Thiết kế Vector Baculovirus chứa Gen M1 của Virus H1N1, bước đầu tạo Vaccine thế hệ mới

Mặt khác, virus cúm A dễ dàng đột biến trong gen/ hệ gen đặc biệt ở gen mã hóa NA và HA hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau trong quá trình xâm nhiễm, tồn tại và lây truyền giữa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VŨ THỊ THANH NHÀN

THIẾT KẾ VECTOR BACULOVIRUS CHỨA GEN M1 CỦA VIRUS

H1N1, BƯỚC ĐẦU TẠO VACCINE THẾ HỆ MỚI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2011

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VŨ THỊ THANH NHÀN

THIẾT KẾ VECTOR BACULOVIRUS CHỨA GEN M1 CỦA VIRUS

H1N1, BƯỚC ĐẦU TẠO VACCINE THẾ HỆ MỚI

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 0

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về virus cúm 3

1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm 3

1.1.2 Đặc điểm các phân đoạn gen của virus 4

1.1.3 Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus cúm trong tế bào vật chủ 7

1.1.4 Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm 8

1 1.4.1 Hemagglutinin (HA) 8

1.1.4 2 Neurominidase (NA) 10

1.1.4.3 Matrix protein ( M1) của virus cúm 11

1.1.5 Tình hình dịch bệnh H1N1 14

1.2 Vaccine phòng chống cúm 15

1.2.1 Đại cương về vaccine 15

1.2.2 Tổng quan về VLPs 18

1.3 Hệ thống biểu hiện Baculovirus 21

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Vật liệu 23

2.2.1 Vector tách dòng 23

2.2.2 Vector biểu hiện trong tế bào côn trùng 24

2.2.3 Hóa chất và sinh phẩm 25

2.2.4 Trang thiết bị: 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu: 26

2.3.1 Tách chiết RNA tổng số 26

2.3.2 Kiểm tra RNA bằng quang phổ kế 26

2.3.3 Tổng hợp cDNA 27

2.3.4 Nhân gen M1 của virus cúm A/H1N1 bằng PCR 28

2.3.5 Điện di trên gel agarose 29

2.3.6 Tách dòng gen 30

2.3.7 Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli 30

2.3.8 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn E.coli 31

2.3.9 Kiểm tra DNA plasmid bằng enzym giới hạn 32

2.3.10 Thu đoạn DNA từ gel agarose 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả tách chiết RNA tổng số 34

3.2 Thiết kế hộp gen M1 của virus cúm A/H1N1 34

3.3 Tách dòng hộp gen M1 vào vector pCR2.1 35

3.3.1 Gắn sản phẩm PCR chứa hộp gen M1 vào vector pCR2.1 36

3.3.2 Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli chủng DH5α 36

3.3.3 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli 37

3.3.4 Chọn lọc vector tái tổ hợp bằng cắt với enzym giới hạn 38

3.4 Tinh sạch các plasmid tái tổ hợp 40

3.5 Kết quả xác đinh trình tự 41

3.6 Thiết kế vector biểu hiện baculovirus mang hộp gen M1 44

3.6.1 Thu nhận hộp gen M1 từ pCRM1 và chuẩn bị vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO 45

3.6.2 Thiết kế vector biểu hiện pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen M1 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 53

Từ viết tắt Tiếng việt

EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Acid

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribonuclecic Acid

1980 đến nay thì cộng đồng y tế thế giới đã phải đương đầu với nhiều dịch bệnh xảy ra như dịch AIDS và tiếp theo là các dịch bệnh khác kể cả SARS, cúm gà H5N1, cúm lợn H1N1, dịch bò điên, Ebola v.v Theo dự đoán các bệnh dịch sẽ còn tiếp tục phát triển

do hậu quả từ việc thay đổi khí hậu và môi trường trên thế giới

Bệnh cúm A/ H1N1 là bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do virus cúm A/H1N1 thuộc họ Othomyxoviridae gây ra, xuất phát từ Mêxico, Hoa Kỳ, và một số quốc gia khác Ban đầu chỉ thấy nhiễm trên lợn nhưng sau đó phát hiện loại virus này còn nhiễm trên nhiều đối tượng động vật khác Virus được phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt của hạt virus Nhóm virus cúm A có 17 loại kháng nguyên HA (từ H1 đến H17) và 9 loại kháng nguyên NA (từ N1 đến N9) [25] Sự tái tổ hợp giữa hai loại kháng nguyên này sẽ tạo ra nhiều phân type cúm khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh Mặt khác, virus cúm A dễ dàng đột biến trong gen/ hệ gen (đặc biệt ở gen mã hóa NA và HA) hoặc trao đổi các gen kháng nguyên với nhau trong quá trình xâm nhiễm, tồn tại và lây truyền giữa các loài vật chủ để tạo biến thể mới [30]

