định tính axit amin bằng sắc ký giấy

Các acid amin có tính chất chung là có thể tác dụng ninhydin tạo ra một phức có màuxanh chỉ riêng imnoacid như prolin thì có phức màu vàng và phản ứng này rất nhạy cảm có thể phát hiện ở

Bài 1: ĐỊNH TÍNH ACID AMIN BẰNG SẮC KÍ GIẤY

Vì vậy, kết thúc qua trình sắc kí mỗi loại acidamin sẽ nằm ở vị trí khác nhau, cách nhaukhoảng nhất định trên giấy sắc kí Nếu ta có một acidamin chuẩn, để khảo sát trong mẫu

có acidamin đó hay không, ta chỉ việc chấm mẫu và chuẩn trên 2 điểm xuất phát trên tờgiấy sắc kí Sau một thời gian nếu trên tờ giấy sắc kí có 2 vệt chấm của cấu tử trong mẫu

và chuẩn tương đồng nhau Nếu ta nhuộm màu chúng bằng cách cho phản ứng với 1 phứcmàu nào đó thì lập tức trên tờ giấy sắc khi xuất hiện 2 vệt màu giống nhau

Các acid amin có tính chất chung là có thể tác dụng ninhydin tạo ra một phức có màuxanh chỉ riêng imnoacid như prolin thì có phức màu vàng và phản ứng này rất nhạy cảm

có thể phát hiện ở mức microgam Quá trình phản ứng tạo ra hợp chất dicetooxihindriden và NH3 sau đó hai hợp chất này tiếp tục phản ứng tạo ra hợp chất có màuxanh tím

Ninhydrin 0.5% trong aceton

Dung dịch CuSO4 0.05% pha trong cồn 80%

Mẫu chuẩn (hòa tan một acid amin mẫu trong 10ml nước.Nếu khó tan có thể đun nóngnhẹ),mẫu khảo sát

Dung môi:butanol-acid acetic-nước theo tỉ lệ 4:5:1

V Tiến hành:

1.Chuẩn bị sắc kí giấy:

(đường xuất phát) Chấm một điểm giữa đoạn vẽ chì Cố gắng giữ đầu này thẳng

và sạch

Sấy ngay để giọt nước không loang ra khỏi vòng tròn Chấm khoảng 5 lần, làmnhư vậy với hai mẫu chuẩn và một mẫu khảo sát

2.Chạy sắc kí

giấy nhúm vào dung môi và giữ băng giấy thẳng, không được chạm vào thành ốngnghiệm

ra khỏi ống nghiệm, cho vào tủ hotte chừng 10-12 phút (hoặc sấy trực tiếp) đểđuổi dung môi

- Phun đều dung dich ninhydrin 0.5% pha trong aceton lên giấy đã chạy sắc kí Sấykhô, các vết màu sẽ xuất hiện.

Xác định các acid amin có trong mẫu bằng cách so sánh vị trí các vết màu trên sắc kí đồcủa dung dịch chuẩn với sắc kí đồ dung dịch mẫu

VI Kết quả

R1 = 4,5 ; R2 = 4,8 ; R3 =4,6

*Nhận xét

- Mẫu 1 dịch chuyển nhanh nhất theo tuyến dung môi

- Mẫu 2 dịch chuyển chậm nhất theo tuyến dung môi

Thu được các vết acid amin khác nhau, bao gồm các vết riêng lẻ và các vết hỗn hợp Kếtquả chỉ mang tính tương đối vì trong quá trình làm thí nghiệm có thể có nhiều sai sót.Mẫu 1: tâm cách điểm xuất phát 4,5cm (màu tím)

Mẫu 2: tâm cách điểm xuất phát 4,8cm (màu tím )

Mẫu 3: tâm cách điểm xuất phát 4,6 cm (màu tím)

VII Bàn luận

1.Một số điểm lưu ý khi thực hành:

- Cầm mép trên của giấy, dung bút chì vẽ để khi chạy sắc kí khỏi lem màu.

amin bị cong

- Dùng giấy sắc kí lớn lợi hơn 3 sắc kí giấy nhỏ vì nó cùng thời gian, dễ dàng hơn

