chiết xuất glycoside tim

Nếu ở dạng aglycon thì hoạt tính của nhóm bufadienolid mạnh hơn dẫn chất cardenolid tương ứng.Đối với phần đường thì tác dụng sinh học của glycoside không những chỉ phụ thuộc vào bản chấ

CHIẾT XUẤT HỢP CHẤT

GLYCOSIDE TIM

ĐẠI CƯƠNG

Glycoside tim là một nhóm glycoside có cấu trúc steroid, có tác dụng đặc biệt lên tim Nhưng với liều cao, chúng là những chất gây độc nên từ thời cổ xưa, nhiều dân tộc ở nhiều nước đã biết sử dụng những chất này để tẩm vào tên thuốc độc

Trong cây chúng tồn tại dưới dạng glycoside hòa tan trong các dịch tế bào Dưới tác dụng của men hoặc acid loãng, các glucoside thủy phân thành genin và đường

Glycoside tim còn được gọi là glycosidedigitalic vì glycoside của lá cây Digitalics được dùng đầu tiên trên lâm sàng để chữa bệnh tim.

Glycoside tim tan trong nước và cồn loãng, ít tan trong các dung môi không phân cực Glycoside tim phân bố trong khoảng 10 họ thực vật, đặc biệt trong 2 học Trúc đào (Apocynaceae) và họ Thiên lý (Asclepiadaceae).

CẤU TRÚC HÓA HỌC

Glycoside tim cũng như các glycoside khác, cấu trúc hóa học gồm 2 phần: aglycon và phần đường.

Phần aglycon cấu tạo bởi một khung steroid Gắn ở

C 17 là vòng lacton Dựa vào vòng lacton, người ta chia chúng thành 2 nhóm lớn:

Cardenoid: vòng lacton 5 cạnh, có một nối đôi.

Bufadienolid: vòng lacton 6 cạnh, có 2 nối đôi.

Sự liên quan giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của glycoside tim:

Liên hệ giữa vòng A/B: đa số glycoside tim có vòng A/B

là cis, A/B là trans ít gặp hơn Vòng A/B có cấu tạo trans thì hoạt tính sinh học giảm hơn so với cis.

Cấu tạo vòng lacton: phần quyết định tác dụng lên tim

là phần aglycon bao gồm nhân steroid và vòng lacton

chưa bão hòa, cả hai phần này đều rất quan trọng.

Nếu giữ lại vòng lacton, thay nhân steroid bằng nhân benzen, naphtalen,… thì mất tác dụng.

Nếu giữ nguyên nhân steroid mà thay đổi vòng lacton như: bão hòa nối đôi, mở vòng lacton, thay vòng lacton bằng vòng lactam thì tác dụng mất và giảm đi rất nhiều.

Sự hấp thu qua dạ dày, tá tràng ruột non phụ thuộc vào số lượng nhóm OH của phần aglycon hay nói cách khác là phụ thuộc vào tính ái dầu của nó

Nhóm OH ở vị trí C 14 rất quan trọng, không có nhóm này thì tác dụng giảm đi rất nhiều.

Nếu ở dạng aglycon thì hoạt tính của nhóm bufadienolid mạnh hơn dẫn chất cardenolid tương ứng.

Đối với phần đường thì tác dụng sinh học của glycoside không những chỉ phụ thuộc vào bản chất của đường mà còn phụ thuộc vào vị trí của phần đường nối vào nhân steroid.

Ngoài ra, người ta thấy rằng liều chết khác nhau tùy động vật Đối với mèo thì liều chết gấp đôi thỏ và khoảng 60 lần chuột cống trắng

Ếch là động vật thích hợp để làm các thí nghiệm các thuốc độc lên tim thì hầu như miễn dịch với các chất này

Thí dụ dịch chiết của hạt Strophanthus kombe đối

với mèo và chó thì độc như nhau nhưng digitoxin thì

ít độc trên chó hơn là trên mèo.

