Định lượng vitamin b12 bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp

Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn này, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy giáo Th.S Nguyễn Quang Tuệ, cảm ơn thầy đà giao đề tài hớng dẫn tận tình, chu đáo suốt trình thực đề tài Trong trình nghiên cứu, hoàn thành đề tài em nhận đợc quan tâm, ủng hộ thầy cô giáo giảng dạy tất chuyên ngành khoa anh chị phòng kiểm nghiệm Dợc phẩm thuộc công ty CP Dợc thiết bị y tế Hà Tĩnh đà tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình thực đề tài Cuối em xin gửi tới gia đình, bạn bè lòng biết ơn tất đà làm cho em Em xin chân thành cảm ơn! Vinh, tháng 5/2006 Sinh viên: Lê Minh Đức Chuyên ngành hoá phân tích Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức Mở đầu: Vitamin nhóm chất hữu có phân tử lợng tơng đối lớn có chất lý, hoá học khác Nhóm chất hữu đặc biệt cần thiết cho hoạt động sống bình thờng thể sinh vật dị dỡng Tuy nhiên, tác dụng sinh lý Vitamin lên thể động vật, thực vật vi sinh vật khác So với nhu cầu chất dinh dỡng nh Protein, Lipit, Gluxit nhu cầu Vitamin thấp Trong thể, Vitamin đảm nhiệm vai trò nh chất xúc tác Vitamin chất mà thể ngời tổng hợp đợc Phần lớn phải đa từ vào đờng ăn, uống Vitamin có tác dụng lợng nhỏ, đóng vai trò quan trọng đời sống ngời, chất xúc tác thiếu đợc chuyển hoá chất Nhu cầu Vitamin hàng ngày thể ít, nhng thiếu gây rối loạn trầm trọng, sinh bƯnh vµ nÕu kÐo dµi cã thĨ chÕt Trong năm gần ngời ta đà chứng minh Vitamin cần thiết cho thể tự dỡng nh thực vật đối tợng có khả tổng hợp nên hầu hết Vitamin Thật mét sè bé phËn cđa thùc vËt xanh kh«ng cã khả tổng hợp Vitamin, cần cung cấp thêm cho chúng số Vitamin để đảm bảo cho sinh trởng phát triển chúng Cho đến ngời ta đà tách đợc khoảng 30 loại chất thuộc nhóm Vitamin, đa số đà đợc xác định đầy đủ cấu trúc hoá học nh tính chất lý hoá học sinh lý học Về cách gọi tên, Vitamin ngời ta trì gọi theo kiểu khác nhau, kiểu thứ dựa theo tác dụng sinh lý Vitamin: thêm chữ anti (chống) vào bệnh đặc trng tợng thiếu Vitamin, kiểu thứ 2: dùng chữ để đặt tên, kiểu thứ dựa cầu trúc hoá học, có xu hớng gọi tên hoá học nhiều Nguyên nhân thiếu Vitamin thờng thành phần thức ăn không đầy đủ thể mắc bệnh, không chuyển hoá đợc qua thức ăn Khi phải bù đắp Vitamin cho thể đờng dẫn thuốc thích hợp nh: uống, tiêm, Chuyên ngành hoá phân tích Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức truyền Cơ thể ngời thờng thiếu nhiều Vitamin lúc, nên điều trị cần phối hợp nhiều Vitamin Trõ A, D, E dïng liỊu cao vµ dµi ngày gây bệnh Vitamin thừa, thể tự đào thải qua mồ hôi, nớc tiểu Về cảnh giác thuốc, cần lu ý dùng liều định đờng dùng cho mồi Vitamin, nhiều có tác dụng không mong muốn (nh Vitamin PP, C, B1) Chính việc dùng Vitamin cẩn trọng nên phải ý dùng thuốc luận văn định lợng Vitamin B12 viên thuốc tổng hợp Vitamin 3B (B1, B6, B12) để xác định rõ xem hàm lỵng cđa Vitamin B12 thc cã phï hỵp víi nhÃn không luận văn xin chọn phơng pháp Sắc kí lỏng cao áp Sắc kí lỏng cao áp phơng pháp đại cho ta biết kết nhanh xác, tiết kiệm đợc thời gian lợng mẫu cần dùng Với khuôn khổ luận văn thời gian ngắn nên đề tài định lợng đợc