2 Câu hỏi

2.1 Các acid amin dạng amino acid thường gặp trong thực phẩm gồm 20 acid amin căn

2.2 Phương pháp trên sẽ chính xác khi sử dụng để xác định amino acid vì:các amino acid

có tính chất chung là có thể tác dụng ninhydrin tạo phức màu xanh tím chỉ riêng prolin thì

có phức màu vàng

Acid amin 1 + ninhydrin → diceto oxi-hindriden + NH3 → phức xanh tím

Acid amin 2+ ninhhydrin → diceto oxi-hindriden + NH3 → phức xanh tím

Acid amin hỗn hợp + ninhhydrin → diceto oxi-hindriden + NH3 → phức xanh tím

amin của mỗi loại trong hỗn hợp khác nhau là khác nhau Đồng thời, thí nghiệmgiúp sinh viên nắm vững được kiến thức cơ bản cách định lượng acid amin bằngphương pháp sắc kí giấy

Bài 2: XÁC ĐỊNH PROTEIN THÔ TRONG THỰC PHẨM

H2SO4 đã phản ứng và tính được hàm lượng nitơ tổng có trong mẫu:

Kiểm tra các van 1,4

Đổ 10ml mẫu + 5 giọt pp + NaOH 30% (+2ml) vào (9)

Khóa van và đổ nước vào phễu

Sau 20ph, đem bình huẩn độ bằng NaOH 0,1N dung dịch chuyển sang màu vàng

V Tiến hành:

VI Kết luận:

Định lượng dung dịch H2SO4 dư hết 38,4 ml NaOH 0,1N

- Mẫu trắng : 47,6 ml

•Ntr: nồng độ đương lượng của dung dịch H2SO4 cho vào bình hứng.

•Vtr: số ml H2SO4 0.1N cho vào bình hứng để kết hợp với NH3

•Vth: số ml NaOH 0.1N dùng để chuẩn độ H2SO4 thừa

- Rửa kĩ các van trước và sau khi làm vì sút dễ tác dụng với thủy tinh làm cứng van

NH3

2. Các yếu tố sai số:

- Chuẩn độ không chính xác.

Phương trình phản ứng xảy ra:

Hàm lượng Protein thô ít có ý nghĩa vì nó không phải là hàm lượng protein nguyên chất,

nó chỉ nói lên hàm lượng nitơ tổng để chúng ta quy ra hàm lượng protein

Bài 3: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACID HỮU CƠ TRONG SỮA TƯƠI

I.Mục đích

Trong quá trình vắt sữa, thu hồi, vận chyển… có nhiều loại vi sinh vật xâm nhập vào sữa

sẽ tạo ra các acid làm giảm pH của sữa việc xác định hàm lương acid hữu cơ có sẵntrong sữa sẽ giúp điều chỉnh pH của sữa khi bổ sung thêm vi sinh vật lên men lactic đểbảo quản và chế biến sản phẩm từ sữa

II.Nguyên lý:

Dựa trên phản ứng trung hòa của acid trong sữa với dung dịch NaOH và dung dịchphenolphtalein hóa hồng trong môi trường kiềm khi NaOH dư

H+ + NaOH → Na+ + H2Ophenolphtalein

Tiến hành thử nghiệm 2 mẫu thử song song và 1 mẫu trắng:

V.Kết quả

Thể tích dung dịch NaOH dùng để chuẩn mẫu thử 1 và 2: VT1=1,3ml ; VT2=1,2ml

Thể tích dung dịch NaOH dùng để chuẩn mẫu trắng : V2= 0,15ml

Thể tích mẫu dùng ban đầu: V= 10ml

Nồng độ NaOH dùng để chuẩn mẫu: 0,1 N

Hàm lượng acid chuyển ra acid được tính bằng g/lit theo công thức:

Hoạt tính α-amylase hiển thị khả năng của enzym amylase xúc tác phản ứng thủy phântinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50°C và được biểu hiện bằng số đơn vị của enzymtrong 1g mẫu.

Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa được phân hủy sẽtạo phản ứng màu với iode và được so màu bằng máy so màu quang học ở bước sóng620nm

1 cối chày inox

1 phễu thủy tinh

20 ống nghiệm

1 bóp cao su

1 ống đong

III.Hóa chất

Dung dịch đệm sorensen 1/15M,pH tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu

Dung dịch tinh bột 1% (chuẩn bị ngay trước khi làm thí nghiệm)

Dung dịch HCl 1N

Dung dịch NaCl 3%

Thuốc thử lugol:0.5g I2 và 5gKI trong nước thành 200ml

IV Tiến hành

Rửa tủa 3-4 lần với 5ml cồn tuyệt đối

Hòa tan phần tủa cuối với 20ml nước cất

L= 10/1: hệ số pha loãng mẫu enzym.