Các vaccine truyền thống tuy đã mang lại những kết quả hữu ích cho việc ngăn ngừa và chống dịch bệnh, tuy nhiên, việc sử dụng thuốc và cơ chế hoạt động biến đổi của virus A/H1N1 trong tế bào vật chủ đã gây ra những hạn chế về tính hiệu quả của vaccine Ngoài ra chi phí cho sản xuất vaccine khá cao và thời gian tương đối dài Do vậy vấn đề cấp thiết là cần phải phát triển các công nghệ hiện đại để nhanh chóng tạo

ra vaccine thế hệ mới nhằm đối phó với những hiểm họa cho cộng đồng trong tương lai VLPs (Virus like particles) vaccine là một trong những hướng đi mới trong công nghệ sản xuất vaccine thế hệ mới có nhiều tính ưu việt so với vaccine thế hệ trước đây

Từ những yêu cầu cấp thiết từ thực tế, chúng tôi thực hiện đề tài : “Thiết kế

vector baculovirus chứa gen M1 của virus H1N1, bước đầu tạo vaccine thế hệ mới”

Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng Vi sinh vật học Phân tử, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về virus cúm

1.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virus cúm

Bệnh cúm là bệnh của loài chim và động vật có vú do siêu vi trùng dạng RNA thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra Họ Orthomyxoviridae đã được phát hiện, bao gồm

4 nhóm virus: nhóm virus cúm A, cúm B, cúm C và nhóm Thogotovirus Các nhóm virus khác nhau bởi kháng nguyên bề mặt capsid: ở virus cúm A và B là Hemagglutinin, ở virus cúm C là Hemagglutinin Esterase Fusion, và ở Thogotovirus là Glycoprotein

Virus cúm A có cấu tạo hình cầu hoặc hình khối đa diện, đôi khi cũng có dạng hình sợi, đường kính 80 – 120 nm, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1.1 A) Kết quả phân tích thành phần hóa học cho thấy một hạt virus có chứa khoảng 0,8 - 1,1% RNA; 70 – 75% protein; 20 – 24% lipid và 5 – 8% carbonhydrate [25] Hệ gen

virus cúm A là RNA sợi đơn âm (-) ssRNA, bao gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt, mã

hóa cho 11 protein khác nhau của virus gồm: HA, NA, M (M1 và M2), NP, NS (NS1

và NS2), PA, PB1, PB1 - F2 và PB2 [7] Mỗi phân đoạn RNA của virus cúm A có cấu trúc bậc 2, xoắn α đối xứng, dài 50 – 100 nm, đường kính 9 – 10 nm, được bao bọc bởi nucleoprotein có bản chất là lipoprotein, tạo thành cấu trúc ribonucleoprotein (RNP) (Hình 1.1 B) Mỗi RNP kết hợp với 3 protein enzym polymerase chịu trách nhiệm trong quá trình phiên mã và sao chép RNA của virus Các phân đoạn của hệ gen virus cúm A nối với nhau bằng các cầu nối peptide tạo dạng vòm tại giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và tạo thành một sợi RNA duy nhất có tổng độ dài từ 10kb – 15 kb (tuỳ theo từng chủng virus cúm A), chứa khoảng 13,5 kb thông tin di truyền và có cấu trúc xoắn

α bên trong vỏ virus [25]

Bao bọc hạt virus là một lớp vỏ lipid kép có nguồn gốc từ màng tế bào nhiễm được gắn protein màng của virus, đóng vai trò bảo vệ vật chất di truyền RNA của

virus Bề mặt ngoài của vỏ được bao phủ bởi các glycoprotein phân bố dày đặc Mỗi glycoprotein có kích thước dài khoảng 10 – 14 nm, đường kính 4 – 6 nm Virus cúm có hai loại protein kháng nguyên đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus là haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA) Các phân tử HA và NA phân bố không đồng đều (cứ 4 – 5 phân tử HA thì có 1 phân tử NA) [25] Ngoài ra trên bề mặt

vỏ còn có protein M2 nằm xuyên qua màng lipit kép và hoạt động như kênh vận chuyển ion Xen giữa hạt virus và vỏ là lớp protein nền M1 (matrix)

oC và ở 60 oC trong 30 phút, bị bất hoạt ở 0 oC trong 30 ngày, chỉ tồn tại trong cơ thể người trong 7 – 8 ngày