Vitamin B12 viên Vitamin 3B Nhiệm vụ đề tài: Nghiên cứu điều kiện Sắc kí Vitamin B12 tồn hỗn hợp áp dụng điều kiện đà chọn để định lợng viên nén Vitamin 3B Chuyên ngành hoá phân tích Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức Phần I Tổng quan tài liệu I Vitamin B12 I.1 Nguồn gốc - Vitamin B12 loại Vitamin hầu nh độc đợc tổng hợp sinh vËt - Thùc vËt chØ chøa rÊt Ýt Vitamin B12, Vitamin B12 phát thấy lợng nhỏ hạt nguồn vi sinh vật phát triển bề mặt hạt - số loài tảo có Vitamin B12 vi sinh vật cộng sinh tạo - động vật, vi khuẩn ruột có khả tổng hợp Vitamin B12 cung cấp cho động vật chủ, sản phẩm động vật thờng giàu Vitamin B12 Gan, thịt, cá, trứng, sữa sản phẩm giàu Vitamin B12 - Năm 1948 thu đợc Vitamin B12 dạng kết tinh từ dịch gan I.2 Tính chất - Công thức nguyên: C63H88CoN14O14P - Khối lợng phân tử: 1355 - Vitamin B12 đợc dùng làm thuốc dạng chính: Cyanocobalamin Hyđroxocobalamin Riêng Hyđroxocobalamin đợc dùng dạng mi kÕt hỵp víi axit: axit axetic, axit sufuric, axit clohiđric Cấu trúc hoá học Cyanocobalamin Hyđroxocobalamin Chuyên ngành hoá phân tích Khoá luận tốt nghiệp H2N COCH2 CH2 Lê Minh Đức Me H CH2 CONH2 Me H2 NCOCH2 CH2 CH2 CONH2 CN Me H N N Me Co N Me H N N Me H H2 NCOCH2 N Me Me H Me CH2 CH2 CONH2 NH2 OO P N H H H O O H H O Me H OH CH2OH Cyanocobalamin H2N COCH2 CH2 Me H CH2 CONH2 Me H2 NCOCH2 CH2 CH2 CONH2 o CN Me R H N N Me Co N Me H N N Me H H2 NCOCH2 N Me Me H Me CH2 CH2 CONH2 NH2 O- O H H OH O P N H H H O Me O O H Hydroxo Cyanocobalamin H.axetat R CH3COOH Chuyên ngành hoá phân tích CH2OH Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức H sunfat R H2SO4 H cloric R HCL - Vitamin B12 tồn dạng bột kết tinh tinh thể màu đỏ ®Ëm - Hoµ tan níc vµ etanol 96%, không hoà tan axeton ete - Dạng khan rÊt hót Èm - Vitamin B12 bỊn tèi vµ nhiệt độ thờng; ánh sáng lại dễ dàng bị phân huỷ - Vitamin B12 có tính hấp thụ quang lớn Cực đại hấp thụ riêng có kh¸c chót Ýt cã sù kh¸c vỊ cầu trúc nh khối lợng phân tử dạng Bảng độ hấp thụ quang dạng 1% Dạng Cực đại hấp thụ (nm) Độ hấp thụ riêng ( E1cm ) Cyanocobalamin 278; 361; 550 ë 361nm: 207 Hy®roxocobalamin axetat 274; 351; 525 ë 351nm: 187 Hy®roxocobalamin sunfat 274; 351; 525 ë 351nm: 188 Hy®roxocobalamin clorit 274; 351; 525 351nm: 190 - Vitamin B12 chuyển vào thể gắn với hợp chất glucoprotit dày để tạo nên phức hợp dễ hấp thụ cho thể - Vai trò Vitamin B12 đợc nghiên cứu nhiều, song chi tiết cha râ + NhiỊu dÉn liƯu ®· chøng minh r»ng nã tham gia vào trình tổng hợp protein thể + Vitamin B12 thành phần coenzim, xúc tác cho trình tổng hợp protein + Vitamin B12 tham gia vào trao đổi hợp chất chứa cacbon thờng phối hợp, tác dụng với axit folic phản ứng metyl hoá; Ví dụ trình tổng hợp metionin từ homo xistin Chuyên ngành hoá phân tích Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức S S S + 2H (CH2)2 (Vitamin B12) CHNH2 (CH2)2 (CH2)2 CHNH2 CHNH2 COOH COOH HCHO AX tetra hydro folic COOH Homoxistein Homoxistin O S (CH2)2 C S CH3 + 2H H (CH2)2 (Vitamin B12) CHNH2 CHNH2 COOH COOH - Các phản ứng chuyển hoá Metyl hoá khác có tham gia Vitamin B12 phản ứng tổng hợp N-Metyl Nico Tiamit tổng hợp Creatin, - Vitamin B12 liên quan tới chuyển