng trong khoảng 1,8 - 2,0

2.3.3 Phương pháp RAPD

Phương pháp RAPD ñược thực hiện theo mô tả của Foolad và ñtg (1995) [31] Chúng tôi tiến hành thí nghiệm với 5 mồi ngẫu nhiên có ñộ dài 10 nucleotide với kí hiệu là: RA31, RA32, RA40, RA143, RA159 Ký hiệu và trình tự của các mồi thể hiện ở bảng 3.2

Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của 5 mồi sử dụng trong phân tích RAPD STT Tên mồi Trình tự nucleotide

Chu trình nhiệt của phản ứng RAPD:

Các giai ñoạn Nhiệt ñộ (0 C) Thời gian

1 Biến tính 94 01 phút 2 Biến tính 92 30 giây 3 Gắn mồi 36 45 giây 4 Tổng hợp 72 01 phút 5 Hoàn tất tổng hợp 72 10 phút 6 Lưu giữ 4 ∞

STT Thành phần Thể tích (µµµl)

1 H2O 11,7 2 Buffer PCR 2,0 3 MgCl2 (25 mM) 2,0 4 dNTP (2,5 mM) 1,2 5 Mồi (10 µM) 1,6

6 Taq-polymerase 0,5

7 DNA (10 ng) 1,0

Tổng số 20