BÁO CÁO KHOA HỌC Tên ñề tài : Xác ñịnh sự ña dạng di truyền vùng D-loop trong ty thể (mtADN) của 4 giống gà nội Lê Thị Thúy 1 , Nguyễn Đăng Tôn 2 , Địch Thị Kim Hương 2 , Trần Thị Kim Anh 1 Vu Hai Chi 2 , Huynh Thi Thu Hue 2 , Nong Van Hai 2 1. Viện Chăn nuôi 2. Viện Công nghệ sinh học SUMMARY The mtDNA control region is highly variable and can be used reliably to estimate the extent of divergence between subspecies. In this study, we analyzed the mitochondrial D-loop region of four native Vietnamese chicken breeds, named as “Ri”, “Tre”, “Choi”, “Tau Vang”. The PCR product of about 1.3 kb of the D- loop region of the chicken breeds was amplified with specific primers (H1255 and L16725) and digested with three restriction enzymes DraI, KpnI and TaqI. No polymorphism was observed at the restriction site of these enzymes in the D-loop sequence of the four chicken breeds. Three hundred nucleotides beginning from position 131 to position 430 in the D-loop sequence of the four chicken breeds were then sequenced and compared with those of the White Leghorn and other chicken varieties of China, Thailand, and Japan reported in Genbank. The phylogenetic trees for the chickens were constructed based on the D-loop sequences. The results showed that the four Vietnamese chicken breeds had differences from each other. The D-loop sequences of these chickens were deposited in the GenBank databases. Keywords: Mitochondrial DNA control region, “Ri” chicken, “Tre” chicken, “Choi” chicken, “Tau Vang” chicken I. Đặt vấn ñề và mục tiêu ñề tài Ở ñộng vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể chiếm tỉ lệ từ 1-5% ADN của tế bào. Trong tế bào trứng của ñộng vật có xương sống, ước tính con số này lên ñến 108. Hệ gen ty thể là phân tử ADN trần, kép, mạch vòng gồm 2 chuỗi: chuỗi nặng (H strand) giàu guanin và chuỗi nhẹ (L strand) giàu cytosin. Tất cả ñộng vật có xương sống ñã ñược phân tích ñều có 37 gen trên phân tử ADN ty thể và thường không có khoảng trống giữa các gen (không có intron). Tuy nhiên, trật tự sắp xếp các gen trong phân tử ADN dạng vòng có thể không giống nhau giữa các loài, ñiều này ñược thể hiện rõ khi so sánh trình tự genom ty thể các taxon bậc bộ trở lên. Vì thế, các ñặc ñiểm về trật tự các gen trên ty thể ñược sử dụng như một dấu hiệu phân loại ñối với các taxon bậc cao (Mindell et al., 1998). ADN ty thể và vai trò của vùng D-loop trong nghiên cứu ña dạng sinh học gà Thuật ngữ D - loop ñược dùng ñể chỉ một vùng có chức năng ñiều khiển nằm trong mtADN. Đây là vùng không mã hóa duy nhất trong ADN ty thể của lớp chim. Các nghiên cứu của Cheng et al.,1996; Gongora, et al., 2008;Guan et al., 2007; Moiseyeva et al., 2002; Oka et al., 2007 chỉ ra rằng:Trình tự nuleotit của vùng D-loop là một công cụ rất hữu hiệu ñể ñánh giá tính ña dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể cùng loài. Chính vì thế mà các gen trong genom ty thể và vùng D-loop ñóng một vai trò vô cùng quan trọng trong các nghiên cứu thuộc lĩnh vực phân loại học phân tử, trong xác ñịnh nguồn gốc, xuất xứ của gà nhà và mối quan hệ của chúng. Như vậy, ADN ty thể có thể ñược coi là một công cụ không thể bỏ qua khi tìm hiểu về mối quan hệ phát sinh chủng loại hay sự tiến hóa của các quần thể. Trong nghiên cứu này chúng tôi phân tích sự ña hình 4 giống gà nội bằng cách nhân vùng D-loop, sử