hoá hợp chất Sunfidryl, tham gia vào khử hợp chất Đisunfit thành hợp chất Sunfidryl trì hoạt tính Enzim chứa nhóm SH ¶nh hëng tíi sù trao ®ỉi Protein, Gluxit cịng nh Lipit - Khi bảo quản sản phẩm giàu Vitamin B12 nh: s÷a, gan, trøng, ngêi ta nhËn thÊy, hàm lợng Vitamin B12 sản phẩm thay ®ỉi Ýt nhiỊu t theo ®iỊu kiƯn xư lý tríc bảo quản bảo quản Những dẫn chøng cho ta biÕt: + Khi tiƯt trïng s÷a b»ng phơng pháp làm nóng trực tiếp (hoặc sục nớc vào sữa) gián tiếp (hấp thiết bị vô trùng) hao hụt Vitamin B12 thay đổi từ 40 - 20% Khi quấy sữa cô đặc không thêm đờng nhiệt độ thấp, sau năm khoảng 35% lợng Vitamin B12 + Trứng sản phẩm quan trọng phơng diện Vitamin nói Chuyên ngành hoá phân tích Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức chung Vitamin B12 nói riêng Trong tháng đầu bảo quản trứng, Vitamin B12 bền, trứng sau thời gian hàm lợng Vitamin B12 giảm rõ rệt tới 32% Sau năm lòng trắng trứng có Vitamin B12 Do trọng lợng phân tử Vitamin B12 lớn nên di chuyển từ lòng đỏ sang lòng trắng trình bảo quản - Trong kỹ nghệ, ngời ta lợi dụng khả sinh tổng hợp Vitamin B12 hàng loạt vi sinh vật, đặc biệt loại xạ khuẩn, nấm mốc loại Streptomyces, vi khuẩn lên men Propinic để sản xuất Vitamin B12 * Trong trình ủ thức ăn cho gia súc, vi sinh vật phát triển thức ăn tổng hợp đợc lợng đáng kể Vitamin B12 Thêm muối Cacbon vào nuôi cấy chúng thức ¨n đ kÝch thÝch sù tỉng hỵp Vitamin B12 - Vitamin B12 có ý nghĩa quan trọng chăn nuôi gia súc Nó làm tăng hấp thụ thức ¨n Protein thùc vËt, t¨ng trëng vµ tÝch l mì Vitamin B12 làm tăng sinh sản đẻ trứng nở trứng gà mái Ngoài có dÉn liƯu chøng minh r»ng t¸c dơng cđa Vitamin B12 tăng lên nhiều phối hợp thêm vào thức ¨n cđa gia sóc mét Ýt chÊt kho¸ng sinh Biomixin I.3 C«ng dơng - ë ngêi, thiÕu Vitamin B12 sÏ gây rối loạn sản xuất máu xơng, dẫn đến thiếu máu nguyên bào khổng lồ (Biermen) hồng cầu không trởng thành đợc - Theo nghiên cứu cho thấy: + phụ nữ mang thai có hàm lợng Vitamin B12 máu thấp, thai nhi dễ tật nứt đốt sống - tợng gây liệt chân chậm phát triển trí nÃo trẻ + Uống bổ sung Vitamin B12 phơng pháp hữu hiệu để ngăn ngừa hội chøng Alzheimer (suy gi¶m trÝ nhí) ë ngêi cao ti + Nghiên cứu Israel cho thấy phụ nữ thiếu Vitamin B12 có nguy bị vô sinh hay sẩy thai liên tiếp Đa số họ đà có thai sinh bình thờng sau Chuyên ngành hoá phân tích Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức điều trị Vitamin B12 - Vitamin B12 thờng đợc dùng chữa chứng thiếu máu nguyên bào khổng lồ, rối loạn thần kinh, viêm đa dây thần kinh (thờng đợc dùng phối hợp với Vitamin B1, Vitamin B6) ngời nghiện rợu đái tháo đờng, đợc dùng cho bệnh nhân suy nhợc - Vitamin B12 có tác dụng tốt với nhiều trình, tham gia gia vào phản ứng tổng hợp Thymidylate, thành phần phân tử AND, cung cấp nguyên liệu để tổng hợp AND, góp phần vào trình phân chia trởng thành tế bào thể II Các phơng pháp định lợng Vitamin B12 II.1 Vitamin B12 thuốc đơn thành phần Hoà tan 25,00 mg chế phẩm nớc pha loÃng đến 1000,0 ml dung môi Đo độ hấp thụ tử ngoại bớc sóng cực đại 361 nm Cyano Cobalamin 351 nm Hiđroxo Cobalamin, tính kết dựa vào độ hấp thụ riêng (E1%/1cm ) Phơng pháp xác, áp dụng cho chế phẩm, tá dợc tan