1.1.2 Đặc điểm các phân đoạn gen của virus

Virus cúm có hệ gen là RNA sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn gen riêng biệt mang tên từ 1 – 8 theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử, mã hóa tổng hợp cho 11 protein (Hình 1.2) Trong hệ gen các phân đoạn 1; 2; 3; 5; 7; 8 có độ dài tương đối ổn

định và có tính bảo thủ cao Hai phân đoạn 4 và 6 mã hóa cho các protein bề mặt của virus (HA và NA) có độ dài không ổn định và đặc trưng theo từng chủng virus [7]

Hình 1.2: Mô hình cấu trúc virus cúm A/H1N1

 Phân đoạn 1 có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PB2 Enzym này có khối lượng phân tử khoảng 84 kDa, là tiểu đơn vị thành phần trong phức hợp enzym polymerase chịu trách nhiệm khởi đầu phiên mã RNA của virus Tính thích nghi nhiệt độ cơ thể loài vật chủ có liên quan đến vị trí amino axít 627 ở protein PB2

 Phân đoạn 2 có kích thước 2431 bp, mã hóa tổng hợp enzym PB1 PB1 có khối lượng phân tử khoảng 87 kDa, là tiểu đơn vị xúc tác của phức hợp enzym polymerase chịu trách nhiệm gắn mũ RNA trong quá trình tổng hợp RNA virus [5] Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện thêm một protein PB1 - F2 được mã hóa bởi một khung đọc mở khác của phân đoạn 2 [24]

 Phân đoạn 3 có kích thước 2233 bp, mã hóa tổng hợp protein enzym PA PA

có khối lượng phân tử khoảng 83 kDa, là một tiểu đơn vị của enzym polymerase chịu trách nhiệm kéo dài sự phiên mã RNA trong quá trình tổng hợp RNA của virus Phân đoạn gen này có tính bảo tồn cao

 Phân đoạn 4 chịu trách nhiệm mã hóa tổng hợp protein HA - kháng nguyên bề mặt virus cúm Phân đoạn này gồm hai tiểu phần là HA1 và HA2có độ dài thay đổi tuỳ

theo từng chủng virus cúm A, ở A/H1N1 là 1778 bp Protein HA có khối lượng phân tử khoảng 63 kDa, đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus và có khả năng gây ngưng kết hồng cầu Vùng nối giữa HA1 và HA2 là một số amino axít mang tính kiềm được mã hóa bởi một chuỗi oligonucleotide Vùng này chứa vị trí nhận biết

và cắt đặc hiệu của một số enzym protease của vật chủ và là vùng quyết định độc lực

của virus [11]

 Phân đoạn 5 có kích thước khoảng 1556 bp, mã hóa tổng hợp nucleoprotein (NP) Protein NP là thành phần của phức hệ phiên mã chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ, có khối lượng phân tử khoảng 56 kDa, tồn tại trong các hạt virus ở dạng kết hợp với mỗi phân đoạn RNA trong hệ gen virus tạo cấu trúc nucleocapsid đối xứng xoắn bền vững

 Phân đoạn 6 mã hóa tổng hợp protein NA - kháng nguyên bề mặt capsid của virus Chiều dài phân đoạn gen này thay đổi theo từng chủng virus cúm A (ở cúm A/H6N2 là 1413 bp, ở cúm A/H5N1 thay đổi khoảng từ 1350 – 1410 bp) Cùng với kháng nguyên HA, NA đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự lây nhiễm của virus trong tế bào vật chủ, giúp quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn và giải phóng hạt virus ra khỏi tế bào bị nhiễm [31]

 Phân đoạn 7 có kích thước khoảng 1027 bp, mã hóa cho protein M của virus gồm hai tiểu phần là M1 và M2 được dịch mã từ những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA Protein M1 là protein nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp RNP và tham gia vào quá trình nảy chồi của virus [25] Protein M2 là chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử là 11 kDa Đây là protein xuyên màng cần thiết cho quá trình lây nhiễm của virus và chịu trách nhiệm cởi