Những glycoside tim có đường 2-desoxy thì rất dễ bị thủy

phân khi đun với acid vô cơ 0,05N trong MeOH 30 phút,

trong khi những glycoside khác trong điều kiện đó thì không thủy phân được.

Glucoside dễ bị phân hủy bởi các enzym Thường thì các enzym này có sẵn trong cây, có khả năng cắt bớt các đơn

vị đường cuối mạch (xa aglycon) để chuyển thành các

glycoside thứ cấp.

Vòng lacton dễ bị mở vòng bởi tác dụng của kiềm rồi

tạo thành dẫn chất iso không có tác dụng.

2 Các thuốc thử định tính và định lượng

Các thuốc thử định tính và định lượng chủ yếu dựa trên các thuốc thử tạo màu ở ánh sáng thường hoặc tạo huỳnh quang dưới ánh sáng cực tím.

Các thuốc thử chia làm 2 loại:

- Thuốc thử tác dụng lên phần đường

Thuốc thử Xanthydrol Thuốc thử acid phosphoric đậm đặc:

3 Các phương pháp chiết xuất để định lượng

Các phương pháp định lượng glycoside tim thường dựa vào các phản ứng cho màu và phải qua khâu chiết xuất glycoside toàn phần và loại tối đa các tạp chất khác lẫn vào

Công việc ổn định để diệt enzym trước khi chiết là cần thiết Thường người ta hay diệt enzym bằng cách cho tác dụng ngay cồn sôi trên nguyên liệu.

Nói chung trong các phương pháp chiết xuất đều có giai đoạn loại tạp bằng ether dầu hỏa, bằng acetat chì và dựa trên tính chất glycoside có thể tan được trong CHCl 3 hoặc CHCl 3 -cồn để tách riêng

Phương pháp của Soos

Cân 1,5g bột nguyên liệu cho vào becher, thêm ít nước cất để tạo thành khối nhão và để yên 15 phút

Chuyển vào bình cầu, tráng becher bằng nước cất và thêm nước cho đủ 151,5g Đậy kín, lắc trong 1 giờ

Sau đó cho thêm 15g dung dịch acetat chì 15%, lắc đều,

để lắng, lọc, bỏ tủa Lấy 110g dịch lọc tương đương với 1g nguyên liệu, cho vào bình gạn lắc 3 lần, mỗi lần 25ml CHCl 3

Dịch chloroform gộp lại, cho vào một bình cầu và làm

Phương pháp của Soos (tt)

Phương pháp của Losh-Karaer để định lượng glycoside tim với thuốc thử picrosodic

Cân 2-10g nguyên liệu đã sấy khô tán nhỏ và rây (cỡ rây 0,5-1mm), cho vào túi giấy thấm; đồng thời cần định lượng độ ẩm Các túi (10-12 mẫu) cho vào bình miệng rộng có nút mài, thêm ether dầu hỏa hoặc benzen và ngâm qua đêm

Hôm sau lấy ra, đặt vào bát sứ và để khô ngoài không khí (tốt hơn là trong tủ HOOD) Sau đó mẫu được chiết

theo thể tích) Thời gian chiết từ 14-16 giờ

Phương pháp của Losh-Karaer (tt)

Dịch chiết 100-200ml được chuyển vào bình định mức 200-250ml

Tráng bình cầu và Soxhlet với hỗn hợp

hỗn hợp đó cho đến ngấn

Dùng ống hút chính xác lấy 25 hoặc 50 ml cho vào chén sứ, bốc hơi trên nồi cách thủy trong tủ HOOD cho đến khô

Sau đó dùng một lượng cồn 15-30ml (chia thành từng phần nhỏ 2-2,5ml) cho vào cắn, dùng đũa thủy tinh khuấy để hòa tan và chuyển vào bình định mức 50 hoặc 100ml, trán chén với 20-40ml nước cất và cho vào bình định mức

Thêm vào bình định mức 6-10 giọt dung dịch acetat chì 30% (cho đến khi tủa hết tạp chất) Sau đó loại chì thừa bằng 20-30 giọt dung dịch Na 2 SO 4 15% (cho đến khi tủa hết chì) Thêm nước cho đến ngấn

Lọc vào bình nón, nếu cần thì lọc 2 lần cho trong Từ dịch lọc này sẽ cho tác dụng với thuốc thử picro-sodic để làm phản ứng màu.