nớc không hấp thụ tử ngoại II.2 Vitamin B12 thuốc đa thành phần II.2.1 Phơng pháp vi sinh vật Phơng pháp dựa vào nguyên tắc: Vitamin B12 làm phát triển nhanh chóng chủng vi sinh vật Lactobacililus bichmanic môi trờng điều kiện nuôi cấy thích hợp đà quy định, tiến hành song song với dÃy mẫu chuẩn: 0.01ng đến 0.04 ng Vitamin B12 Để tính kết ngời ta đo độ đục mẫu thử mẫu chuẩn so với mẫu trắng chủng vi sinh vật đợc nuôi cấy môi trờng nuôi cấy Vitamin B12 Phơng pháp đợc sử dụng để định lợng Vitamin B12 chế phẩm có hàm lợng Vitamin B12 nhỏ : từ hàng ng đến hàng g/ viên, ml Tuy nhiên chđng vi sinh vËt Lactobacililus bichmanic rÊt hiÕm vµ khã Chuyên ngành hoá phân tích Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức nuôi cấy Nên phòng thí nghiệm có đợc để thực phơng pháp phơng pháp hạn chế II.2.2 Phơng pháp quang phổ khả kiến Phơng pháp quang phổ khả kiến dùng để tính hay định lợng Vitamin B12 chế phẩm dợc Phơng pháp dựa nguyên tắc đo quang phổ bớc sóng kh¶ kiÕn (548 ± nm) song song víi chn Dung dịch thử đợc chiết môi trờng Etanol 95 % làm để loại bớt Vitamin B1 Vitamin B6 Không làm lạnh chiết môi trờng đệm Axetat Phơng pháp tính chọn lọc không loại trừ đợc chất màu, phẩm màu hồng thờng có chế phẩm vấn nhiều Vitamin B1, B6 mẫu thử Do phơng pháp áp dụng đợc với chế phẩm có hàm lợng Cyano cobanlamin lớn (trên 500 g/viên.ml) tá dợc chất màu II.2.3 Phơng pháp đo quang phổ tử ngoại - Phơng pháp dựa nguyên tắc đo quang phổ cực đại vùng tư ngo¹i 361 ± 1nm, song song víi chn Dung dịch thử đợc chiết nhiều lần hỗn hợp Phenol + Butanol với Butanol môi trờng Axit Boric - Phơng pháp có khả áp dụng hạn chế kiểm nghiệm viên phải tiếp xúc lâu với dung môi độc Vitamin B1, B6 ảnh hởng lớn Chỉ nên áp dụng với chế phẩm có hàm lợng Cyano cobanlamin cao (từ 1000 g/viên,ml) II.2.4 Phơng pháp sắc kí định lợng Vitamin B12 Phơng pháp sắc kí phơng pháp để đạt tới việc định lợng Vitamin B12 nguyên liệu thiên nhiên, nh phơng pháp sắc kí lớp mỏng, phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao II.2.4.1 Sắc kí lớp mỏng Chuyên ngành hoá phân tích 10 Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức + Mẫu đợc đa vào cột tách dòng dung môi ngừng lại không chịu áp suất, sau mẫu đà đa vào cột tách dung môi lại tiếp tục đợc bơm + Sau thời gian ngắn áp suất đạt cân + Việc xác định thời gian lu mẫu Phơng pháp cách gián tiếp cho chất chuẩn nội xác định thời gian lu tơng đối + Nhợc điểm phơng pháp làm cho độ nhồi cột tách thay đổi áp suất dao động lúc ngng dòng II.4 Cột tách - Cột tách HPLC đợc coi trái tim hệ thống thiết bị Điều kiện cột tách: + Phải trơ + Có thành phẳng + Đồng bề mặt + Có thể chịu đợc áp suất cao Các chất sử dụng làm cột tách + Thuỷ tinh + Thép không gỉ + Tan tan + Đồng + Nhôm Đờng kính : - mm Hạt nhồi có đờng kính 80 m thích hợp cho cột tách có đờng kính -4 mm cho hiệu suất độ lặp tốt Cột tách có đờng kính nhỏ mm khó nhồi Chiều dài cột tách: 12,5 - 25 cm §êng kÝnh - mm CÊu hình cột tách thẳng hay cong không ảnh hởng lớn đến trình tách Trớc dùng cột tách thép không gỉ đợc làm HNO3 Chuyên ngành hoá phân tích 29 Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức 50%, sửa nớc nhiều lần Axeton