Định lượng vitamin B12 bằng sắc ký lỏng cao áp

Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H TRNG I HC BCH KHOA H NI VIN CN SINH HC & CN THC PHM B MễN: CễNG NGH SINH HC ******************* TIU LUN MễN HC TI: nh lng vitamin B12 bng sc ký lng cao ỏp Sinh viờn thc hin H v tờn: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Lp: KTSH 01-K59 Ging viờn hng dn: PGS.TS Qun Lờ H H Ni, thỏng 05 nm 2017 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H Mở đầu: Vitamin nhóm chất hữu có phân tử lợng tơng đối lớn có chất lý, hoá học khác Nhóm chất hữu đặc biệt cần thiết cho hoạt động sống bình thờng thể sinh vật dị dỡng.Trong thể, Vitamin đảm nhiệm vai trò nh chất xúc tác Vitamin chất mà thể ngời tổng hợp đợc Phần lớn phải đa từ vào đờng ăn, uống Vitamin có tác dụng lợng nhỏ, đóng vai trò quan trọng đời sống ngời, chất xúc tác thiếu đợc chuyển hoá chất Nhu cầu Vitamin hàng ngày thể ít, nhng thiếu gây rối loạn trầm trọng, sinh bệnh kéo dài chết Cho đến ngời ta tách đợc khoảng 30 loại chất thuộc nhóm Vitamin, đa số đợc xác định đầy đủ cấu trúc hoá học nh tính chất lý hoá học sinh lý học Nguyên nhân thiếu Vitamin thờng thành phần thức ăn không đầy đủ thể mắc bệnh, không chuyển hoá đợc qua thức ăn Khi phải bù đắp Vitamin cho thể đờng dẫn thuốc thích hợp nh: uống, tiêm, truyền Cơ thể ngời thờng thiếu nhiều Vitamin lúc, nên điều trị cần phối hợp nhiều Vitamin Trừ A, D, E dùng liều cao dài ngày gây bệnh Vitamin thừa, thể tự đào thải qua mồ hôi, nớc tiểu Về cảnh giác thuốc, cần lu ý dùng liều định đờng dùng cho mồi Vitamin, nhiều có tác dụng không mong muốn (nh Vitamin PP, C, B1) Chính việc dùng Vitamin cẩn trọng nên phải ý dùng thuốc tiu lun ny em định lợng Vitamin B12 mu thuc viờn 3B trờn th trng kim chng nng ghi nhón Nhiệm vụ đề tài: Nghiên cứu điều kiện Sắc kí Vitamin B12 tồn hỗn hợp áp dụng điều kiện chọn để định lợng viên nén Vitamin 3B SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H Phần I Tổng quan I Vitamin B12 I.1 Nguồn gốc - Vitamin B12 loại Vitamin hầu nh độc đợc tổng hợp sinh vật - Thực vật chứa Vitamin B12, Vitamin B12 phát thấy lợng nhỏ hạt nguồn vi sinh vật phát triển bề mặt hạt - số loài tảo có Vitamin B12 vi sinh vật cộng sinh tạo - động vật, vi khuẩn ruột có khả tổng hợp Vitamin B12 cung cấp cho động vật chủ, sản phẩm động vật thờng giàu Vitamin B12 Gan, thịt, cá, trứng, sữa sản phẩm giàu Vitamin B12 - Năm 1948 thu đợc Vitamin B12 dạng kết tinh từ dịch gan I.2 Tính chất - Công thức nguyên: C63H88CoN14O14P - Khối lợng phân tử: 1355 - Vitamin B12 đợc dùng làm thuốc dạng chính: Cyanocobalamin Hyđroxocobalamin Riêng Hyđroxocobalamin đợc dùng dạng muối kết hợp với axit: axit axetic, axit sufuric, axit clohiđric Cấu trúc hoá học Cyanocobalamin Hyđroxocobalamin H2N COCH2 CH2 H Me CH2 CONH2 Me H2 NCOCH2 CH2 CH2 CONH2 CN Me H N N Me Co N Me H N N Me H H2 NCOCH2 N Me Me H Me CH2 CH2 CONH2 NH2 OO P N H H Me O H OH H O H H O CH2OH SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H Cyanocobalamin H2N COCH2 CH2 Me H CH2 CONH2 Me H2 NCOCH2 CH2 CH2 CONH2 o CN Me R H N N Me Co N Me H N N Me H H2 NCOCH2 N Me Me H Me CH2 CH2 CONH2 NH2 O- O H H OH O P N H H H O Me O O H CH2OH Hydroxo Cyanocobalamin H.axetat R CH3COOH H sunfat R H2SO4 H cloric R HCL - Vitamin B12 tồn dạng bột kết tinh tinh thể màu đỏ đậm - Hoà tan nớc etanol 96%, không hoà tan axeton ete - Dạng khan hút ẩm - Vitamin B12 bền tối nhiệt độ thờng; ánh sáng lại dễ dàng bị phân huỷ Bảng độ hấp thụ quang dạng 1% Dạng Cực đại hấp thụ (nm) Độ hấp thụ riêng ( E1cm ) Cyanocobalamin 278; 361; 550 361nm: 207 Hyđroxocobalamin