dụng các emzym hạn chế DraI, KpnI, and TaqI ñể cắt ña hình, sau ñó giải trình tự vùng ñặc biệt trong khu vực mtDNA D-loop của các giống gia cầm nội và so sánh với các giống gà khác của thể giới ñã ñược ñăng ký trên ngân hàng gen Quốc tế http://www.ebi.ac.uk. Toàn b genom ty thể gà (Gallus gallus ñược tổ chức như sơ ñồ trong hình - Sơ ñồ tổ chức của ADN ty thể Gà. Nghiên c u ADN ty thể gà trên th gi i Zhang và CS (2002) ã giải trình tự 539 nuleotit ñầu tiên trong vùng D- loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự ADN của 4 loài khác: Gallus gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei ñã ñược công bố trong Ngân hàng Gen Quốc tế. Ông ñã thiết lập ñược mối quan hệ nguồn gốc của chúng dựa trên trình tự vùng D-loop. Kết quả cho thấy 4 loài thuộc giống Gallus có rất nhiều ñiểm khác nhau. G. g. domesticus có mối quan hệ thân thuộc nhất với G. gallus của Thái Lan và các vùng lân cận. Nhóm nghiên cứu ñã giả thiết rằng, gà nhà Trung Quốc có thể có nguồn gốc từ loài G. gallus ở các nơi này và hai loài phụ G. g. Gallus, G. g. spadiceus có thể thuộc một loài phụ do tính tương ñồng cao giữa chúng (Niu et al., 2002). Năm 2002, Shi Okamoto ñã giải trình tự ADN trong ty thể ở khu vực D- loop ñể xác ñinh tổ tiên của các giống gà nuôi. Han Jianline (2006) và công sự ñã thành công trong phân tích trong mt DNA xác ñịnh sự ña dạng, nguồn gốc các giống gà trên thế giới Nghiên c u ADN ty thể gà tại Việt Nam Tại Việt Nam, các nghiên cứu ở mức ñộ tế bào, phân tử trên ñối tượng chim nói chung và gia cầm nói riêng còn rất ít ỏi. Đã có một số nghiên cứu về sự khác biệt di truyền ở ba loài thuộc giống Gà lôi: Gà lôi lam ñuôi trắng Hà tĩnh (Lophura hatinhensis), Trĩ bạc (L. nycthemera) và gà lôi hông tía (L. diardi) của Kim Thị Phương Oanh (1999). Tác giả ñã chỉ ra sự thay ñổi nuleotit trên vùng D - loop ty thể của chúng dựa trên vị trí nhận biết của các enzym giới hạn SmaI và EcoRI (Kim Thị Phương Oanh, 1999). II. Vật liệu và phương pháp thí nghiệm Mẫu máu của 4 giống gà nội: Ri, Tre, Chọi và Tàu vàng ñược thu thập từ Thanh Hóa, Bến Tre, Hà Tây, Thái bình, Bình Định, Long An. AND ñược tách chiết từ các mẫu máu, sử dụng kít tách AND của hãng Fermentas. Sử dụng cặp mồi: L16750 (5’-AGAACTACGGCTTGAAAAGC-3’) và H1255 (5’- CATCTAGGCATCTTCAGT- GCC -3’), ñể nhân gen vùng D-loop. Phản ứng PCR ñược tiến hành với thể tích 50 ml [500 mM Tris-HCl (pH 8.3), 0.1% Triton X-100, 2 mM KCl, 75 mM MgCl2, 5 mM dNTP, 10 pM mồi, and 1.5 units of Taq DNA polymerase (Fermentas), chu trình nhiệt 35 chu kỳ trong: 1 phút 94oC, 1 phút ở 54oC, và 1 phút ở 72oC. Sản phẩm PCR ñược tinh sạch sau ñó ñược ñưa vào ñọc trình tự trực tiếp sử dụng kít BigDye® Terminator cycle sequencing của hãng Applied Biosystems. Số liệu giải trình tự ñược phân tích bằng phần mềm SeqScape® 2.6 (Applied Biosystems) và sử dụng cây phân loài neighbor-joining (NJ) cho tất cả các Haplotypes với cấu trúc phầm mềm MEGA software (Kumar et al., 2007). III. K t quả và thảo luận Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhân và tinh sạch sản phẩm PCR với kích thước 1.3 kb vùng D-loop của 4 giống gà nội sau ñó cắt bằng 4 enzyme hạn chế DraI, KpnI, and TaqI. Kết quả cho thấy, không có ña hình tại vị trí căt bằng các enzyme này ở vung D-loop của 4 giống gà nôi Việt nam. Điều này có thể là phương pháp PCR- RFLP với