Định lượng vitamin B12 bằng sắc ký lỏng cao áp

ở tiểu luận này em định lợng Vitamin B12 trong mẫu thuốc viờn3B trờn thị trường để kiểm chứng nồng độ ghi nhón Nhiệm vụ của đề tài: Nghiên cứu các điều kiện Sắc kí khi Vitamin B12 tồn tạ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

VIỆN CN SINH HỌC & CN THỰC PHẨM

BỘ MÔN: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

*******************

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

ĐỀ TÀI: Định lượng vitamin B12 bằng sắc ký lỏng cao áp

Sinh viên thực hiện.

Họ và tên: Trần Quang Đôn MSSV: 20141060 Lớp: KTSH 01-K59

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Quản Lê Hà.

Hà Nội, 1 tháng 05 năm 2017.

Cho đến nay ngời ta đã tách ra đợc khoảng 30 loại chất thuộc nhómVitamin, đa số đã đợc xác định đầy đủ cả cấu trúc hoá học cũng nh tính chất lýhoá học và sinh lý học

Nguyên nhân thiếu Vitamin thờng do thành phần thức ăn không đầy đủhoặc cơ thể mắc bệnh, không chuyển hoá đợc qua thức ăn Khi đó phải bù đắpVitamin cho cơ thể bằng các con đờng dẫn thuốc thích hợp nh: uống, tiêm, truyền.Cơ thể con ngời thờng thiếu nhiều Vitamin một lúc, nên điều trị cần phối hợpnhiều Vitamin Trừ A, D, E dùng liều cao và dài ngày có thể gây bệnh còn cácVitamin nếu thừa, cơ thể sẽ tự đào thải qua mồ hôi, nớc tiểu Về cảnh giác thuốc,vẫn cần lu ý dùng đúng liều chỉ định và đờng dùng cho mồi Vitamin, nhiều khi cótác dụng không mong muốn (nh Vitamin PP, C, B1)

Chính vì việc dùng Vitamin là rất cẩn trọng nên chúng ta phải hết sức chú ýkhi dùng thuốc ở tiểu luận này em định lợng Vitamin B12 trong mẫu thuốc viờn3B trờn thị trường để kiểm chứng nồng độ ghi nhón

Nhiệm vụ của đề tài:

Nghiên cứu các điều kiện Sắc kí khi Vitamin B12 tồn tại trong hỗn hợp

áp dụng các điều kiện đã chọn để định lợng trong viên nén Vitamin 3B

Phần I Tổng quan

I Vitamin B12

I.1 Nguồn gốc

- Vitamin B12 là loại Vitamin hầu nh độc nhất đợc tổng hợp bởi các sinh vật

- Thực vật chỉ chứa rất ít Vitamin B12, Vitamin B12 chỉ phát hiện thấy mộtlợng nhỏ ở hạt cũng là nguồn vi sinh vật phát triển trên bề mặt của hạt

- ở một số loài tảo cũng có Vitamin B12 do các vi sinh vật cộng sinh tạo ra

- ở động vật, các vi khuẩn của ruột có khả năng tổng hợp Vitamin B12 vàcung cấp nó cho động vật chủ, vì vậy các sản phẩm động vật thờng giàu VitaminB12 Gan, thịt, cá, trứng, sữa là các sản phẩm giàu Vitamin B12

- Năm 1948 thu đợc Vitamin B12 ở dạng kết tinh từ dịch gan

Cấu trúc hoá học của Cyanocobalamin và Hyđroxocobalamin

H OH

H H

Hydroxo CyanocobalaminH.axetat →R là CH3COOH

H sunfat → R là H2SO4

H cloric → R là HCL

- Vitamin B12 tồn tại ở dạng bột kết tinh hoặc tinh thể màu đỏ đậm

- Hoà tan trong nớc và trong etanol 96%, không hoà tan trong axeton và ete

- Dạng khan rất hút ẩm

- Vitamin B12 bền trong tối và ở nhiệt độ thờng; ở ngoài ánh sáng nó lại dễdàng bị phân huỷ

Bảng độ hấp thụ quang của các dạng.