axetat 274; 351; 525 351nm: 187 Hyđroxocobalamin sunfat 274; 351; 525 351nm: 188 Hyđroxocobalamin clorit 274; 351; 525 351nm: 190 - Vitamin B12 chuyển vào thể gắn với hợp chất glucoprotit dày để tạo nên phức hợp dễ hấp thụ cho thể - Vai trò Vitamin B12 đợc nghiên cứu nhiều, song chi tiết cha rõ + Nhiều dẫn liệu chứng minh tham gia vào trình tổng hợp protein thể SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H + Vitamin B12 thành phần coenzim, xúc tác cho trình tổng hợp protein + Vitamin B12 tham gia vào trao đổi hợp chất chứa cacbon thờng phối hợp, tác dụng với axit folic phản ứng metyl hoá; Ví dụ trình tổng hợp metionin từ homo xistin S S S + 2H (CH2)2 (Vitamin B12) CHNH2 (CH2)2 (CH2)2 CHNH2 CHNH2 COOH COOH HCHO AX tetra hydro folic COOH Homoxistein Homoxistin O S (CH2)2 C S H CH3 + 2H (CH2)2 (Vitamin B12) CHNH2 CHNH2 COOH COOH - Các phản ứng chuyển hoá Metyl hoá khác có tham gia Vitamin B12 phản ứng tổng hợp N-Metyl Nico Tiamit tổng hợp Creatin, - Vitamin B12 liên quan tới chuyển hoá hợp chất Sunfidryl, tham gia vào khử hợp chất Đisunfit thành hợp chất Sunfidryl trì hoạt tính Enzim chứa nhóm SH ảnh hởng tới trao đổi Protein, Gluxit nh Lipit - Khi bảo quản sản phẩm giàu Vitamin B12 nh: sữa, gan, trứng, ngời ta nhận thấy, hàm lợng Vitamin B12 sản phẩm thay đổi nhiều tuỳ SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H theo điều kiện xử lý trớc bảo quản bảo quản Những dẫn chứng cho ta biết: + Khi tiệt trùng sữa phơng pháp làm nóng trực tiếp (hoặc sục nớc vào sữa) gián tiếp (hấp thiết bị vô trùng) hao hụt Vitamin B12 thay đổi từ 40 - 20% Khi quấy sữa cô đặc không thêm đờng nhiệt độ thấp, sau năm khoảng 35% lợng Vitamin B12 + Trứng sản phẩm quan trọng phơng diện Vitamin nói chung Vitamin B12 nói riêng Trong tháng đầu bảo quản trứng, Vitamin B12 bền, trứng sau thời gian hàm lợng Vitamin B12 giảm rõ rệt tới 32% Sau năm lòng trắng trứng có Vitamin B12 Do trọng lợng phân tử Vitamin B12 lớn nên di chuyển từ lòng đỏ sang lòng trắng trình bảo quản - Trong kỹ nghệ, ngời ta lợi dụng khả sinh tổng hợp Vitamin B12 hàng loạt vi sinh vật, đặc biệt loại xạ khuẩn, nấm mốc loại Streptomyces, vi khuẩn lên men Propinic để sản xuất Vitamin B12 * Trong trình ủ thức ăn cho gia súc, vi sinh vật phát triển thức ăn tổng hợp đợc lợng đáng kể Vitamin B12 Thêm muối Cacbon vào nuôi cấy chúng thức ăn ủ kích thích tổng hợp Vitamin B12 - Vitamin B12 có ý nghĩa quan trọng chăn nuôi gia súc Nó làm tăng hấp thụ thức ăn Protein thực vật, tăng trởng tích luỹ mỡ Vitamin B12 làm tăng sinh sản đẻ trứng nở trứng gà mái Ngoài có dẫn liệu chứng minh tác dụng Vitamin B12 tăng lên nhiều phối hợp thêm vào thức ăn gia súc chất khoáng sinh Biomixin I.3 Công dụng - ngời, thiếu Vitamin B12 gây rối loạn sản xuất máu xơng, dẫn đến thiếu máu nguyên bào khổng lồ (Biermen) hồng cầu không trởng thành đợc - Theo nghiên cứu cho thấy: + phụ nữ mang thai có hàm lợng Vitamin B12 máu thấp, thai nhi dễ tật nứt đốt sống - tợng gây liệt chân chậm phát triển trí não trẻ + Uống bổ sung Vitamin B12 phơng pháp hữu hiệu để ngăn ngừa hội chứng Alzheimer (suy giảm trí nhớ) ngời cao tuổi + Nghiên cứu Israel cho thấy phụ nữ thiếu Vitamin B12 có nguy bị vô sinh hay sẩy thai liên tiếp Đa số họ có thai sinh bình thờng sau điều trị Vitamin B12 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H - Vitamin B12 thờng đợc dùng chữa chứng thiếu máu nguyên bào khổng lồ, rối loạn thần kinh, viêm đa dây thần kinh (thờng đợc dùng phối hợp với Vitamin B1, Vitamin B6) ngời nghiện rợu đái tháo đờng, đợc dùng cho bệnh nhân suy nhợc - Vitamin B12 có tác