Phương pháp của Losh-Karaer (tt)

Phương pháp của Makarevich chiết để chạy sắc ký

2g nguyên liệu khô, loại chất béo bằng ether dầu hỏa

Sấy khô ở áp suất kém rồi sau đó chiết nóng bằng EtOH

96 o , chiết tiếp bằng EtOH 80 o cho đến hết hoạt chất

Bốc hơi, hòa cặn trong 30ml nước rồi lắc với ether (4 x 30ml)

Loại ether, sau đó chiết glycoside bằng cồn và CHCl 3 (1:2), làm khô bằng Na 2 SO 4 , loại dung môi

Hòa tan cắn vào 15-20 ml cồn thêm Al 2 O 3 độ hoạt hóa cấp

II, khuấy, lọc, rửa oxyt nhôm bằng 10-100ml cồn nóng, gộp dịch cồn, loại dung môi đến khô.

Đánh giá bằng phương pháp sinh vật

Trong nhiều trường hợp, kết quả của phương pháp định lượng bằng hóa học nêu ở phần trên không ăn khớp với liều tác dụng nên Dược điển các nước và Dược điển Việt Nam quy định đánh giá hiệu lực của glycoside tim bằng phương pháp sinh vật

Súc vật hay dùng là mèo hoặc ếch Đối với mèo thì căn cứ vào liều gây ngừng tim ở thời kỳ tâm trương, đối với ếch thì căn cứ vào liều gây ngừng tim ở thời kỳ tâm thu.

Đối với ếch thì tiêm dưới da vào túi bạch huyết, đối với mèo thì tiêm vào tĩnh mạch đùi, sau đó tính ra đơn vị ếch hoặc đơn vị mèo.

Đơn vị ếch (Đ.V.Ê) là liều tối thiểu của nguyên liệu hay của glycoside tim làm đa số ếch trong một lô ếch thí nghiệm bị ngừng tim Thí nghiệm được tiến hành trong những điều kiện quy định.

Đơn vị mèo (Đ.V.M) là liều tối thiểu của nguyên liệu hay của glycoside tim làm cho tim mèo ngừng đập, tính theo kilogam thể trọng Thí nghiệm được tiến hành trong những điều kiện quy định.

CHIẾT XUẤT GLYCOSIDE TIM

Xử lý nguyên liệu

Trong nguyên liệu chứa glycoside tim thường chứa enzym có khả năng thủy phân cắt bớt phần đường của glycoside để cho các hợp chất artefact Do đó việc ổn định nguyên liệu trở thành một vấn đề quan trọng

Bản chất của enzym là protein, không tan trong cồn, tan trong nước, bị tủa bởi một số muối có nồng độ cao Enzym hoạt động thích hợp từ 20-45 o C Ở nhiệt độ trên

60 o C, nói chung enzym bị phá hủy.

Những phương pháp diệt enzym đã được nhiều tác giả

đề cập đến.

Bourquelot dùng phương pháp cho nguyên liệu vào cồn sôi.

Croris và Arnould thì sử dụng hơi nước trong nồi hấp để

ởn định nguyên liệu, hiện nay phương pháp ổn định bằng hơi nước cũng không được sử dụng rộng rãi.

Năm 1909, Perrot Goris đã đưa ra phương pháp dùng hơi cồn để ổn định nguyên liệu Phương pháp này tốt nhưng cần phải có thiết bị để tránh gây hỏa hoạn do hơi cồn.

Hiện nay, nhiều tác giả đã dùng phương pháp đông khô

để làm khô nguyên liệu.