Dạng Cực đại hấp thụ (nm) Độ hấp thụ riêng ( 1 %

H H

O

OH

H

o R

+ Vitamin B12 là thành phần của các coenzim, xúc tác cho các quá trìnhtổng hợp protein ở trên.

+ Vitamin B12 cũng tham gia vào sự trao đổi các hợp chất chứa một cacbon

và thờng phối hợp, tác dụng với axit folic trong các phản ứng metyl hoá; Ví dụtrong quá trình tổng hợp metionin từ homo xistin

- Các phản ứng chuyển hoá Metyl hoá khác trong đó có sự tham gia củaVitamin B12 là phản ứng tổng hợp N-Metyl Nico Tiamit hoặc tổng hợp Creatin,

- Vitamin B12 còn liên quan tới sự chuyển hoá của các hợp chất Sunfidryl,

nó tham gia vào sự khử các hợp chất Đisunfit thành các hợp chất Sunfidryl do đó

nó duy trì hoạt tính của các Enzim chứa nhóm SH và ảnh hởng tới sự trao đổiProtein, Gluxit cũng nh Lipit

- Khi bảo quản các sản phẩm giàu Vitamin B12 nh: sữa, gan, trứng, ngời

ta nhận thấy, hàm lợng Vitamin B12 trong sản phẩm có thể thay đổi ít nhiều tuỳ

S (CH2)2

CHNH2

COOH

C O

H + 2H(Vitamin B12)

S (CH2)2

CHNH2

COOH

CH3

theo điều kiện xử lý trớc khi bảo quản và trong khi bảo quản Những dẫn chứngcho ta biết:

+ Khi tiệt trùng sữa bằng phơng pháp làm nóng trực tiếp (hoặc sục hơi nớcvào sữa) hoặc gián tiếp (hấp trong các thiết bị vô trùng) sự hao hụt Vitamin B12thay đổi từ 40 - 20% Khi quấy sữa cô đặc không thêm đờng ở nhiệt độ thấp, sau 4năm sẽ mất đi khoảng 35% lợng Vitamin B12

+ Trứng cũng là sản phẩm rất quan trọng về phơng diện Vitamin nói chung

và Vitamin B12 nói riêng Trong 7 tháng đầu khi bảo quản trứng, Vitamin B12khá bền, trứng sau thời gian đó hàm lợng Vitamin B12 sẽ giảm đi rõ rệt và mất đitới 32% Sau 1 năm ở lòng trắng trứng chỉ có ít Vitamin B12

Do trọng lợng phân tử của Vitamin B12 lớn nên không có sự di chuyển từlòng đỏ sang lòng trắng trong quá trình bảo quản

- Trong kỹ nghệ, ngời ta lợi dụng khả năng sinh tổng hợp Vitamin B12 bởihàng loạt vi sinh vật, đặc biệt các loại xạ khuẩn, nấm mốc loại Streptomyces, các

vi khuẩn lên men Propinic để sản xuất Vitamin B12

* Trong quá trình ủ thức ăn cho gia súc, các vi sinh vật phát triển ở thức ăncũng tổng hợp đợc một lợng đáng kể Vitamin B12 Thêm muối Cacbon vào đónuôi cấy của chúng hoặc thức ăn ủ kích thích sự tổng hợp Vitamin B12

- Vitamin B12 có ý nghĩa quan trọng đối với chăn nuôi gia súc Nó làmtăng sự hấp thụ thức ăn Protein thực vật, tăng trởng và tích luỹ mỡ Vitamin B12cũng làm tăng sinh sản đẻ trứng và nở trứng ở gà mái Ngoài ra còn có những dẫnliệu chứng minh rằng tác dụng của Vitamin B12 sẽ tăng lên nhiều nếu phối hợpthêm vào thức ăn của gia súc một ít chất khoáng sinh Biomixin