cuối làm khô khí N2 không khí nóng - Nhồi cột: có cách nhồi + Nhồi khô: sử dụng với hạt chất nhồi có đờng kính > 20 m + Nhồi ớt : sử dụng với hạt chất nhồi có đờng kính < 20 m (Trong luận văn sử dụng cách nhồi ớt) - Sau cột đà làm xong cần phải kiểm tra khảo sát đặc trng độ tách nh độ cân ®èi cđa Pic, thêi gian ®o tÝnh b»ng biĨu thøc: Lr ΠεT To = F Trong ®ã: L- chiỊu dài cột tách (cm) r - bán kính cột tách (cm) F - Tốc độ dòng (cm3/s) T - số giới hạn Độ rỗng tổng cộng T chất mạng hoàn toàn rỗng (không phụ thuộc vào phơng pháp nhồi) 0,4 (5%) loại pha liên kết hoá học (và chất trao đổi ion) T nhỏ Trờng hợp giới hạn ε T = 0.42 VÝ dơ h¹t thủ tinh ë hệ pha thuận nghịch T = 0,75 Đờng kính hạt pha chất nhồi phải đợc kiểm tra b»ng biĨu thøc: DP = 41 FnL r∆P ( µ m) Chiều cao đĩa lý thuyết đợc H H ' = 3dp + Trong ®ã: d2 p + u n 16 u - thêi gian chÕt ∆ P - áp suất (atm) Phơng trình cho chất rữa giải không phân cực với độ phân cực Chuyên ngành hoá phân tích 30 Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức thấp nh n-heptan mẫu có phân tử lỵng thÊp nh Benzen, dÉn xt cđa benzen Dung lỵng cột tách đa số trờng hợp khoảng 10 - 4g mẫu/gam pha động Khi tăng lợng mẫu, phụ thuộc vào chiều cao địa lý thuyết thời gian lu, việc xác định thời gian lu loại phơng pháp sắc kí khác Trong sắc kí lỏng cao áp chất nhồi quan trọng phổ biến Silicagen, sau axit nhồi, loại pha ngợc (RP-2, RP-8) Cột nhồi tốt (điều kiện hạt chất nhồi 30 - 40 m) tốc độ rữa giải 30cm/s chiều cao đĩa lý thuyết cột tách khoảng 1mm II.5 Lợng mẫu Lợng mẫu cực tiểu phụ thuộc vào độ nhạy detecter Dung lợng mẫu cột tách phụ thuộc vào chất nhồi cột Việc sử dụng chất nhồi lớp mỏng xốp làm giảm lợng mẫu Lợng mẫu, độ phân giải tốc độ phân tích có quan hệ với theo sơ đồ tam giác: Tốc độ Tách phân tích A B Lượng mẫu Tách điều chế Độ phân giải Dung lợng mẫu cột tách phụ thuộc vào cột nhồi Các hạt xốp có bề mặt Dung lợng mẫu cột tách phụ thuộc vào chất nhồi hạt xốp so với loại không điển hình chất hấp phụ xốp có diện tích bề mặt ®Õn 200 - 400 m2/g ®èi víi chÊt hÊp phơ xếp với chiều dài m đờng kính 2,1mm Chuyên ngành hoá phân tích 31 Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức bơm vào khoảng -5 mg lợng mẫu u điểm lớn sắc kí lỏng cao áp so với sắc kí khí Việc sử dụng nhồi lớp mỏng xốp làm giảm lợng mẫu, thí dụ cột tách có điều kiện mm đợc nhồi với nhựa trao đổi ion 270 - 325 mest phủ hạt thuỷ tinh có dung lỵng chØ b»ng 10 -8 mol II.6 Pha tÜnh (hay gọi chất nhồi cột) Trong sắc kí lỏng cao áp pha tĩnh đóng vai trò quan trọng tạo nên tơng tác cần thiết để cấu tử tách khỏi Vì trao đổi pha tĩnh thông số làm việc cột ảnh hởng đến lực tơng tác trình tách, pha tĩnh có chế độ làm việc riêng Nhiệt độ ngỡng thấp đợc xác định điểm nóng chảy, nhiệt độ ngỡng cao đợc xác định áp suất ®é bỊn nhiƯt cđa nã, nhiƯt ®é sư dơng lµm pha tĩnh: đà tìm 700 chât Một vài ví dụ pha tĩnh: Chuyên ngành hoá phân tích 32 Khoá luận tốt nghiệp Tên pha tĩnh ODS - Hypersil Lchrosorb RP 18 Lichrosorb RP18 Hypersil Parasil Lichrosorb - Si60 Zorbac - Sil Parasil Parasil 10 SCX Lichrosorb KAT Amines - A28 Lê Minh Đức Loại nhóm thÕ C18 C18 C18 C18 Trªn nỊn Silica Silica Silica Silica