dụng tốt với nhiều trình, tham gia gia vào phản ứng tổng hợp Thymidylate, thành phần phân tử AND, cung cấp nguyên liệu để tổng hợp AND, góp phần vào trình phân chia trởng thành tế bào thể II Các phơng pháp định lợng Vitamin B12 II.1 Vitamin B12 thuốc đơn thành phần Hoà tan 25,00 mg chế phẩm nớc pha loãng đến 1000,0 ml dung môi Đo độ hấp thụ tử ngoại bớc sóng cực đại 361 nm Cyano Cobalamin 351 nm Hiđroxo Cobalamin, tính kết dựa vào độ hấp thụ riêng (E1%/1cm ) Phơng pháp xác, áp dụng cho chế phẩm, tá dợc tan nớc không hấp thụ tử ngoại II.2 Vitamin B12 thuốc đa thành phần II.2.1 Phơng pháp vi sinh vật Phơng pháp dựa vào nguyên tắc: Vitamin B12 làm phát triển nhanh chóng chủng vi sinh vật Lactobacililus bichmanic môi trờng điều kiện nuôi cấy thích hợp quy định, tiến hành song song với dãy mẫu chuẩn: 0.01ng đến 0.04 ng Vitamin B12 Để tính kết ngời ta đo độ đục mẫu thử mẫu chuẩn so với mẫu trắng chủng vi sinh vật đợc nuôi cấy môi trờng nuôi cấy Vitamin B12 Phơng pháp đợc sử dụng để định lợng Vitamin B12 chế phẩm có hàm lợng Vitamin B12 nhỏ : từ hàng ng đến hàng g/ viên, ml Tuy nhiên chủng vi sinh vật Lactobacililus bichmanic khó nuôi cấy Nên phòng thí nghiệm có đợc để thực phơng pháp phơng pháp hạn chế II.2.2 Phơng pháp quang phổ khả kiến Phơng pháp quang phổ khả kiến dùng để tính hay định lợng Vitamin B12 chế phẩm dợc Phơng pháp dựa nguyên tắc đo quang phổ bớc sóng khả kiến (548 nm) song song với chuẩn Dung dịch thử đợc chiết môi trờng Etanol 95 % làm để loại SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H bớt Vitamin B1 Vitamin B6 Không làm lạnh chiết môi trờng đệm Axetat Phơng pháp tính chọn lọc không loại trừ đợc chất màu, phẩm màu hồng thờng có chế phẩm vấn nhiều Vitamin B1, B6 mẫu thử Do phơng pháp áp dụng đợc với chế phẩm có hàm lợng Cyano cobanlamin lớn (trên 500 g/viên.ml) tá dợc chất màu II.2.3 Phơng pháp đo quang phổ tử ngoại - Phơng pháp dựa nguyên tắc đo quang phổ cực đại vùng tử ngoại 361 1nm, song song với chuẩn Dung dịch thử đợc chiết nhiều lần hỗn hợp Phenol + Butanol với Butanol môi trờng Axit Boric - Phơng pháp có khả áp dụng hạn chế kiểm nghiệm viên phải tiếp xúc lâu với dung môi độc Vitamin B1, B6 ảnh hởng lớn Chỉ nên áp dụng với chế phẩm có hàm lợng Cyano cobanlamin cao (từ 1000 g/viên,ml) II.2.4 Phơng pháp sắc kí định lợng Vitamin B12 Phơng pháp sắc kí phơng pháp để đạt tới việc định lợng Vitamin B12 nguyên liệu thiên nhiên, nh phơng pháp sắc kí lớp mỏng, phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao II.2.4.1 Sắc kí lớp mỏng Trong sắc kí lớp mỏng, trình tách hỗn hợp chất xẩy cho pha động chuyển qua pha tĩnh Chất hấp thụ (pha tĩnh) đợc rải thành lớp mỏng kính kim loại Trong trình chuyển giao chất hấp thụ, nhờ trình hấp thụ - giải hấp thụ đợc lặp lặp lại hệ số phân bố khác cấu tử đợc dịch chuyển lớp mỏng theo hớng chuyển động, với tốc độ khác Kết ta thu đợc sắc đồ lớp mỏng Sắc kí lớp mỏng đợc thực theo phơng pháp rửa giải Có thể tóm tắt nguyên tắc tiến hành nh sau: + Rải lớp chất hấp thụ kính (hoặc kim loại) chấm giọt dung dịch chất phân tích lên gần đầu mép lớp mỏng (điểm xuất phát) Sau đó, nhúng kính có lớp mỏng (bản mỏng) chất hấp thụ vào dung môi đến mức dới điểm xuất phát + Do tác dụng lực mao quản, đun thấm theo lớp mỏng giao điểm xuất phát Kết chất hỗn hợp đợc phân chia theo vùng riêng Sơ đồ tách sắc kí lớp mỏng SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H B A B A Điểm xuất phát a b Dung môi c II.2.4.2 Phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao Đợc dùng để tách Vitamin hoà tan nớc + Với Đelecter uv/vis + Cột tách: Lichrosorla 18 (5 - 10 m, 250 x mm) + Pha tĩnh (chất nhồi ) Silicagel + Dung môi: Meltanol + nớc (35: 65) + Tốc độ dòng: 1.5 ml/phút + Thể tích tiêm: 20 ml + Nồng độ dung dịch tiêm: 1mg/ml Phơng pháp có u điểm xác định nhanh tốt Vitamin lúc Hiện ngời ta thờng dùng phơng pháp kiểm định dợc phẩm II.2.5 Kết luận chọn phơng pháp phân tích Vitamin B12 Thông qua tổng quan phơng pháp xác định Vitamin B12 viên nén Vitamin3B, thấy phong phú Mỗi phơng pháp có u nhợc điểm riêng khả áp dụng khác - Phơng pháp vi sinh vật có độ chọn lọc độ nhạy cao nên áp dụng cho mẫu Vitamin 3B có hàm lợng Vitamin B12 nhỏ mà phơng pháp khác không định lợng đợc - Phơng pháp đo quang tử ngoại khả kiến áp dụng phòng kiểm nghiệm máy HPLC, với mẫu Vitamin3B có hàm lợng Vitamin B12 cao nhng đòi hỏi kỹ thuật chiết tách cao để tránh ảnh hởng Vitamin B1, B6 tá dợc chất màu SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H - Phơng pháp HPLC với chơng trình sắc kí lỏng pha đảo khác chiếm tỷ lệ lớn 80% số tiêu chuẩn sở thuốc 3B l u hành Phơng pháp HPLC có độ xác tin cậy cao, tiến hành đơn giản, khả áp dụng rộng rãi nhiều loại chế phẩm Với ý nghĩa này, đề tài đợc thực phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao Chúng hy vọng kết thu đợc đáp ứng yêu cầu phép phân tích có độ tin cậy cao III Một số vấn đề áp dụng phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao để xác định Vitamin B12 viên nén Vitamin 3B III.1 Cơ sở lý thuyết phơng pháp HPLC III.1.1 Khái niệm: Sắc kí lỏng hiệu cao phơng pháp chia tách pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất mang rắn đợc phân chia dới dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn, hay chất mang đợc biến đổi liên kết hoá học với nhóm hữu Quá trình sắc kí lỏng dựa chế hấp phụ, phân bố, trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ III.1.2 Nguyên tắc trình sắc kí cột - Pha tĩnh yếu tố quan trọng định chất trình sắc kí loại sắc ký + Nếu pha tĩnh chât hấp phụ ta có sắc kí hấp phụ pha thuận pha đảo + Nếu pha tĩnh chât trao đổi Ion ta có sắc kí trao đổi Ion + Nếu pha tĩnh chất lỏng ta có sắc kí phân bố hay sắc kí chiết + Nếu pha tĩnh gen ta có sắc kí gen hay sắc kí Rây phân tử - Cùng với pha tĩnh, để rữa giải chất phân tích khỏi cột, cần có pha động Nh ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C, vào cột tách, kết chất A, B, C, đợc tách khỏi sau qua cột Quyết định hiệu tách sắc kí tổng tơng tác III.1.3 Các đặc trng Pic sắc kí Đờng cong rữa giải (tín hiệu phụ thuộc thời gian) Sau trình sắc kí tách đợc gọi sắc đồ, thờng có dạng sau: 10 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H Trờng hợp giới hạn T = 0.42 Ví dụ hạt thuỷ tinh hệ pha thuận nghịch T = 0,75 Đờng kính hạt pha chất nhồi phải đợc kiểm tra biểu thức: DP = 41 FnL rP ( m) Chiều cao đĩa lý thuyết đợc H d2 p H = 3dp + + u n 16 u - thời gian chết ' Trong đó: P - áp suất (atm) Phơng trình cho chất rữa giải không phân cực với độ phân cực thấp nh n-heptan mẫu có phân tử lợng thấp nh Benzen, dẫn xuất benzen Dung lợng cột tách đa số trờng hợp khoảng 10 - 4g mẫu/gam pha động Khi tăng lợng mẫu, phụ thuộc vào chiều cao địa lý thuyết thời gian lu, việc xác định thời gian lu loại phơng pháp sắc kí khác Trong sắc kí lỏng cao áp chất nhồi quan trọng phổ biến Silicagen, sau axit nhồi, loại pha ngợc (RP-2, RP-8) Cột nhồi tốt (điều kiện hạt chất nhồi 30 - 40 m) tốc độ rữa giải 30cm/s chiều cao đĩa lý thuyết cột tách khoảng 1mm II.5 Lợng mẫu Lợng mẫu cực tiểu phụ thuộc vào độ nhạy detecter Dung lợng mẫu cột tách phụ thuộc vào chất nhồi cột Việc sử dụng chất nhồi lớp mỏng xốp làm giảm