I.3 Công dụng

- ở ngời, thiếu Vitamin B12 sẽ gây rối loạn sản xuất máu ở trong xơng, dẫn

đến thiếu máu nguyên bào khổng lồ (Biermen) do hồng cầu không trởng thành ợc

đ Theo những nghiên cứu mới đây cho thấy:

+ ở những phụ nữ mang thai có hàm lợng Vitamin B12 trong máu thấp, thainhi rất dễ tật nứt đốt sống - hiện tợng này gây liệt chân và chậm phát triển trí não

- Vitamin B12 thờng đợc dùng chữa chứng thiếu máu nguyên bào khổng lồ,rối loạn về thần kinh, viêm đa dây thần kinh (thờng đợc dùng phối hợp vớiVitamin B1, Vitamin B6) nhất là ở ngời nghiện rợu hoặc đái tháo đờng, cũng đợcdùng cho bệnh nhân suy nhợc.

- Vitamin B12 có tác dụng tốt với nhiều quá trình, nó tham gia gia vào phảnứng tổng hợp Thymidylate, một thành phần trong phân tử AND, cung cấp nguyênliệu để tổng hợp AND, góp phần vào quá trình phân chia và trởng thành của tế bàotrong cơ thể

II Các phơng pháp định lợng Vitamin B12.

II.1 Vitamin B12 trong thuốc đơn thành phần.

Hoà tan 25,00 mg chế phẩm trong nớc và pha loãng đến 1000,0 ml bằngdung môi Đo độ hấp thụ tử ngoại ở bớc sóng cực đại 361 nm đối với CyanoCobalamin và 351 nm đối với Hiđroxo Cobalamin, tính kết quả dựa vào độ hấpthụ riêng (E1%

Để tính kết quả ngời ta đo độ đục của mẫu thử và mẫu chuẩn so với mẫutrắng là chủng vi sinh vật đợc nuôi cấy trong cùng môi trờng nuôi cấy không cóVitamin B12

Phơng pháp này đợc sử dụng để định lợng Vitamin B12 trong các chế phẩm

có hàm lợng Vitamin B12 rất nhỏ : từ hàng ng đến hàng àg/ viên, ml.

Tuy nhiên chủng vi sinh vật Lactobacililus bichmanic rất hiếm và khó nuôicấy Nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có đợc để thực hiện phơng phápnày cho nên phơng pháp này rất hạn chế

II.2.2 Phơng pháp quang phổ khả kiến.

Phơng pháp quang phổ khả kiến có thể dùng để tính hay định lợng VitaminB12 trong các chế phẩm dợc

Phơng pháp này dựa trên nguyên tắc đo quang phổ ở bớc sóng khả kiến(548 ± 2 nm) song song với chuẩn.

Dung dịch thử đợc chiết trong môi trờng Etanol 95 % và làm sạch để loại

bớt Vitamin B1 và Vitamin B6 Không làm lạnh hoặc chiết trong môi trờng đệmAxetat.

Phơng pháp này không có tính chọn lọc do không loại trừ đợc chất màu,nhất là phẩm màu hồng thờng có trong chế phẩm và vấn còn nhiều Vitamin B1,B6 trong mẫu thử Do đó phơng pháp này chỉ áp dụng đợc với các chế phẩm cóhàm lợng Cyano cobanlamin lớn (trên 500 à g/viên.ml) và tá dợc không có chất

màu

II.2.3 Phơng pháp đo quang phổ tử ngoại.

- Phơng pháp này dựa trên nguyên tắc đo quang phổ ở cực đại vùng tử ngoại

361 ± 1nm, song song với chuẩn.

Dung dịch thử đợc chiết nhiều lần trong hỗn hợp Phenol + Butanol hoặc chỉvới Butanol trong môi trờng Axit Boric

- Phơng pháp này có khả năng áp dụng hạn chế vì kiểm nghiệm viên phảitiếp xúc lâu với dung môi độc và Vitamin B1, B6 vẫn còn ảnh hởng lớn

Chỉ nên áp dụng với các chế phẩm có hàm lợng Cyano cobanlamin cao (từ

1000 àg/viên,ml).

II.2.4 Phơng pháp sắc kí định lợng Vitamin B12.

Phơng pháp sắc kí là phơng pháp rất căn bản để đạt tới việc định lợngVitamin B12 trong các nguyên liệu thiên nhiên, và nh vậy cả phơng pháp sắc kílớp mỏng, phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao

II.2.4.1 Sắc kí lớp mỏng

Trong sắc kí lớp mỏng, quá trình tách hỗn hợp các chất xẩy ra khi cho pha

động chuyển qua pha tĩnh Chất hấp thụ (pha tĩnh) đợc rải thành lớp mỏng trêntấm kính hoặc tấm kim loại Trong quá trình chuyển giao chất hấp thụ, nhờ cácquá trình hấp thụ - giải hấp thụ đợc lặp đi lặp lại và do hệ số phân bố khác nhaucác cấu tử đợc dịch chuyển trên lớp mỏng theo hớng chuyển động, với những tốc

độ khác nhau Kết quả ta thu đợc một sắc đồ trên lớp mỏng Sắc kí lớp mỏng đợcthực hiện theo phơng pháp rửa giải Có thể tóm tắt nguyên tắc tiến hành nh sau:

+ Rải một lớp chất hấp thụ trên một tấm kính (hoặc tấm kim loại) rồi chấmmột giọt dung dịch các chất phân tích lên gần một đầu mép lớp mỏng (điểm xuấtphát) Sau đó, nhúng kính đã có lớp mỏng (bản mỏng) chất hấp thụ vào dung môi

đến mức dới điểm xuất phát

+ Do tác dụng của lực mao quản, đun thấm theo lớp mỏng giao điểm xuấtphát Kết quả là mỗi chất trong hỗn hợp đợc phân chia theo 1 vùng riêng

Sơ đồ tách bằng sắc kí lớp mỏng

II.2.4.2 Phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao.

Đợc dùng để tách các Vitamin hoà tan trong nớc

+ Với Đelecter uv/vis

+ Cột tách: Lichrosorla 18 (5 - 10 àm, 250 x 4 mm)

+ Pha tĩnh (chất nhồi) Silicagel

+ Dung môi: Meltanol + nớc (35: 65)

II.2.5 Kết luận chọn phơng pháp phân tích Vitamin B12.

Thông qua tổng quan về các phơng pháp xác định Vitamin B12 trong viênnén Vitamin3B, chúng ta thấy nó khá phong phú Mỗi phơng pháp có một u nhợc

điểm riêng và khả năng áp dụng khác nhau

- Phơng pháp vi sinh vật có độ chọn lọc và độ nhạy cao nên áp dụng chocác mẫu Vitamin 3B có hàm lợng Vitamin B12 rất nhỏ mà các phơng pháp kháckhông định lợng đợc

- Phơng pháp đo quang tử ngoại khả kiến có thể áp dụng khi phòng kiểmnghiệm không có máy HPLC, với các mẫu Vitamin3B có hàm lợng Vitamin B12cao nhng đòi hỏi kỹ thuật chiết tách cao để tránh ảnh hởng của Vitamin B1, B6 vàtá dợc chất màu

B B

Điểm xuất phát Dung môi

a b c

- Phơng pháp HPLC với các chơng trình sắc kí lỏng pha đảo khác nhauchiếm tỷ lệ lớn trên 80% trong số các tiêu chuẩn cơ sở của thuốc 3B đang lu hànhhiện nay Phơng pháp HPLC có độ chính xác và tin cậy cao, tiến hành đơn giản,khả năng áp dụng rộng rãi trên nhiều loại chế phẩm.

Với ý nghĩa này, đề tài này đợc thực hiện bằng phơng pháp sắc kí lỏng hiệusuất cao Chúng tôi hy vọng rằng các kết quả thu đợc đáp ứng yêu cầu của phépphân tích và có độ tin cậy cao

III Một số vấn đề khi áp dụng phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao để xác định Vitamin B12 trong viên nén Vitamin 3B.

