Đang tải... (xem toàn văn)
Xác định vitamin E (dạng alphatocopheryl acetate) bằng sắc ký lỏng pha đảo (HPLCDAD) trên các sản phẩm 1.2. Phạm vi Dùng để xác định vitamin E (dạng alphatocopheryl acetate) có trong sản phẩm viên nang mềm thành phần có chứa vitamin E (dạng alphatocopheryl acetate). 1.3. Nguyên tắc Sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao, đầu dò DAD để phát hiện vitamin E (dạng alphatocopheryl acetate) dựa vào sắc đồ tính toán nồng độ các chất dựa vào phương pháp đường chuẩn.
PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN E (ALPHATOCOPHERYLACETATE)B ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO HPLC MỤC ĐÍCH, PHẠM VI VÀ NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP 1.1 Mục đích Xác định vitamin E (dạng alphatocopheryl acetate) sắc ký lỏng pha đảo (HPLCDAD) sản phẩm 1.2 Phạm vi - Dùng để xác định vitamin E (dạng alphatocopheryl acetate) có sản phẩm viên nang mềm thành phần có chứa vitamin E (dạng alphatocopheryl acetate) 1.3 Nguyên tắc - Sử dụng máy sắc ký lỏng hiệu cao, đầu dò DAD để phát vitamin E (dạng alphatocopheryl acetate) dựa vào sắc đồ tính tốn nồng độ chất dựa vào phương pháp đường chuẩn TÀI LIỆU THAM KHẢO - Dược điển Việt Nam IV QUY TRÌNH 3.1 Thuốc thử thiết bị 3.1.1 Thuốc thử 3.1.1.1Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước có điện trở suất khơng nhỏ 18 MΩ cm 3.1.1.2 Methanol (Merk) 3.1.1.3 Chloroform (độ tinh khiết ≥97%) 3.1.1.4 Ethanol tuyệt đối (Merk) Chất chuẩn vitamin E (DL-alphatocopherol acetate 3.1.2 Thiết bị: Các thiết bị, dụng cụ sử dụng phải thiết bị sử dụng bình thường, hạn hiệu chuẩn, kiểm tra hàng ngày 3.1.2.1 Máy sắc ký lỏng hiệu cao HPLC, đầu dò DAD 3.1.2.2 Máy ly tâm 3.1.2.3 Máy lắc voltex 3.1.2.4 Máy rung siêu âm 3.1.2.5 Máy đo pH 3.1.2.6 Cân phân tích (0, 0000g) 3.1.2.7 Bình định mức 100mL nâu class A PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN E (ALPHATOCOPHERYLACETATE)B ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO HPLC 3.1.2.8 Bình định mức 50 mL, 20 mL nâu class A 3.1.2.9 Ống fancol 50ml (loại có chia vạch) 3.1.2.10 Pipet xác 2,4,8 mL class AS 3.1.2.11 Micropipet 100-1000µL 3.1.2.12 Ống kim tiêm nhựa 6mL, đầu lọc 0.45µm 3.1.2.13 Vial nâu 1.5 mL (nắp hở có lớp lót mềm), làm sạch, sấy khô 3.1.2.14 Giấy lọc định lượng gấp quạt 3.2 Điều kiện sắc ký - Cột C18 (5µm, 250 x 4,6 mm) - Pha động: Methanol (thêm H2O cần khoảng 2%) - Tốc độ dòng: 2,0 mL/phút - Thể tích tiêm mẫu: 20 µL - Detector DAD: 284 nm Khoảng quét từ 200-400 nm - Dung môi pha mẫu: Ethanol (3.1.1.4) 3.3 Chuẩn bị dung dịch thử dung dịch chuẩn 3.3.1 Dựng đường chuẩn 3.3.1.1 Dung dịch chuẩn gốc • Cân xác 100 mg vitamin E chuẩn (3.1.1.5) vào bình định mức 100 mL, thêm 20 mL dung dịch Ethanol tinh khiết (3.1.1.4) lắc cho tan hết rung siêu âm từ 10-15 phút, thêm dung môi Ethanol (3.1.1.4) vừa đủ 100 mL, trộn Dung dịch chuẩn gốc pha có nồng độ mg/mL Dung dịch pha sử dụng tháng bảo quản nhiệt độ từ 2-80C 3.3.1.2 Pha từ chuẩn gốc vitamin E để dãy chuẩn làm việc vitamin E nồng độ 0,02; 0,04; 0,1; 0,2; 0,4 mg/mL Hỳt ln lt 400 àL ca dung dch chuẩn gốc vitamin E (3.2.1.1) vào bình 20 mL