lợng mẫu Lợng mẫu, độ phân giải tốc độ phân tích có quan hệ với theo sơ đồ tam giác: 24 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H Tốc độ Tách phân tích A Lợng mẫu B Tách điều chế Độ phân giải Dung lợng mẫu cột tách phụ thuộc vào cột nhồi Các hạt xốp có bề mặt Dung lợng mẫu cột tách phụ thuộc vào chất nhồi hạt xốp so với loại không điển hình chất hấp phụ xốp có diện tích bề mặt đến 200 - 400 m 2/g chất hấp phụ xếp với chiều dài m đờng kính 2,1mm bơm vào khoảng -5 mg lợng mẫu u điểm lớn sắc kí lỏng cao áp so với sắc kí khí Việc sử dụng nhồi lớp mỏng xốp làm giảm lợng mẫu, thí dụ cột tách có điều kiện mm đợc nhồi với nhựa trao đổi ion 270 - 325 mest phủ hạt thuỷ tinh có dung lợng 10 -8 mol II.6 Pha tĩnh (hay gọi chất nhồi cột) Trong sắc kí lỏng cao áp pha tĩnh đóng vai trò quan trọng tạo nên tơng tác cần thiết để cấu tử tách khỏi Vì trao đổi pha tĩnh thông số làm việc cột ảnh hởng đến lực tơng tác trình tách, pha tĩnh có chế độ làm việc riêng Nhiệt độ ngỡng thấp đợc xác định điểm nóng chảy, nhiệt độ ngỡng cao đợc xác định áp suất độ bền nhiệt nó, nhiệt độ sử dụng làm pha tĩnh: tìm 700 chât Một vài ví dụ pha tĩnh: 25 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH Tên pha tĩnh ODS - Hypersil Lchrosorb RP 18 Lichrosorb RP18 Hypersil Parasil Lichrosorb - Si60 Zorbac - Sil Parasil Parasil 10 SCX Lichrosorb KAT Amines - A28 GVHD: PGS.TS Qun Lờ H Loại nhóm C18 C18 C18 C18 Trên Silica Silica Silica Silica Silica Silica Silica Silica Silica Silica Polime Loại pha Hấp phụ RP Hấp phụ RP Hấp phụ RP Hấp phụ RP Hấp phụ NP Hấp phụ NP Hấp phụ NP Hấp phụ NP Trao đổi ion Trao đổi ion Trao đổi ion II.7 Kỹ thuật tăng tốc II.7.1 Chơng trình dung môi Chơng trình dung môi Chơng trình dung môi làm giảm gía trị K (hệ số dung lợng) xuống 10 lần (K = Tr/To, TR thời gian lu pha tĩnh, To thời gian lu pha động) Trong trình rữa giải lực dung môi cố định, lợng kết hợp chất lại lâu cột tách thờng khó phát Pic chúng qua đơn giản nhiễu trôi đờng Có thể sử dụng loại detecter: hấp thụ tử ngoại, huỳnh quang với chơng trình dung môi ứng dụng chủ yếu với chơng trình dung môi (còn gọi rữa giải Gradien) nghiên cứu sơ thành phần tơng đối rộng phức tạp Rữa giải dung môi có u điểm: + Giảm thời gian phân tích rõ rệt + Độ phân giải chung dung dịch tăng lên + Pic sắc đồ nhọn + Độ nhạy tăng lên Tái sinh cột tách tăng giảm lực cách bơm pha ban đầu qua cột tách thu đợc hoạt động ban đầu II.7.2 Chơng trình tăng tốc độ dòng Khi tiến hành tốc độ dòng ngời ta thờng sử dụng tốc độ dòng thấp phần khởi đầu tách tăng tốc độ phần đầu So sánh chơng trình dung môi, chơng trình tốc đọ dòng có số u điểm sau: + Không phải tái sinh cột tách mà cần làm giảm tốc độ dòng đến giá trị ban đầu phải tiến hành trình bơm mẫu lần thứ hai 26 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H + Có thể sử dụng tất hệ sắc kí lỏng sử dụng chơng trình dung môi + Cả loại detecter chiết suất vi sai hấp thụ tử ngoại sử dụng đợc nhng phải kiểm tra xác Tốc độ dòng thờng vào khoảng 0,5 - ml/phút cho cột tách có điều kiện mm + 2ml/phút cho cột tách có điều kiện 3mm + 2-3 ml/ phút cho cột tách có điều kiện mm II.7.3 Chơng trình nhiệt độ Chơng trình nhiệt độ liên quan đến tăng nhiệt độ trình sắc kí Hiệu chơng trình nhiệu độ nhỏ so với chơng trình dung môi Kỷ thuật sử dụng sắc kí lỏng cao áp, dùng sắc kí thẩm thấu qua gen II.7.4 Ghép cột tách Kỷ thuật áp dụng trình tách có độ hiệu dụng cao Sau mẫu đợc đa vào cột tách thứ nhất, phân đoạn chon lọc đợc tách xa hay nhiều cột tách Bằng cách chọn chiều dài thích hợp sử dụng chất nhồi tơng ứng khác nhau, chất