III.1 Cơ sở lý thuyết của phơng pháp HPLC.

III.1.1 Khái niệm:

Sắc kí lỏng hiệu năng cao là một phơng pháp chia tách trong đó pha động làchất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất mang rắn đã đợc phân chia dớidạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang

đợc biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ Quá trình sắc kí lỏng dựatrên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ

III.1.2 Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột.

- Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc kí

và loại sắc ký

+ Nếu pha tĩnh là chât hấp phụ thì ta có sắc kí hấp phụ pha thuận hoặc pha

đảo

+ Nếu pha tĩnh là chât trao đổi Ion thì ta có sắc kí trao đổi Ion

+ Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc kí phân bố hay sắc kí chiết

+ Nếu pha tĩnh là gen thì ta có sắc kí gen hay sắc kí Rây phân tử

- Cùng với pha tĩnh, để rữa giải chất phân tích ra khỏi cột, chúng ta cần cómột pha động

Nh vậy nếu ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C, vàocột tách, kết quả là các chất A, B, C, sẽ đợc tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột.Quyết định hiệu quả của sự tách sắc kí ở đây là tổng của các tơng tác

III.1.3 Các đặc trng của Pic sắc kí.

Đờng cong rữa giải (tín hiệu phụ thuộc thời gian) Sau một quá trình sắc kítách đợc gọi là sắc đồ, nó thờng có các dạng sau:

Trong đó:

t0: Thời gian chết là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống tách

tR: Thời gian lu: thời gian cần thiết kể từ khi chất đợc bơm vào cột cho đếnkhi đạt đợc nồng độ cực đại của nó, xuất hiện ở thời điểm cuối của hệ thống tách

Từ các thông số của các Pic trên đây, nhiều đại lợng đặc trng về lý thuyết

đ-ợc đa ra để đánh giá một quá trình sắc kí Sau đây chúng tôi chỉ đề cập đến những

đại lợng thờng dùng trong thực tế và cách làm thay đổi giá trị các đại lợng có lợicho việc phân tích bằng HPLC

III.1.3.1 Thời gian lu tR

Thời gian lu của một chất là thời gian tính từ lúc bỏ mẫu vào cột đến khichất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại

Thời gian lu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian

lu sẽ khác nhau trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn Vì vậy thời gian lu là đạilợng đặc trng để phát hiện định tính các chất

Thời gian lu phụ thuộc vào các yếu tố:

+ Bản chất sắc kí của pha tĩnh

+ Bản chất thành phần, tôc độ của pha động

+ Cấu tạo và bản chất phân tích của chât tan

+ Trong một số trờng hợp còn phụ thuộc và PH của pha động

tR = to (dd) (1 + K’)

- Trong một phép phân tích nếu tR nhỏ quá thì sự tách kém, còn tR lớn quá(tR> 20phút) thì Pic bị loãng và độ lặp lại kém, thời gian phân tích dài Để thay đổithời gian lu ta tìm cách thay đổi một hoặc nhiều yếu tố trong các yếu tố phụ thuộctrên đây

III.1.3.2 Hệ số dung lợng K’

Hệ số dung lợng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đó trong

2 pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ lệ số giữa lợng chất tan trong pha tĩnh

và lợng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng

Hệ số dung lợng K’ phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, đặc tính củapha tĩnh và pha động, K’ thờng đợc tính theo công thức:

RB o A

Số đĩa lý thuyết là đại lợng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiệnsắc kí nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc kí nh là một lớp pha tĩnh có chiềucao là H, tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách

mà trong đó một cân bằng nhiệt động đợc thiết lập giữa nồng độ trung bình củachất tan trong pha tĩnh và pha động

Vì vậy với một điều kiện sắc kí xác định thì chiều cao H cùng hằng định

đối với một chất phân tích và số đĩa lý thuyết của cột cũng xác định:

Số đĩa lý thuyết N đợc tính theo công thức:

Độ phân giải là một đại lợng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trên

điều kiện sắc kí đã cho Độ phân giải của 2 Pic cạnh nhau đợc tính theo côngthức:

( 2 1) ( 2 1),1 ,2 0,5.1 0,5.2

Độ phân giải phụ thuộc vào các hằng số K2 (hệ số dung lợng của cấu tử rasau), độ chọn lọc α và số đĩa lý thuyết N của cột.