Để loại trừ tác dụng của enzym, có tác giả chiết xuất

chất ức chế enzym khác nhau để ngăn cản tác dụng của enzym Các chất dùng là: các muối vô cơ, các chất này

có khả năng kết tủa protid làm enzym bị biến tính

Thực tế trong việc chiết xuất những glycoside dùng làm thuốc, đôi khi người ta lại không ổn định nguyên liệu trước khi chiết xuất mà lại để cho enzym hoạt động để thu những glycoside thứ cấp.

Phương pháp chiết glycoside từ thực vật

Nguyên liệu sau khi xử lý thường phải loại chất béo, nhựa hoặc chất diệp lục Quá trình này cũng quan trọng

và có ảnh hưởng đến hiệu suất glycoside

Để lấy glycoside ra khỏi nguyên liệu cần chọn các dung môi thích hợp Việc chọn lựa này dựa vào khả năng hoà tan của các glycoside vào dung môi

Về phương pháp, do tính chất dễ thuỷ phân của glycoside tim nên người ta sử dụng các phương pháp tránh nhiệt độ Ngâm lạnh và ngấm kiệt là những phương pháp thông dụng nhất.

Loại tạp chất – phân loại glycoside

Việc sử dụng hỗn hợp nước - cồn đã hạn chế được một số tạp chất Tuy vậy, trong dịch chiết còn chứa nhiều chất không phải glycoside tim, rất hay gặp trong thực vật

Trong hoá thực vật, dù chiết xuất bằng phương pháp nào, không bao giờ thu ngay được một chất tinh khiết

Sau khi chiết ra khỏi nguyên liệu, bao giời cũng có một hỗn hợp gồm nhiều chất hỗn hợp này thường chứa các chất cùng loại, có tính chất rất gần nhau

Vì vậy nhiệm vụ tách chúng thành từng chất riêng biệt rất khó khăn

Có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập các hợp chất tự nhiên

Đối với glycoside tim, sử dụng các phương pháp sau:

Phương pháp dựa vào độ hoà tan của các dung môi khác nhau

Phương pháp dùng sắc ký cột:

Có thể trộn dịch chiết với oxyt nhôm, sau đó dùng cồn để rửa khối bột này Các glycoside tan dễ trong cồn sẽ tách khỏi các tạp chất Cách tinh chế này cho kết quả tốt hơn cách trên vì còn có khả năng hoà tan được các aglycon, trong khi đó nước ít hoà tan các aglycon hơn.

Tủa glycoside thô

Glycoside tinh khiết

Kết tinh lại (5)

Thu hồi P↓

Lọc qua chất hấp phụ (Than hoạt, Al 2 O 3 , polyamid,…)

Sơ đồ chiết xuất tổng quát

của glycosid tim

Rửa bằng nước bão hòa NaCl Thu hồi dung môi

Loại tạp bằng Pb acetat Lọc

Ngâm trong cồn 25% + 1 ít CaCO 3 , để qua đêm Ngấm kiệt

Hỗn hợp glycoside thô

Dịch lọc 2

Dịch lọc 3

Một ít CaCO 3 , để yên 2h Lọc

Bão hòa bằng NaCl Chiết bằng hỗn hợp cồn-CHCl 3 Sơ đồ chiết glycosid tim toàn phần từ hạt

sừng trâu (phương pháp của Nikenep có cải tiến)

500g nhân hạt

Bã DL đã phơi khô (bằng gió)

Dịch chiết

Glycoside thô

Thu hồi giảm áp

Hòa tan trong hỗn hợp aceton-ete (1:1) Tẩy màu bằng than hoạt, lọc

Để ở 0 o C

+1200ml nước cất + 12ml toluen + dịch men + lắc

Để ở 37 o C trong 4 ngày Chiết bằng cồn 95 o /t o phòng

Ép dầu Loại mỡ bằng ether dầu hỏa

Tinh thể thevozid

Dịch đậm đặc

Tủa

Để ở tủ lạnh Lọc

Rửa tủa bằng cồn lạnh Sấy khô

Sơ đồ chiết thevosid từ

hạt thông thiên