tan từ cột tách khác đợc điều chỉnh để rữa giải thời gian khác Kỷ thuật ghép cột tách cho phép phân giải vùng mong muốn trở nên tốt hơn, hợp chất với lợng nhỏ rữa giải thành Pic riêng cấu tử nặng đợc phát thời gian ngắn II.8 Các loại đetecter II.8.1 Đetecter uv/vis Đetecter hấp thụ tử ngoại (uv/vis) đợc sử dụng rộng rãi dễ vận hành phụ thuộc vào thay đổi nhiệt độ tốc độ dòng Nhng có nhợc điểm có khả phát mẫu chất hấp thụ vùng uv gần với bớc sóng đetecter chất rữa giải phải hoàn toàn không hấp thụ tử ngoại bớc sóng đetecte Với đetecter uv bớc sóng 254 nm có khoảng phát Hiđro cacbon vòng thơm Các axeton anđehit, hợp chất thơm phần lớn có khả hấp thụ vùng luận văn ngời ta sử dụng loại đetecter uv/vis + Phân tích bớc sóng: 550 nm + Độ xác bớc sóng: + Độ lặp lại bớc sóng: nm 0,1 nm 27 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H + áp suất: 110 atm/250 atm + Đèn: Deuterium + Nhiệt độ thao tác khoảng: - 400oC Ngoài loại đetecter uv/vis ngời ta sử dụng loại đetecter khác nhau: II.8.2 Đetecter chiết suất vi sai (RP) Nguyên tắc đetecter dựa khác số chiết suất dung dich dung môi nguyên chất II.8.3 Đetecter vận chuyển Ra đời với xuất Phơng pháp sắc kí lỏng cao áp Trớc phát mẫu dung môi rữa giải phải đợc loại trừ Muốn trớc qua lò nhiệt phân phận vận chuyển phải đợc làm đốt nóng để làm chảy hợp chất hữu sót lại bề mặt u điểm lớn đetecter trờng hợp lý tởng phát riêng mẫu II.8.4 Đetecter hấp thụ nhiệt Đetecter dựa sở đo nhiệt độ hấp thụ nhiệt giải hấp thụ Chất tan dòng chảy tiếp xúc với chất hấp thụ có phận đo nhiệt nhạy Bộ phận phải điều nhiệt tốt Sự thay đổi nhiệt độ khoảng 0.003oC II.8.5 Đetecter huỳnh quang Loại Đetecter đặc trng sử dụng phải ý nhiều so với Đetecter uv/vis khoảng tuyến tính lớn hơn, Nhng dùng dung môi hợp chất chứa oxy làm tắt huỳnh quang III Quy trình III.1 Pha dung môi (pha động) CH3OH 2% + H2O theo tỷ lệ 35:65 Lọc qua màng lọc 0,45 m Lắc siêu âm để đẩy hết khí hoà tan dung môi Điều kiện chạy sắc kí: + Máy sắc kí lỏng cao áp HPLC (của hãng ShiMadzu Nhật Bản) + Cột Lichrosorb RP 18 (5 - 10 m, 250x4mm) + Tốc độ dòng: 1.5 + Đetecter uv/vis: 550 nm + Thể tích tiêu: 20 l + Nhiệt độ cột: 25oC + áp suất ổn định: 884 - 910 III.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu (mẫu chuẩn, mẫu thử) 28 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H III.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Dung dịch Cyanocobanlamin chuẩn nớc, nồng độ l/ml, lọc qua màng 0,45 m Lắc siêu âm để đuổi hết bọt khí III.2.2 Chuẩn bị dung dich thử Rửa 20 viên bao Etanol, sấy khô, xác định khối lợng trung bình viên nghiền bột mịn Cân xác lợng bột thuốc tơng đơng với 250 g Cyanocobanlamin vào bình định mức 50ml Thêm 30 ml nớc cất, lắc siêu âm 10 phút, thêm nớc vừa đủ, lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc qua màng 0.45 m Khối lợng trung bình 20 viên: Ptb = 0.6712 (g) * Mẫu thử 1: Cân xác 1,3424 g thuốc cho vào bình định mức 50 ml thêm 30 ml nớc cất, lắc siêu âm 10 phút thêm nớc vừa đủ Lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc qua giấy lọc 0,45 m * Mẫu thử 2: Cân xác 1,3440 g thuốc cho vào bình định mức 50 ml thêm 30 ml nớc, lắc siêu âm 10 phút thêm nớc vừa đủ Lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc qua giấy lọc 0,45 m * Mẫu thử 3: Cân xác 1,3425 g thuốc cho vào bình định mức 50 ml thêm 30 ml nớc, lắc siêu âm 10 phút thêm nớc vừa đủ Lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc qua giấy lọc 0,45 m * Mẫu thử 4: Cân xác 1,3430 g thuốc cho vào bình định mức 50 ml thêm 30 ml nớc, lắc siêu âm 10 phút thêm nớc vừa đủ Lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc qua giấy lọc 0,45 m * Mẫu thử : Cân xác 1,3420 g thuốc cho vào bình định mức 50 ml thêm 30 ml nớc, lắc siêu âm 10 phút thêm nớc vừa đủ Lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc qua giấy lọc 0,45 m III.3 Chuẩn bị máy (HPLC SHIMADZU) Bớc 1: Bật hệ thống bao gồm: Bơm Water 1525, detecter uv/vis, Water 2478 (dual absorbance detecter), ổn định nhiệt, máy tính Bớc 2: làm việc với phơng pháp Method Bơm: Nạp thông số tốc độ dòng, chế độ dòng, nhiệt độ ổn định nhiệt, thích 29 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H Đetecter uv/vis: nạp thông số Analo A, B bỏ qua (chấp nhận) thông số sau đặt thông số xong ta phải ghi lại đặt tên cho phơng pháp vừa tạo save as/File Tên pp Method lên vùng làm việc Bớc 3: Chạy mẫu: Chú ý không để bọt khí lọt vào dòng dung môi tránh tợng giảm áp suất cách đột ngột toàn hệ thống Nếu có bọt khí hệ thống phải xả cho hết chạy mẫu Bớc 4: Đặt thông số Bớc 5: Xử lý liệu Bớc 6: Xem in báo cáo III.4 Định lợng Vitamin B12 hỗn hợp Vitamin 3B: B1, B6, B12 Cách tiến hành: III.4.1 Đối với mẫu chuẩn Tiến hành làm với mẫu chuẩn Mẫu 1: Tiêm lần Hút mẫu từ từ với bơm tiêu, chơng trình tự động cho lần tiên 10 phút xả máy tự động ngắt lại tiếp tục Lần 1: Vtiêm = 20 l, thời gian chạy 10 phút Lần 2: Vtiêm = 20 l, thời gian chạy 10 phút Lần 3: Vtiêm = 20 l, thời gian chạy 10 phút Lần 4: Vtiêm = 20 l, thời gian chạy 10 phút Mẫu 2: Tơng tự mẫu III.4.2 Đối với mẫu thử: có mẫu Một mẫu tiêm lần tỷ lệ nh tiêm mẫu chuẩn, chạy chơng trình điều kiện sắc kí, sau kết nối với máy tính xử lý peak in Ta có peak mẫu chuẩn nh sau: * Mẫu chuẩn 1: 30 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H * Mẫu chuẩn : Từ Peak ta thu đợc kết nh sau Mẫu chuẩn Thời gian lu Diện tích Peak ( àv *sec) 2.483 21425.8 2.479 21672.0 Chiều cao ( v) 1005 1003 Ta có Peak mẫu thử + Mẫu thử 1: 31 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H + Mẫu thử 2: + Mẫu thử 3: 32 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H + Mẫu thử 4: + Mẫu thử 5: 33 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH Mẫu thử Thời gian lu (min) 2.313 2.311 2.312 2.302 2.305 GVHD: PGS.TS Qun Lờ H Diện tích Peak ( àv *sec) 21879.3 22035.1 22959.3 22981.7 22521.8 III.4.3 Kết định lợng Mẫu thử Lợng cân (g) 1,3424 1,3440 1,3425 1,3430 1,3420 Lợng cân (g) Hàm lợng Vitamin B12 nhãn ( g/1 viên) 125 125 125 125 125 Hàm lợng VitaminB12 nhãn ( 1,3424 1,3440 1,3425 1,3430 1,3420 Diện tích peak ( v * Sec) g/1viên) 125 125 125 125 125 21879.3 22035.1 22959.3 22981.7 22521.8 Hàm lợng VitaminB12 xác định đợc Chiều cao ( v) 1290 1333 1428 1409 1355 Hàm lợng Vitamin B12 ( g/viên) 127,28 128,03 133,50 133,63 131,00 Hàm lợng % Xử lý thống kê ( g/1viên) 127,28 128,03 133,50 133,63 131,00 101,82 102,42 106,80 106,90 104,80 Trung bình 104,55% 34 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H Kết luận Trong luận văn thu đợc số kết sau: - Đã tổng quan đợc số vấn đề Vitamin B12 - Đã chọn đợc điều kiện để định lợng Vitamin B12 nằm viên nén Vitamin 3B phơng pháp sắc kí lỏng cao áp + Cột tách: Lichrosorb RP 18 (5 10 m, 250 x 4mm) + Pha động: Metanol + nớc (35: 65) + Pha tĩnh: Silicagel + Đetetơ: UV/VIS + Bớc sóng phát hiện: 550nm + Tốc độ dòng 1,5ml/phút + Thể tích tiêm 20 l - Đã xác định đợc hàm lợng Vitamin B12 viên nén Vitamin 3B, thời gian lu diện tích Pic mẫu thử khác 35 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H tài liệu tham khảo Hoá sinh công nghiệp NXB KH KT Lê Ngọc Tú Sắc kí lớp mỏng NXB y học 1974 Nguyễn Hữu Bảy Trần Trung Nam (dịch) Hoá sinh học