2 2

1

K N

R

K

αα

+ Làm thay đổi K’ bằng cách thay đổi lực rữa giải của pha động (thay đổi

độ phân cực nếu là RP-HPLC, thay đổi cờng độ nếu là IE-HPLC, )

+ Làm tăng số đĩa lý thuyết của cột bằng cách dùng cột dài hơn hoặc cột cókích thớc hạt nhỏ hơn,

+ Làm tăng độ chọn lọc α bằng cách dùng cột khác phù hợp hơn với quá

trình tách, hoặc thay đổi thành phần pha động

Nếu R lớn quá thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, dộ nhạy

sẽ kém, lúc này phải tìm cách làm giảm R bằng cách: ứng dụng quá trình rữa giảiGradient để cho chất thứ 2 ra nhanh hơn, nếu thiết bị không có khả năng này thìphải thay đổi thành phần hoặc tỷ lệ pha động

III.1.3.6 Hệ số không đối xứng T

Hệ số đối xứng T cho biết mức độ không đối xứng của Pic trên sắc độ thu

đợc T đợc tính bằng tỷ số độ rộng của 2 nữa Pic tại điểm 1/10 hoặc 1/20 chiềucao của Pic

T = b/a

Pic dạng đối xứng hình Gaus trên thực tế khó đạt đợc, vì vậy phải quan tâm

đến hệ số không đối xứng T, khi T ≤ 2,5 thì phép định lợng đợc chấp nhận, nếu T

> 2,5 thì điểm cuối của Pic rất khó xác định, vì vậy cần thay đổi các điều kiện sắc

kí để làm cho Pic cân xứng hơn theo các cách sau:

+ Làm giảm thể tích chết, tức là đoạn nối từ cột đến Đetecter

+ Thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rữa giải tăng lên

+ Giảm bớt lợng mẫu đa vào cột bằng cách pha loãng mẫu phân tích hoặcgiảm thể tích thân

III.2 Đánh giá Pic (diện tích, chiều cao) và các phơng pháp định lợng thờng dùng trong HPLC.

III.2.1 Đánh giá diện tích Pic.

Diện tích Pic của một chất là tơng ứng với lợng chất đó Để tính diện tíchPic, hiện nay ngời ta thờng dùng tích phân kế Phơng pháp này có thể dùng chocác Pic không bị trôi đờng nền và cả Pic có đờng nền bị trôi Phơng pháp này đochỉ cần điểm đầu và cuối của Pic đợc nhận ra chính xác và nó cho kết quả tốt đốivới nồng độ trung bình và cao

Việc xác định diện tích Pic phải đợc sử dụng trong các trờng hợp yếu tốdung lợng không thay đổi vì ảnh hởng của các chất khác

Việc tính toán diện tích Pic sẽ không gặp khó khăn khi Pic có cờng độ quácao hoặc quá loãng, không đối xứng và Đetecter bị nhiễu

III.2.2 Xác định chiều cao Pic.

- Khi Pic có dạng không đổi thì chiều cao Pic (khoảng cách giữa đờng nền

và đỉnh Pic) là một đại lợng tỷ lệ với diện tích và nó cũng có thể đợc dùng để đánhgiá sắc phổ

- Chiều cao Pic đợc xác định dễ dàng bằng tay vì thế nó là phơng pháp đợcchọn nếu sắc đồ đợc vẽ trên một máy ghi

- Một điều kiện để áp dụng việc đánh giá bằng chiều cao Pic là các chỉ số

K’ hằng định

- Để đo độ tuyến tính, việc đo chiều cao Pic chỉ thích hợp khi nồng độ mẫu

từ thấp đến trung bình Khoảng tuyến tính sẽ rộng hơn đối với các cấu tử đợc rữagiải chậm hơn so với trờng hợp các cấu tử này đợc rữa giải nhanh.