định mức đến vạch Ethanol tinh khiết (3.1.1.4) dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 0,02 mg/mL Sử dụng dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45 µm vào vial (3.1.1.13) (đổ khoảng 2/3 vial) Dung dịch pha sử dụng ngày, • bảo quản nhiệt độ 2-8 0C Hút 800 µL dung dịch chuẩn gốc vitamin E (3.2.1.1) vào bình 20 mL định mức đến vạch Ethanol tinh khiết (3.1.1.4) dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 0,04 mg/mL Sử dụng dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN E (ALPHATOCOPHERYLACETATE)B ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO HPLC µm vào vial (3.1.1.13) (đổ khoảng 2/3 vial) Dung dịch pha sử dụng ngày, • bảo quản nhiệt độ 2-8 0C Hút mL dung dịch chuẩn gốc vitamin E (3.2.1.1) vào bình 20 mL định mức đến vạch Ethanol tinh khiết (3.1.1.4) dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 0,1 mg/mL Sử dụng dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45 µm vào vial (3.1.1.13) (đổ khoảng 2/3 vial) Dung dịch pha sử dụng ngày, • bảo quản nhiệt độ 2-8 0C Hút mL dung dịch chuẩn gốc vitamin E (3.2.1.1) vào bình 20 mL định mức đến vạch Ethanol tinh khiết (3.1.1.4) dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 0,2 mg/mL Sử dụng dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45 µm vào vial (3.1.1.13) (đổ khoảng 2/3 vial) Dung dịch pha sử dụng ngày, • bảo quản nhiệt độ 2-8 0C Hút mL dung dịch chuẩn gốc vitamin E (3.2.1.1) vào bình 20 mL định mức đến vạch Ethanol tinh khiết (3.1.1.4) dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 0,4 mg/mL Sử dụng dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45 µm vào vial (3.1.1.13) (đổ khoảng 2/3 vial) Dung dịch pha sử dụng ngày, bảo quản nhiệt độ 2-8 0C 3.3.2 Dung dịch thử - Chế phẩm dạng viên nang mềm: • Cân xác định khối lượng 20 viên nang Dùng dao nhọn hay phương tiện khác mở nang cho không bị thất mảnh vỏ nang Chuyển tồn lượng thuốc nang vào cốc có mỏ 100 mL Rửa vỏ nang clorofoc (3.1.1.3) làm khô vỏ nang tủ hút khơng ngửi thấy mùi dung môi Cân xác định khối lượng 20 vỏ nang, tính khối lượng trung bình thuốc viên nang • Với mẫu thử biết hàm lượng vitamin E (hàm lượng ghi nhãn) Cân xác (đến 0.01g) lượng mẫu thử(*) vào ống fancol 50 mL, thêm 1-2 mL clorofoc (3.1.1.3) để phân tán dầu, lắc voltex phút, thêm 10ml Ethanol (3.1.1.4), lắc voltex phút, cho ly tâm 3000v/ phút, gạn lớp vào bình 50mL, lăp lại trình tối thiểu lần Dịch thu cho vào bình định mức 50 mL, định mức đến vạch, trộn Lọc qua giấy lọc (3.2.2.13) thấm ướt Ethanol (nếu cần) Bỏ 5-10 mL dịch lọc ban đầu o o PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN E (ALPHATOCOPHERYLACETATE)B ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO HPLC o • o o o Sử dụng dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45 µm (3.2.2.11) vào vial khoảng 2/3 vial (3.2.2.12) Với mẫu chưa biết hàm lượng vitamin E ghi nhãn Cân xác 3,0 g mẫu thử cho vào ống fancol 50 mL, thêm 1-2 mL clorofoc (3.1.1.3) để phân tán dầu, lắc voltex phút thêm 10 mL Ethanol (3.1.1.4), lắc voltex phút, cho ly tâm 3000v/5 phút, gạn lớp vào bình 50 mL, lăp lại trình tối thiểu lần Dịch thu cho