NXB Giáo dục 1992 Trần Thị Phạm Thị Trân Châu Các phơng pháp sắc kí Hoàng Văn Lựu - ĐHV Các phơng pháp sắc kí NXB KH KT Đào Hữu Vinh Nguyễn Xuân Dũng Trần Thị Mỹ Linh Phạm Hùng Việt Xử lý số liệu thống kê PGS.TS Nguyễn Khắc Nghĩa - ĐHV Dợc điển Việt Nam NXB Y học 1976 Các kỹ thuật kiểm nghiệm thuốc nhiều thành phần Viện kiểm nghiệm Định lợng Vitamin NXB Y học 10 Bộ Y tế viện kiểm nghiệm, phân viện kiểm nghiệm Tập huấn kỹ thuật kiểm nghiệm thuốc 36 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H Mục lục Mở đầu Phần I Tổng quan tài liệu I VitaminB12 I.1 Nguồn gốc I.2 Tính chất 1.3 Cộng dụng II Các phơng pháp định lợng VitaminB12 II.1 VitaminB12 thuốc đơn thành phần II.2 VitaminB12 thuốc đa thành phần II.2.1 Phơng pháp vi sinh vật II.2.2 Phơng pháp quang phổ khả kiến II.2.3 Phơng pháp đo quang phổ tử ngoại II.2.4 Phơng pháp sắc kí định lợng VitaminB12 II.2.4.1 Sắc kí lớp mỏng II.2.4.2 Phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao II.2.5 Kết luận chọn phơng pháp phân tích VitaminB12 III Một số vấn đề áp dụng phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao để xác định VitaminB12 viên nén Vitamin3B III.1 Cơ sở lí thuyết phơng pháp HPLC III.1.1 Khái niệm III.1.2 Nguyên tắc trình sắc kí cột III.1.3 Các đặc trng Pic sắc kí III.1.3.1 Thời gian lu tR III.1.3.2 Hệ số dung lợng k III.1.3.3 Độ chọn lọc III.1.3.4 Số đĩa lí thuyết N III.1.3.5 Độ phân giải R III.1.3.6 Hệ số không đối xứng T III.2 Đánh giá Pic (diện tích, chiều cao) phơng pháp định lợng thờng dùng HPLC III.2.1 Đánh giá diện tích Pic III.2.2 Xác định chiều cao Pic III.2.3 Phơng pháp chuẩn ngoại III.2.4 Phơng pháp chuẩn nội III.2.5 Phơng pháp thêm chuẩn III.2.6 Phơng pháp quy 100% diện tích Pic Phần II Thực nghiệm I Dụng cụ hoá chất I.1 Dụng cụ I.1.1 Máy sắc kí I.1.2 Các dụng cụ khác I.2 Hoá chất II Kỹ thuật sắc kí lỏng cao áp II.1 Bơm II.2 Pha động, tốc độ dòng, áp suất II.3 Đa mẫu vào cột tách II.4 Cột tách II.5 Lợng mẫu II.6 Pha tĩnh Trang 3 3 8 8 9 10 11 11 12 12 12 12 13 14 14 15 15 15 16 17 17 17 18 19 20 21 22 22 22 22 23 23 23 24 25 27 28 30 31 37 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 Hc phn: PPPT CNSH GVHD: PGS.TS Qun Lờ H II.7 Kỹ thuật tăng tốc II.7.1 Chơng trình dung môi II.7.2 Chơng trình tăng tốc độ dòng II.7.3 Chơng trình nhiệt độ II.7.4 Gép cột tách II.8 Các loại đetecter II.8.1 Đetecter uv/vis II.8.2 Đetecter chiết suất vi sai II.8.3 Đetecter vận chuyển II.8.4 Đetecter hấp thụ nhiệt II.8.5 Đetecter huỳnh quang III Quy trình III.1 Pha dung môi III.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu III.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn III.2.2 Chuẩn bị dung dịch thử III.3 Chuẩn bị máy III.4 Định lợng VitaminB12 hỗn hợp Vitamin3B III.4.1 Đối với mẫu chuẩn III.4.2 Đối với mẫu thử III.4.3 Kết định lợng Kết luận Tài liệu tham khảo 32 32 33 33 33 34 34 34 35 35 35 35 35 36 36 36 37 37 37 38 42 43 44 38 SVTH: Trn Quang ụn MSSV: 20141060 ... pháp sắc kí định lợng Vitamin B12 Phơng pháp sắc kí phơng pháp để đạt tới việc định lợng Vitamin B12 nguyên liệu thiên nhiên, nh phơng pháp sắc kí lớp mỏng, phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao. .. cậy cao III Một số vấn đề áp dụng phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao để xác định Vitamin B12 viên nén Vitamin 3B III.1 Cơ sở lý thuyết phơng pháp HPLC III.1.1 Khái niệm: Sắc kí lỏng hiệu cao. .. viên nén Vitamin 3B - Dung dịch Cyanocobanlanic chuẩn: g/ml - Etanol: 2% - Nớc cất lần - Metanol: 2% II Kỷ thuật sắc kí lỏng cao áp - Sơ đồ sắc kí lỏng cao áp đợc mô tả Thiết bị gồm bơm cao áp (3)