Silica Silica Silica Silica Silica Silica Polime Lo¹i pha HÊp phô RP HÊp phô RP HÊp phô RP HÊp phô RP HÊp phô NP HÊp phô NP HÊp phô NP HÊp phơ NP Trao ®ỉi ion Trao ®ỉi ion Trao đổi ion II.7 Kỹ thuật tăng tốc II.7.1 Chơng trình dung môi Chơng trình dung môi Chơng trình dung môi làm giảm gía trị K (hệ số dung lợng) xuống 10 lần (K = Tr/To, TR thêi gian lu pha tÜnh, To lµ thêi gian lu pha động) Trong trình rữa giải lực dung môi cố định, lợng kết hợp chất lại lâu cột tách thờng khó phát Pic chúng qua đơn giản nhiễu trôi đờng Có thể sử dụng loại detecter: hấp thụ tử ngoại, huỳnh quang với chơng trình dung môi ứng dụng chủ yếu với chơng trình dung môi (còn gọi rữa giải Gradien) nghiên cứu sơ thành phần tơng đối rộng phức tạp Rữa giải dung môi có u điểm: + Giảm thời gian phân tích rõ rệt + Độ phân giải chung dung dịch tăng lên + Pic sắc đồ nhọn + Độ nhạy tăng lên Chuyên ngành hoá phân tích 33 Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức Tái sinh cột tách tăng giảm lực cách bơm pha ban đầu qua cột tách thu đợc hoạt động ban đầu II.7.2 Chơng trình tăng tốc độ dòng Khi tiến hành tốc độ dòng ngời ta thờng sử dụng tốc độ dòng thấp phần khởi đầu tách tăng tốc độ phần đầu So sánh chơng trình dung môi, chơng trình tốc đọ dòng có số u điểm sau: + Không phải tái sinh cột tách mà cần làm giảm tốc độ dòng đến giá trị ban đầu phải tiến hành trình bơm mẫu lần thứ hai + Có thể sử dụng tất hệ sắc kí lỏng sử dụng chơng trình dung môi + Cả loại detecter chiết suất vi sai hấp thụ tử ngoại sử dụng đợc nhng phải kiểm tra xác Tốc độ dòng thờng vào khoảng 0,5 - ml/phút cho cột tách có điều kiện mm + 2ml/phút cho cột tách có điều kiện 3mm + 2-3 ml/ phút cho cột tách có điều kiện mm II.7.3 Chơng trình nhiệt độ Chơng trình nhiệt độ liên quan đến tăng nhiệt độ trình sắc kí Hiệu chơng trình nhiệu độ nhỏ so với chơng trình dung môi Kỷ thuật sử dụng sắc kí lỏng cao áp, dùng sắc kí thẩm thấu qua gen II.7.4 Ghép cột tách Kỷ thuật áp dụng trình tách có độ hiệu dụng cao Sau mẫu đợc đa vào cột tách thứ nhất, phân đoạn chon lọc đợc tách xa hay nhiều cột tách Bằng cách chọn chiều dài thích hợp sử dụng chất nhồi tơng ứng khác nhau, chất tan từ cột tách khác đợc điều chỉnh để rữa giải thời gian khác Chuyên ngành hoá phân tích 34 Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức Kỷ thuật ghép cột tách cho phép phân giải vùng mong muốn trở nên tốt hơn, hợp chất với lợng nhỏ rữa giải thành Pic riêng cấu tử nặng đợc phát thời gian ngắn II.8 Các loại đetecter II.8.1 Đetecter uv/vis Đetecter hấp thụ tử ngoại (uv/vis) đợc sử dụng rộng rÃi dễ vận hành phụ thuộc vào thay đổi nhiệt độ tốc độ dòng Nhng có nhợc điểm có khả phát mẫu chất hấp thụ vùng uv gần với bớc sóng đetecter chất rữa giải phải hoàn toàn không hấp thụ tử ngoại bớc sóng đetecte Với đetecter uv bớc sóng 254 nm có khoảng phát Hiđro cacbon vòng thơm Các axeton anđehit, hợp chất thơm phần lớn có khả hấp thụ vùng luận văn ngời ta sử dụng loại đetecter uv/vis + Phân tích bớc sóng: 550 nm + Độ xác bớc sóng: nm + Độ lặp lại bớc sóng: 0,1 nm + áp suất: 110 atm/250 atm + Đèn: Deuterium + Nhiệt độ thao tác khoảng: - 400oC Ngoài loại đetecter uv/vis ngời ta sử dụng loại đetecter