vào bình định mức 50 mL, định mức đến vạch Lọc qua giấy lọc (3.2.2.13) thấm ướt Ethanol (nếu cần) Bỏ 5-10 mL dịch lọc ban đầu Sử dụng dụng cụ lọc mẫu lọc qua màng lọc 0,45 µm (3.2.2.11) vào vial khoảng 2/3 vial (3.2.2.12) Nếu hàm lượng tìm thấy khơng nằm đường chuẩn, pha lỗng với tỷ lệ thích hợp 3.4 Quy trình thao tác 3.4.1 Với mẫu biết hàm lượng alphatocopheryl acetate ghi nhãn - Tiêm dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ 200µg/mL vào hệ thống sắc ký - Tiêm dung dịch thử chuẩn bị (mẫu biết hàm lượng) có nồng độ khoảng 200µg/mL vào hệ thống sắc ký - Tính tốn dựa diện tích peak thu từ chuẩn thử 3.4.2 Với mẫu chưa biết hàm lượng alphatocopheryl acetate Tiêm chuẩn làm việc có nồng độ 20; 40; 100; 200; 400 µg/mL (3.2.1.2) vào hệ thống sắc ký Từ diện tích peak sắc ký thu được, dựng đường chuẩn y=ax+b Tiêm dung dịch thử lọc vào hệ thống sắc ký thu diện tích peak y thay vào đường chuẩn tìm x1 (x1 nồng độ alphatocopheryl acetate có dung dịch thử) 3.5 Kiểm sốt chất lượng Lặp lại tối thiểu lần thử, gía trị báo cáo trung bình lần thử nghiệm cho gía trị RSD thu thỏa mãn yêu cầu (Xem bảng 1) o STT Hàm lượng % 100 10 Tỷ lệ chất 10-1 Đơn vị 100% 10% RSD% 1.3 1.8 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN E (ALPHATOCOPHERYLACETATE)B ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO HPLC 10 10-2 1% -3 0.1 10 0.1% 0.01 10-4 100 ppm 0.001 10-5 10 ppm -6 0.0001 10 ppm -7 0.00001 10 100 ppb -8 0.000001 10 10 ppb -9 0.0000001 10 ppb Bảng 1: RSD (%) yêu cầu theo AOAC 2.7 3.7 5.3 7.3 11 15 21 30 BÁO CÁO KẾT QUẢ Định tính: Phổ đồ dung dich chuẩn vitamin Phổ đồ dung dich thử Kết quả: Sắc ký đồ dung dịch thử phần định lượng cho peak có cùng/khơng thời gian lưu với peak sắc ký đồ dung dịch chuẩn - Định lượng: Điều kiện sắc ký: - - Cột: (Cột số …) - Pha động: - Tốc độ dòng: - Thể tích tiêm: - Detector: - Dung dịch chuẩn: - Dung dịch thử: Cơng thức tính: - Hàm lượng vitamin E thực phẩm chức dạng cốm, viên nang tính theo cơng thức: Ct×Kt X(mg/ống/chai)= ×mtb×HLc×(100-HLH2O) mt Trong đó: kT: Hệ số pha lỗng dung dịch thử mT: Khối lượng chế phẩm cân(g) HLC: Hàm lượng chuẩn (vitamin E) PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN E (ALPHATOCOPHERYLACETATE)B ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO HPLC HLHOH: Hàm nước có chuẩn (vitamin E) mTB: Khối lượng trung bình viên (đã bỏ vỏ bao, vỏ nang) ... Hệ số pha lỗng dung dịch thử mT: Khối lượng chế phẩm cân(g) HLC: Hàm lượng chuẩn (vitamin E) PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN E (ALPHATOCOPHERYLACETATE)B ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO HPLC HLHOH: Hàm nước... PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN E (ALPHATOCOPHERYLACETATE)B ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO HPLC 3.1.2.8 Bình định mức 50 mL, 20 mL nâu class A 3.1.2.9 Ống fancol 50ml (loại có chia vạch) 3.1.2.10 Pipet xác 2,4,8... lọc qua màng lọc 0,45 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VITAMIN E (ALPHATOCOPHERYLACETATE)B ẰNG SẮC KÝ LỎNG PHA ĐẢO HPLC µm vào vial (3.1.1.13) (đổ khoảng 2/3 vial) Dung dịch pha sử dụng ngày, • bảo quản nhiệt