các emzyme trên chưa thích hợp cho các giống gà nội Việt Nam . Hình 1: K t qu ñiện di ADN tổng số tách ñược từ mẫu gà Hình 2: Nhân bản ñoạn D-LOOP bằng kỹ thuật PCR M: marker; 1: m u gà Ri; 2: mẫu gà Tre; 3: Chọi; 4: mẫu gà Tàu Vàng Hình 3: Kết qủa không có iểm cắt Ezymes trên ñoạn sản phẩm PCR (~1300bp) Kết quả thể hiện trên ñiện di ñồ cho thấy tất cả các mẫu gà nghiên cứu này ñều không chứa ñiểm cắt bằng các enzym DraI, KpnI, và TaqI tại vùng D-loop S 1: So sánh trình t oạn D-LOOP ở m u các giống gà ng k thu t giải trình tự và phân tích kết quả: 300 nucleotides của khu vự c từ v trí nucleotit 131 n 430 ã ược n i th ng hàng t i sơ 131 WL TATGTACTAAACCCATTATATGTATACGGGCATTAATCTATATTCCACATTTCTCCCAATGTCCATTCTATGCATGATCC 210 RI1 C RI10 RI2 C C RI3 RI4 RI5 RI6 C RI7 RI8 RI9 Tre1 C TRE2 C CHOI1 CHOI2 CHOI3 tvang1 C tvang2 tvang3 tvang4 tvang5 C WL AGGACACACTCATTCACCCTCCCCATAGACAGTTCCAAACCACTACCAAGTCACCTAACTATGAATGGTTACAGGACATA 290 RI1 C RI10 .A T T T C RI2 C RI3 .A T T T C RI4 .A T T T C RI5 .A T T T C RI6 .A T T T C RI7 .A T T T C RI8 .A T T T C RI9 C C Tre1 T T T C TRE2 T T T C CHOI1 .A T T T C CHOI2 .A T T T C CHOI3 T T C tvang1 T T T C tvang2 T AC C G tvang3 .A T C G tvang4 T AC C G tvang5 T T T C WL AATCTCACTCTCATGTTCTTCCCCCAACAAGTCACCTAACTATGAATGGTTACAGGACATACATTTAACTACCATGTTCT 370 RI1 RI10 C T RI2 C T RI3 C T RI4 C T RI5 C T RI6 C T RI7 T C T RI8 C T RI9 T Tre1 C TRE2 C CHOI1 C T CHOI2 C T CHOI3 C T tvang1 C tvang2 G G T C tvang3 C G T C tvang4 G G T C tvang5 C Kết quả: - Sự nối thẳng hàng của các trình tự mt-D-loop ở các giống gà nội Việt Nam (trình tự D-loop của gà Leghorn trắng ñược chọn làm so sánh tương ñồng). Các chấm thể hiện nhận dạng với trình tự ở hàng thứ nhất. Các chữ thể hiện các vị trí ñột biến trong trình tự. Các giống: WL: gà Leghorn trắng; RI: gà Ri; TRE: gà Tre; CHOI: gà Chọi; Tauvang: gà Tàu Vàng. - Có 21 vị trí, ñặc trưng bởi sự ñột biến với 4,45%, ñược phát hiện trong 20 trình tự ADN. Điều này chỉ ra rằng có sự khác nhau giữa các giống gà ñịa phương nhưng không nhiêu. -Có có chín kiểu ñơn bội (haplotypes) trong các giống nội ñịa ñược nghiên cứu. Sơ ñồ 2: Cây phân bố loài bốn giống gà Cây phân loài chỉ ra rằng bốn giống gà thuộc về hai dòng mẹ khác nhau, một dòng gồm có gà Ri và gà Leghorn trắng, dòng còn lại gồm có Tre, Tàu Vàng và gà Chọi. Trong dòng mẹ thứ hai, gà Chọi có quan hệ gần với gà Ri hơn gà Tàu Vàng và gà Tre. Trong những giống ñịa phương ñược nghiên cứu, có một số cá thể ñặc biệt khác lạ so với các cá thể cùng giống (ví dụ như RI1, RI2, RI9, tauvang1 và tauvang 5). Có thể nói rằng trong quá trình tiến hóa và phát triển ñã có một tổ tiên dòng mẹ khác lẫn vào (Sơ ñồ 2). IV. Kết luận và ñề nghị Kết quả ban ñầu của chúng tôi cho thấy: -Từ trình tự genome ty thể của giống gà nhà Gallus gallus domesticus ñã công bố trên ngân hàng gen quốc tế GENBANK, ñã thiết kế ñược nhân ñoạn DLOOP L16725, H1255 . - Đã nhân thành công ñược ñoạn DLOOP ở các mẫu nghiên cứu có kích thước 1,3 kb. - Tiến hành phân tích sự ña hình và xác ñịnh trình tự vùng DLOOP từ các mẫu gà cho thấy: + Không có sự ña hình trong các vị trí cắt của các enzyme hạn chế DraI, KpnI, and TaqI của khu vực mt D-loop trong bốn giống gà nội Việt Nam, Ri, Tre, Chọi và Tàu Vàng nhưng có sự ñột biến tại các vị trí khác nhau của các giống gà nội. + Gà Chọi khả năng rất cao có nguồn