khác nhau: II.8.2 Đetecter chiết suất vi sai (RP) Nguyên tắc đetecter dựa khác số chiết suất dung dich dung môi nguyên chất II.8.3 Đetecter vận chuyển Ra đời với xuất Phơng pháp sắc kí lỏng cao áp Trớc phát mẫu dung môi rữa giải phải đợc loại trừ Muốn trớc qua lò Chuyên ngành hoá phân tích 35 Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức nhiệt phân phận vận chuyển phải đợc làm đốt nóng để làm chảy hợp chất hữu sót lại bề mặt u điểm lớn đetecter trờng hợp lý tởng phát riêng mẫu II.8.4 Đetecter hấp thụ nhiệt Đetecter dựa sở đo nhiệt độ hấp thụ nhiệt giải hấp thụ Chất tan dòng chảy tiếp xúc với chất hÊp thơ ®ã cã bé phËn ®o nhiƯt rÊt nhạy Bộ phận phải điều nhiệt tốt Sự thay đổi nhiệt độ khoảng 0.003oC II.8.5 Đetecter huỳnh quang Loại Đetecter đặc trng sử dụng phải ý nhiều so với Đetecter uv/vis khoảng tuyến tính lớn hơn, Nhng dùng dung môi hợp chất chứa oxy làm tắt huỳnh quang III Quy trình III.1 Pha dung môi (pha động) CH3OH 2% + H2O theo tû lƯ 35:65 Läc qua mµng läc 0,45 µ m Lắc siêu âm để đẩy hết khí hoà tan dung môi Điều kiện chạy sắc kí: + Máy sắc kí lỏng cao áp HPLC (của hÃng ShiMadzu Nhật Bản) + Cét Lichrosorb RP 18 (5 - 10 µ m, 250x4mm) + Tốc độ dòng: 1.5 + Đetecter uv/vis: 550 nm + Thể tích tiêu: 20 l + Nhiệt độ cột: 25oC + áp suất ổn định: 884 - 910 III.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu (mẫu chuẩn, mẫu thư) III.2.1 Chn bÞ dung dÞch chn Dung dÞch Cyanocobanlamin chuẩn nớc, nồng độ l/ml, lọc qua Chuyên ngành hoá phân tích 36 Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức màng 0,45 m Lắc siêu âm ®Ĩ ®i hÕt bät khÝ III.2.2 Chn bÞ dung dich thử Rửa 20 viên bao Etanol, sấy khô, xác định khối lợng trung bình viên nghiền bột mịn Cân xác lợng bột thuốc tơng đơng với 250 g Cyanocobanlamin vào bình định mức 50ml Thêm 30 ml nớc cất, lắc siêu âm 10 phút, thêm nớc vừa đủ, lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc qua màng 0.45 m Khối lợng trung bình cđa 20 viªn: Ptb = 0.6712 (g) * MÉu thư 1: Cân xác 1,3424 g thuốc cho vào bình định mức 50 ml thêm 30 ml nớc cất, lắc siêu âm 10 phút thêm nớc vừa đủ Lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc qua giấy lọc 0,45 m * Mẫu thử 2: Cân xác 1,3440 g thuốc cho vào bình định mức 50 ml thêm 30 ml nớc, lắc siêu âm 10 phút thêm nớc vừa đủ Lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc qua giÊy läc 0,45 µ m * MÉu thư 3: Cân xác 1,3425 g thuốc cho vào bình định mức 50 ml thêm 30 ml nớc, lắc siêu âm 10 phút thêm nớc vừa đủ Lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc qua giấy lọc 0,45 m * Mẫu thử 4: Cân xác 1,3430 g thuốc cho vào bình định mức 50 ml thêm 30 ml nớc, lắc siêu âm 10 phút thêm nớc vừa đủ Lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc qua giấy lọc 0,45 m * Mẫu thử : Cân xác 1,3420 g thuốc cho vào bình định mức 50 ml thêm 30 ml nớc, lắc siêu âm 10 phút thêm nớc vừa đủ Lọc bỏ 20 ml dịch lọc đầu Lọc qua giấy lọc 0,45 m III.3 Chuẩn bị máy Chuyên ngành hoá phân tích 37 Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức (HPLC SHIMADZU) Bớc 1: BËt hƯ thèng bao gåm: B¬m Water 1525, detecter uv/vis, Water 2478 (dual absorbance detecter), ổn định nhiệt, máy tính Bớc 