=((0,486-0,239)/0,239×30)×10002×10=3445,6(UI)

VI Bàn luận

1.Một số điểm lưu ý:

enzyme Thử hoạt tính enzyme phải được tiến hành trong điều kiện thích hợp nhưđiều kiện sinh lý, tồn trữ thực phẩm

2.Câu hỏi

2.1Tính chất chung của enzyme :

- Enzym có bản chất là protein nên có tất cả thuộc tính lý hóa của protein Đa sốenzym có dạng hình cầu và không đi qua màng bán thấm do có kích thước lớn

- Tan trong nước và các dung môi hữu cơ phân cực khác, không tan trong ete vàcác dung môi không phân cực

- Không bền dưới tác dụng của nhiệt độ, nhiệt độ cao thì enzym bị biến tính.Môi trường axít hay bazơ cũng làm enzym mất khả năng hoạt động

- Enzym có tính lưỡng tính: tùy pH của môi trường mà tồn tại ở cácdạng: cation, anion hay trung hòa điện

- Enzym chia làm hai nhóm: enzym một cấu tử (chỉ chứa protein) như pepsin,amylase và các enzym hai cấu tử (trong phân tử còn có nhóm không phảiprotein)

Trong phân tử enzym hai cấu tử có hai phần

• Apoenzym: phần protein (nâng cao lực xúc tác của enzym, quyết định tính đặchiệu)

• Coenzym: phần không phải protein (trực tiếp tham gia vào phản ứng enzym), bảnchất là những hợp chất hữu cơ phức tạp.

2.2 Một số enzyme phân giải protein thường gặp :

2.2.1 Protease :

- Trong công nghệ sản xuất các loại dịch thủy phân giàu protein được áp dụng mộtcách có hiệu quả tính năng của proteasa : nước tương là dung dịch acid amin từđậu nành, nước mắm là acid amin từ protein cá

- Làm mềm thịt là ứng dụng có tính truyền thống của proteasa Nó được dùng trongviệc nấu các món ăn như : thơm nấu với thịt bò, dùng chuối chát làm rau sống vàkết hợp với nhiều loại tht…mà thục chất là dùng papain, bromelin, fixin đẻ làmmềm thịt, làm món ăn nhanh chín

2.2.2 Pectina được dùng trong một số nghành công nghiệp thực phẩm sau :

- Sản xuất rượu vang

- Sản xuất nước quả và nước uống không cồn

- Sản xuất các mặt hàng từ quả: mứt, quả cô dặc

- Sản xuất nước giải khát

- Sản xuất cà phê

2.2.3 Cellulase được dùng trong để:

- Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc

- Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nghuyên liệu thực vật

- Tăng chất lượng agar

- Tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm.2.3 Tính chất và ứng dụng của enzyme amylase:

2.3.1 Tính chất :

- Amylase là hệ hống Enzyme rất phổ biến trong giới sinh vật Các Enzyme nàythuộc nhóm Enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhómpolysaccharide với sự tham gia của nước

- Enzyme này thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose vàdextrin hạn chế Các enzyme có trong nước bọt, trong dịch tiêu hóa của con người

và đọng vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn

- Tùy thuộc vào tính chất , người ta chia enzyme này thành 3 loại

2.3.2 Ứng dụng của enzyme amylase:

- Chế phẩm amylase đã đc dùng phổ biến trong một sô lĩnh vực của thực phẩm như:sản xuất bia, rượu, bánh mì,…

- Trong sản xuất bánh mì, chế phẩm amylase đã thay đổi hoàn toàn chất lượng củabánh mì cả hương vị , màu sắc và đọ xốp…Chế phẩm amylase sạch cho chấtlượng tốt hởn dạng phức hợp với protease

- Trong sản xuất bánh kẹo, người ta thường dùng maltose là sản phẩm thủy phâncủa tinh bột bằng amylase và gluco bằng glucoamylase Chính glocoamylase làyếu tố làm tăng hiệu suất trong sản xuất rượu

- Trong sản xuất bia, việc sử dụng amylase có trong các hạt nảy mầm thay thế malto

đã góp phần giảm đáng kể giá thành sản phẩm

Ngoài ra, enzyme amylase còn được ứng dụng trong công nghệ dệt Nó được dùng để rũ

hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm Amylase có tác dụng làm mềm vải, có khả năngnhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt Rũ hồ bằng amylase không những nhanh, không hạovải, độ mao dẫn tốt mà còn đảm bảo vệ sinh, do đó tăng năng suất lao động

Trong y học amylase được sử dụng phối hợp với coenzyme A, ctocrom C, ATP,carboxylase để chế thuốc điều trị bệnh tim mạch, bệnh thần kinh, phối hợp với enzymethủy phân để chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa

Bài 5: ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG VÀ ĐƯỜNG KHỬ

I.Nguyên lý:

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử aciddinitrosalisylic (DNS).