gốc dòng mẹ từ gà Ri. Toàn bộ chiều dài của trình tự D-loop của các mẫu gà ñang ñược tiếp tục nghiên cứu và phân tích. Tài li u tham khảo Akishinonomiya F., Miyake T., Sumi S., Takada M., Ohno S., Kondo, N. (1994) One subspecies of the red junglefowl (Gallus gallus gallus) suffices as the matriarchic ancestor of all domestic breeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91:12505. Cheng G. C., Liu K. F., Zhang Q., Wang L., Duan Z. X., Li X. Y., Liu R. S., and Yu, Q. (1996). Studies on genetic relationship between red jungle fowl (Gallus gallus) and domestic fowl (Gallus domesticus). Acta Genet. Sin., 23:96. Fumihito A., Miyake T., Sumi S., Takada M., Ohno S., Kondo N. (1994) One subspecies of the red junglefowl (Gallus gallus gallus) suffices as the matriarchic ancestor of all domestic breeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., : Fumihito A., Miyake T., Takada M., Shingu R., Endo T., Gojobori T., Kondo N., Ohno S. (1996) Monophyletic origin and unique dispersal patterns of domestic fowls. Proc. atl. Acad. Sci. U.S.A., : 6795. Guan X., Geng T., Silva P., Smith E. J. (2007) Mitochondrial DNA sequence and haplotype variation analysis in the chicken (Gallus gallu . J. Hered. : (7): . Mannen H., Morimoto M.L., Oyamat K., Mukai F., Tsuji S. (2003) Identification of mitochondrial DNA substitutions related to meat quality in Japanese Black cattle. Anim. Sci., 81(1):68-73 Mindell D. P., Sorenson M. D., Dimcheff D. E. (1998) Multiple independent origins of mitochondrial gene order in birds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ( 10693 10697. Gongora J., Rawlence N. J., Mobegi V. A., Alcalde J. A., Mtus J. T., Hanotte O., Moran C., Austin J. J., Ulm S., Andersson A. J., Larson G., Cooper A. (2008) Indo-European and Asian origins for Chilean and Pacific chickens revealed by mtDNA. Proc. atl. Acad. Sci. U.S.A.,105(30): . Moiseyeva I. G., Romanov M. N., Nikiforov A. A., Sevastyanove A. A., Semyenova S. K. (2002) Evolutionary relationships of Red jungle fowl and chicken breeds. Genet. Sel. Evol., ( ): 403 . Niu D., Fu Y., Luo J., Ruan H., Yu X., Chen G., Zhang Y. (2001) The origin and genetic diversity of Chinese native chicken breeds. iochem. Genet., 40( /6): 163 174. Oka T., Ino Y., Nomura K., Kawashima S., Kuwayama T., Hanada H., Amano T., Takada M., Takahata N., Hayashi Y., Akishinonomiya F. (2007) Analysis of mtDNA sequences shows Japanese native chickens have multiple origins. Anim. Genet., 38: 287-293. Pfeiffer I., Burger J., Brenig B. (2004) Diagnostic polymorphisms in the mitochondrial cytochrome b gene allow discrimination between cattle, sheep, goat, roe buck and deer by PCR-RFLP. BMC Genet., 5: 30 doi:10.1186/1471-2156-5-30. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol., 24:1596-1599. . BÁO CÁO KHOA HỌC Tên ñề tài : Xác ñịnh sự ña dạng di truyền vùng D-loop trong ty thể (mtADN) của 4 giống gà nội Lê Thị Thúy 1 , Nguyễn Đăng Tôn 2 , Địch. trò của vùng D-loop trong nghiên cứu ña dạng sinh học gà Thuật ngữ D - loop ñược dùng ñể chỉ một vùng có chức năng ñiều khiển nằm trong mtADN. Đây là vùng không mã hóa duy nhất trong ADN ty thể. giá tính ña dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể cùng loài. Chính vì thế mà các gen trong genom ty thể và vùng D-loop ñóng một vai trò vô cùng quan trọng trong các