2: làm việc với phơng pháp Method Bơm: Nạp thông số tốc độ dòng, chế độ dòng, nhiệt độ ổn định nhiệt, thích Đetecter uv/vis: nạp thông số Analo A, B bỏ qua (chấp nhận) thông số sau đà đặt thông số xong ta phải ghi lại đặt tên cho phơng pháp vừa tạo “save as/File” Tªn cđa pp Method sÏ hiƯn lªn vùng làm việc Bớc 3: Chạy mẫu: Chú ý không để bọt khí lọt vào dòng dung môi tránh tợng giảm áp suất cách đột ngột toàn bé hÖ thèng NÕu cã bät khÝ hÖ thèng phải xả cho hết chạy mẫu Bớc 4: Đặt thông số Bớc 5: Xử lý liệu Bớc 6: Xem in báo cáo III.4 Định lợng Vitamin B12 hỗn hợp Vitamin 3B: B1, B6, B12 Cách tiến hành: III.4.1 Đối với mẫu chuẩn Tiến hành làm với mẫu chuẩn Mẫu 1: Tiêm lần Hút mẫu từ từ với bơm tiêu, chơng trình tự động cho lần tiên 10 phút xả máy tự động ngắt lại tiếp tục Lần 1: Vtiêm = 20 l, thời gian chạy 10 phút Lần 2: Vtiêm = 20 l, thời gian chạy 10 phút Lần 3: Vtiêm = 20 l, thời gian chạy 10 phút Lần 4: Vtiêm = 20 l, thời gian chạy 10 phút Mẫu 2: Tơng tự mẫu III.4.2 Đối với mẫu thử: có mẫu Chuyên ngành hoá phân tích 38 Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức Một mẫu tiêm lần tỷ lệ nh tiêm mẫu chuẩn, chạy chơng trình điều kiện sắc kí, sau kết nối với máy tính xử lý peak in Ta cã peak cña mÉu chuÈn nh sau: * MÉu chuÈn 1: * MÉu chuÈn : Tõ Peak ta thu đợc kết nh sau MÉu chn Thêi gian lu DiƯn tÝch ChiỊu cao ( µ v) 2.483 2.479 Peak ( µv *sec) 21425.8 21672.0 1005 1003 Ta cã Peak cña mÉu thử + Mẫu thử 1: Chuyên ngành hoá phân tích 39 Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức + Mẫu thử 2: + Mẫu thử 3: Chuyên ngành hoá phân tích 40 Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức + Mẫu thử 4: + Mẫu thử 5: Chuyên ngành hoá phân tích 41 Khoá luận tốt nghiệp Mẫu thử Lê Minh Đức Thời gian lu (min) 2.313 2.311 2.312 2.302 2.305 DiÖn tÝch Peak ( µv *sec) 21879.3 22035.1 22959.3 22981.7 22521.8 ChiÒu cao ( µ v) 1290 1333 1428 1409 1355 III.4.3 KÕt qu¶ định lợng Mẫu Lợng cân thử (g) 1,3424 1,3440 1,3425 1,3430 1,3420 Lợng cân (g) Hàm lợng Vitamin B12 nhÃn ( Diện tích peak ( µ v * Sec) 125 125 125 125 125 Vitamin B12 ( 21879.3 22035.1 22959.3 22981.7 22521.8 g/1 viên) 127,28 128,03 133,50 133,63 131,00 Hàm lợng Hàm lợng VitaminB12 VitaminB12 Chuyên ngành hoá phân tích Hàm lợng 42 g/viên) Hàm lợng % Xử lý thống kê Khoá luận tốt nghiệp Lê Minh Đức nhÃn ( 1,3424 1,3440 1,3425 1,3430 1,3420 xác định đợc ( g/1viên) 125 125 125 125 125 g/1viên) Chuyên ngành hoá ph©n tÝch 127,28 128,03 133,50 133,63 131,00 43 101,82 102,42 106,80 106,90 104,80 Trung b×nh 104,55% ... Phơng pháp sắc kí định lợng Vitamin B12 Phơng pháp sắc kí phơng pháp để đạt tới việc định lợng Vitamin B12 nguyên liệu thiên nhiên, nh phơng pháp sắc kí lớp mỏng, phơng pháp s¾c kÝ láng hiƯu st cao. .. II.2.2 Phơng pháp quang phổ khả kiến II.2.3 Phơng pháp đo quang phổ tử ngoại II.2.4 Phơng pháp sắc kí định lợng VitaminB12 II.2.4.1 Sắc kí lớp mỏng II.2.4.2 Phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao II.2.5... luận chọn phơng pháp phân tích VitaminB12 III Một số vấn đề áp dụng phơng pháp sắc kí lỏng hiệu suất cao để xác định VitaminB12 viên nén Vitamin3 B III.1 Cơ sở lí thuyết phơng pháp HPLC III.1.1