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử Dựa theo đồ thịchuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử acid dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượngđường khử của mẫu nghiên cứu

III.Hóa chất

Thuốc thử acid dinitrosalisylic (DNS) : cân 1g DNS pha trong 20ml NaOH 2N, thêm vào50ml nước cất và 30g muối SOodium potassium tartate,đun cách thủy cho tan rồi địnhmức tới 100ml

Dung dịch glucose (500ppm): cân 0.5g d-glucose pha trong nước cất thành 1 lít

Dung dịch glucose mẫu (50ppm):hút 10ml dung dịch chuẩn glucose 500ppm cho vàobình định mức,thêm nước cất,định mức đúng 100ml,lắc đều

Thay y = AM = 0,088 vào phương trình, ta được: Cx= 9,03 (ppm)

thời gian, chuyển màu nau đỏ nhanh

chuẩn cho phù hợp và bổ sung thể tích còn lại bằng nước cất cho đủ 10ml, hoặc cóthể pha chuẩn có nồng độ thấp hơn hay cao hơn

lượng mẫu hoặc pha loãng mẫu sao cho giá trị nằm trong đường chuẩn

4.Câu hỏi

4.1 Đường khử là đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc (-CO) như glucose, frutose,maltose, lactose

4.2 Đường nghịch chuyển là hỗn hợp của glucoza và fructoza, thu được bằng cách phântách hỗn hợp sucroza So với sucroza thì đường nghịch chuyển ngọt hơn và các sản phẩmcủa nó giữ ẩm nhiều hơn, cũng như ít bị kết tinh hơn

Bài 7: XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ DẦU MỠI.Mục đích

Qua chỉ số xà phòng hóa ta có thể biết được trọng lượng phân tử trung bình của acid béo.Còn chỉ số acid cho thấy độ biến chất của dầu mỡ,chỉ số acid càng cao dầu mỡ càng biếnchất.Nhờ đó có thể lựa chọn được loại dầu tốt nhất cho mình

II.Nguyên tắc

Chỉ số acid = số mg KOH cần thiết để trung hòa hết các acid béo tự do có trong 1g chất

Trong dầu mỡ, lượng acid béo tự béo tự do không đáng kể nhưng sẽ tăng lên trong quátrình bảo quản hoặc ở giai đoạn nảy mầm → đánh giá dầu mỡ cũ/mới, qua chế biến haychưa

CHOCOR2 + 3KOH → CHOH + R2COOK

CH2OCOR3 CH2OH R3COOK

III.Dụng cụ và thiết bị

1 thiết bị cất sinh hàn hồi

lưu,có mối nối nhám

1 pipet 10ml

1 buret 25ml,giá đỡburet

Cân 2g mẫu vào bình cầu + 25ml KOH 0.5 trong cồn

Lắp ống sinh hàn, đun cách thủy 1 giờ

Sau khi xà phòng hóa hoàn toàn, pha loãng với 25ml nước cất + 5 giọt pp

Chuẩn độ HCL 0.5N cho mất màu hồng

Tiến hành song song mẫu trắng không chưa chất thử với 25ml dung dịch KOH 0.5Ntrong cồn trong cùng điều kiện như trên

Lưu ý: Đối với các chất khó xà phòng hóa, them 5-10ml xylen và đun lâu hơn tùy theotrường hợp

Thí nghiệm 2: Xác định chỉ số acid

Cân 5g dầu mỡ

Hòa tan 50ml cồn + 5 giọt pp

Chuẩn độ KOH 0.1N cho đến khi màu hồng bền vững 30 giây

Đối với các loại dầu mỡ có chứa nhiều este dễ xà phòng hóa, ta sử dụng dung dịch NaOH0.05N để chuẩn độ

2.1 Chỉ số xà phòng hóa đặc trưng cho tính chất gì của dầu thực vật?

Chỉ số xà phòng là số mg KOH cần để trung hòa acid béo tự do và acid bó kết hợp, khi xàphòng hóa 1g chất béo

2.2 Chỉ số acid đặc trung cho tính chất gì của dầu thực vật?

Chỉ số acid là số mg KOH cần thiết để trung hòa cac acid béo tự do có tỏng 1g chấtbéo