- Với các Pic có đờng nền bị nhiễu, việc xác định chiều cao Pic sẽ dễ dànghơn xác định diện tích Pic

III.2.4 Phơng pháp chuẩn ngoại.

- So sánh trực tiếp độ lớn của các tín hiệu (diện tích Pic hoặc chiều cao Pic)trong mẫu thử cho biết với một dung dich chuẩn của chất đó là một phơng phápphổ biến trong sắc kí

- Phơng pháp này yêu cầu bơm các thể tích xác định trong điều kiện sắc kí.Các chất đợc bơm vào dới dạng dung dich chuẩn có khoảng nồng độ nh trong mẫuthử

- Phơng pháp này có thể tiến hành ở các nồng độ khác nhau ( chuẩn hoámột điểm, 2 điểm, nhiều điểm) Trong phơng pháp chuẩn 1 điểm nồng độ của mẫu

S : độ lớn của Pic mẫu chuẩn

- Với phơng pháp xác định 2 điểm hay nhiều điểm, phân tích chuẩn phải

đ-ợc xác định đầu tiên Thờng đđ-ợc mô tả bằng đờng chuẩn thu đđ-ợc từ các điểm đo,cùng với Phơng pháp phân tích hồi quy

st o st

S = + S mC

o

S : Giao điểm của đờng chuẩn và trục tung

m: độ dốc của đờng chuẩn

Trong thí nghiệm này, nồng độ của mẫu thử đợc tính theo công thức sau:

a o a

S S C

- Để giảm sai số và đạt độ lặp lại cao trong định lợng bằng HPLC, ngời ta

sử dụng Phơng pháp chuẩn hoá với chất thứ hai thêm vào chất chuẩm ngoại vàmẫu thử Chất này gọi là chuẩn nội

- Trong cùng điều kiện sắc kí nó có thời gian lu gần thời gian lu của chấtcần phân tích trong mẫu thử Nó đợc tách hoàn toàn, và có nồng độ gần bằng nồng

độ của chất cần phân tích và có cấu trúc hoá học tơng ứng

- Độ nhạy của chất chuẩn nội và chất cần phân tích là khác nhau, vì thể yếu

tố hiệu chỉnh Fx phải đợc xác định đầu tiên với dung dịch chuẩn tinh khiết

Nếu gọi: Cx là nồng độ của dung dich chuẩn

Cis là nồng độ của dung dich chất chuẩn nội

Sx là độ lớn Pic chuẩn (chuẩn ngoại)

Sis là độ lớn Pic chuẩn nội

Thì:

.

is

is x x

x

S C F

S C

=

- Nếu yếu tố hiệu chỉnh Fx là hằng số trong vùng nồng độ nghiên cứu, nồng

độ Ca của một mẫu mà trong đó ngời ta thêm chất chuẩn nội có thể tính nh sau:

- Phơng pháp thêm chuẩn đợc sử dụng trong HPLC chủ yếu khi có vấn đề

ảnh hởng của chất phụ

- Dung dịch mẫu thử đợc thêm vào một lợng xác định chất chuẩn

- Các Pic thu đợc của cả 2 dung dich mẫu thử và mẫu thử thêm chất chuẩnphải đợc đo trong cùng một điều kiện sắc kí

- Phơng pháp thêm chất chuẩn có thể đợc thực hiện 1 lần, 2 lần, nhiều lần:+ Trong trờng hợp đơn giản nhất đối với một lần chất thêm chuẩn , nồng độcho biết của mẫu Ca đợc tính bằng sự chênh lệch nồng độ ∆c (lợng chất chuẩn

thêm vào) và độ tăng của độ lớn Pic ∆s theo công thức sau:

- u điểm của phơng pháp thêm chất chuẩn là có độ chính xác cao và loại trừ

đợc các yếu tố ảnh hởng khác Sự thay đổi về nhiệt độ, áp suất đã đợc mô tả bù trừtrong đồ thị chuẩn và ảnh hởng đến kết quả đo đạc

- Nhợc điểm: đòi hỏi nhiều thời gian phân tích vì phải chuẩn hoá đối vớitừng mẫu mà không chuẩn hoá định kỳ nh khi dùng Phơng pháp chuẩn ngoại

III.2.6 Phơng pháp quy về 100% diện tích Pic.