2.3 Trình bày nguyên lý của các phương pháp kiểm trên?

Chỉ số acid = số mg KOH cần thiết để trung hòa hết các acid béo tự do có trong 1g chấtbéo:

Trong dầu mỡ, lượng acid béo tự béo tự do không đáng kể nhưng sẽ tăng lên trong quátrình bảo quản hoặc ở giai đoạn nảy mầm → đánh giá dầu mỡ cũ/mới, qua chế biến haychưa

CHOCOR2 + 3KOH → CHOH + R2COOK

CH2OCOR3 CH2OH R3COOK

2.4 Trình bày các chỉ số khác của lipit và ý nghĩa của từng chỉ số?

Chỉ số ester là số mg KOH tác dụng với acid béo liên kết

Chỉ số iode là số gam iode kết hợp vào vị trí nối đôi của 100g glyceride

Chỉ số Reichert-Messle là số ml NaOH 0,1N trung hòa các acid được chưng cất và bayhơi theo hơi nước từ 5g chất béo sau khi thủy phân nó

Chỉ số peroxyd là số gam iode được giải phóng bởi peroxyd c strong 100g chất béo; đượctính bằng mili đương lượng của oxy hoạt tính làm oxy hóa KI trên 1kg mẫu dưới các điềukiện thao tác đã được quy định

2.5 Trình bày ý nghĩa thực tiễn thí nghiệm?

Xác định được lượng chất có trong mẫu có được Bộ y tế cho phép lưu thông không

Bài 8: ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN CI.Nguyên tắc:

Iốt tương đối không tan trong nước, nhưng điều này có thể cải thiện bằng cách pha trộniốt với iođua và hình thành triiođua:

Cân 4g chanh

Nghiền trong 20ml HCL 2%

Chuyển dịch chiết và định mức 100ml

Hút 10ml dịch vào erlen + 3 giọt hồ tinh bột 1%, lắc nhẹ

Chuẩn độ bằng I2 0,005N xuất hiện xanh lam nhạt bền 30 giây

Tính kết quả

Giá trị trung bình của số ml dung dịch I2 0,005 N dùng để chuẩn độ :

Vc = (0,35+0,4+0,31)/3 = 0.353 ml

Số ml dung dịch mẫu đem phân tích : Vf = 10 ml

Dung tích mẫu pha loãng : V = 100 ml

Hàm lượng vitamin C (%) có trong 4,07 g chanh :

giải phóng năng lượng

chức năng tạo hình Các loại vitamin này được lưu trong cơ thể, chủ yếu trong mỡ

và gan

2.1.2Tính chất

+ Còn các tên gọi retion,axerophthol…tồn tại 2 dạng trong tự nhiên:

o Retinol: dạng hoạt động của vitamin A, nó được đồng hóa trực tiếp bởi cơ thể

có thể sử dụng

+ Bị phá hủy môi trường trung tính và kiềm.

+ Bảo tồn trong môi trường acid

+ Dễ bị oxi hóa

+ Có nhiều trong long đỏ trứng

+ Phụ thuộc vào ánh sáng, nhiệt độ, nồng độ, pH

+ Còn gọi là Calcipherol, có hoạt tính chống còi xương

+ Vitamin D2 là dẫn xuất của ergosterol, chiết xuất trong phòng thí nghiệm dùng để chữabệnh

+ Vitamin D3 là dẫn xuất của cholesterol, chiết xuất trong tự nhiên từ dầu gan cá

+ Trong quá trình c và thế biến vitamin D không bị biến mất Calcipherol tăng khả nănghấp thụ Ca, P của xương; tăng nồng độ Ca, P trong máu và trong xương Vitamin D cònđược tổng hợp ở da dưới tác động tia cực tím và một phần thu nhận từ thức ăn, có vai tròtrong điều hòa calci và phosphor huyết tương, trợ giúp sự khoáng hóa xương và chứcnăng hệ thần kinh cơ, , được dùng trong thiểu năng cận giáp, loãng xương sau mãn kinh

+ Còn gọi là Tocophero; là một vitamin tan trong dầu

+ Là dẫn xuất benzopyran; là một chất dầu lỏng, không màu, bền với nhiệt

+ Là chất chống oxy hóa

+ Là dẫn xuất naphtoquinon Đã tách được các loại K1, K2, K3

+ Vitamin K1 là chất dầu màu vàng nhạt, kết tinh ở -200C, hình thành chủ yếu trong thựcvật

thối Hoạt tính của K2 thấp hơn 60% K1

+ Vitamin K bị phân hủy nhanh dưới tác dụng của tia tử ngoại; có tính oxy hóa khử