- Kỹ thuật này đơn giản nhng trong HPLC thì việc ứng dụng bị hạn chế, ờng hay đợc dùng trong sắc kí khí Nó đòi hỏi cấu tử trong hỗn hợp chất cần phântích đều đợc rửa giải và đợc phát hiện

th-.100

A X

=

+ +

%X: giá trị % của cấu tử X trong hỗn hợp X, Y, Z

AX, AY, AZ: diện tích Pic của cấu tử X, Y, Z

- Trong HPLC, các công thức này chỉ đúng khi sự đáp ứng của Detector trêncác cấu tử X, Y, Z là nh nhau Nếu không nh nhau, mỗi cấu tử cần có hệ số điềuchỉnh f(x), f(y), f(z)

c x x x

X c

A W f f

Phần II Thực nghiệm

I Dụng cụ - hoá chất

I.1 Dụng cụ:

I.1.1 Máy sắc kí:

- Máy sắc kí lỏng cao áp (HPLC của hãng Shimadzu Nhật Bản)

+ Detecter: uv/vis+ Cột tách: Lichrosorb RP 18 (5-10àm, 150 x 4 mm)

+ Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút+ Bớc sóng phát hiện: 550 nm+ Thể tích tiêm: 20àl

+ Cột nhồi Silicagel+ Pha tĩnh: SilicagelSơ đồ:

Thiết bị có thể hiện một khối hay nhiều khối riêng biệt lắp ráp vào nhau.Các bộ phận của thiết bị gồm:

+ (1), (4) Bộ phận kiểm tra bơm và chơng trình hoá

+ (2) Bình chứa dung môi

I.2 Hoá chất.

- Thuốc viên nén Vitamin 3B

- Dung dịch Cyanocobanlanic chuẩn: 5 àg/ml

- Etanol: 2%

- Nớc cất 2 lần

- Metanol: 2%

II Kỷ thuật sắc kí lỏng cao áp

- Sơ đồ sắc kí lỏng cao áp đợc mô tả trên Thiết bị gồm một bơm cao áp (3)

đẩy chất lỏng pha trộn qua cột tách, bình chứa dung môi (2), bộ phận bão hoàdung môi vật chất lỏng pha tĩnh hoặc với nớc (5) trớc khi vào cột tách để làmgiảm sự thay đổi tính chất của cột tách do pha động gây nên, bộ phận đa mẫu (7),cột tách (9) detecter (11), máy ghi 12

- Khi rữa giải Gradien ngời ta lắp ráp thêm bộ phận (1) và (4) để kiểm trabơm và chơng trình hoá áp suất vào cột tách đợc đo bằng áp kế 6 Cột tách và hệthống đa mẫu vào cột tách qua bộ phận bơm mẫu (7) Để chính xác ngời ta lắpthêm phân đoạn (14) để thu các cấu tử cần tách, bộ phận máy tính (13) để xử lýcác kết quả đo đạc do bộ phận ghi đa đến

- Khi sử dụng ta cần có kỹ thuật từ việc sử dụng bơm cho đến yêu cầu củapha động rồi tốc độ dòng, áp suất, cách đa mẫu vào cột tách, rồi cột tách, cột nhồiphải nh thế nào, cách sử dụng lợng mẫu, rồi cách tăng tốc độ, các loại detecter khidùng trong sắc kí lỏng cho hợp lý Vậy ta xét lần lợt các bộ phận

II.1 Bơm

Trong sắc kí lỏng cao áp, bơm áp suất cũng nh detecter là những bộ phận