áo virus trong quá trình xâm nhiễm trên vật chủ

 Phân đoạn 8 mã hóa tổng hợp protein không cấu trúc Phân đoạn này có độ dài

ổn định nhất trong hệ gen của virus cúm A, kích thước khoảng 890 bp, mã hóa tổng hợp hai protein là NS1 và NS2 có vai trò bảo vệ hệ gen của virus Protein NS1 có khối

lượng phân tử theo tính toán là 27 kDa, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA thông tin của virus từ nhân ra bào tương tế bào nhiễm và tác động lên các RNA vận chuyển cũng như các quá trình cắt và dịch mã của tế bào chủ, ức chế sự cắt dán tiền RNA thông tin Ngoài ra, NS1 có thể ức chế đáp ứng interferon trong các tế bào nhiễm virus, làm cho

sự sinh sản virus không bị cản trở NS2 là protein được dịch mã từ hai đoạn gen, có khối lượng phân tử khoảng 14 kDa, đóng vai trò vận chuyển các RNP của virus ra khỏi nhân tế bào nhiễm để lắp ráp với capsid tạo nên hạt virus mới

1.1.3 Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của virus cúm trong tế bào vật chủ

Virus cúm A/H1N1 thuộc dạng kí sinh nội bào bắt buộc Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm, bắt đầu bằng sự kết hợp của HA và thụ thể thích ứng trên bề mặt các

tế bào Màng tế bào bị uốn dần vào trong, bao quanh hạt virus, đưa virus vào trong tế bào và tách ra tạo thành các khoang ẩm bào (endosome) pH trong các endosome giảm dần do tế bào tích cực bơm ion H+ vào môi trường thủy phân các chất Hoạt tính của kênh ion M2 được gia tăng để cho các ion tràn vào bên trong vi hạt, dẫn đến pH thấp

Do kết quả này, cầu nối HA - M1 bị nhiễu loạn, vi hạt mở ra và HA hòa với lớp màng trong của màng nội bào Các ribonucleoprotein được phóng thích vào trong bào tương

và được vận chuyển tới hân tế bào Tại đây phức hợp bị phá vỡ và sự tổng hợp RNA virus bắt đầu Quá trình cởi vỏ bọc hoàn tất chỉ trong vòng 20 – 30 phút kể từ khi virus gắn vào tế bào [31], (Hình 1.3)

Hình 1.3: Chu trình xâm nhiễm và sao chép của virus cúm trong tế bào vật chủ

Trong nhân tế bào, virus lợi dụng bộ máy tổng hợp của tế bào vật chủ để tổng hợp nên RNA thông tin (mRNA) từ RNA hệ gen virus Các sợi mRNA được vận chuyển ra bào tương tham gia vào quá trình tổng hợp các protein virus Các protein mới được tổng hợp được đưa trở lại nhân tế bào tham gia vào quá trình tổng hợp các sợi RNA dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus

Từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ

RNA-polymerase Các sợi này không được Adenine hóa (gắn thêm các Adenine - gắn

mũ) ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein tạo thành phức hợp

ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương tế bào [30] Các phân

tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn lên mặt ngoài của màng

tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi Khi đạt đủ nồng độ tại màng bào tương, các RNP và M1 kết tụ lại thành những vi hạt của virus Nhờ hoạt tính của neuraminidase các hạt virus này được phóng thích ra khỏi tế bào và lại tiếp tục xâm nhiễm vào tế bào khác theo chu trình tương tự [20]

1.1.4 Các kháng nguyên quan trọng của virus cúm

1 1.4.1 Hemagglutinin (HA)

HA là kháng nguyên bề mặt chủ yếu của virus cúm và là đích để kháng thể trung hòa Nó đóng vai trò gắn virus vào thụ thể tế bào vật chủ, hòa tan màng tế bào, giải phóng RNA hệ gen để thực hiện quá trình nhân lên trong tế bào cảm nhiễm Có tới

400 phân tử HA trên bề mặt capsid của virus Mỗi phân tử có dạng hình trụ, dài khoảng

130 Ao, cấu tạo gồm ba đơn phân Mỗi đơn phân được tạo thành dưới hai đơn vị HA1

và HA2 liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide Tiểu phần HA2 có dạng sợi, đóng vai trò gắn kháng nguyên vào màng virus Phần đầu tự do hình chỏm cầu được tạo bởi tiểu đơn vị HA1 Tiểu phần này có chứa những thụ thể đặc hiệu, đóng vai trò gắn virus vào màng tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm [11] Đoạn polypeptide liên kết giữa hai tiểu phần HA1 và HA2 là trình tự nhận biết của một số protease trong tế bào vật chủ Đối với chủng virus thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAI),

vị trí liên kết hai tiểu phần HA thường là một chuỗi amino acid kiềm, dễ dàng bị cắt bởi các protease thông thường có mặt trong nhiều loại mô tế bào và các cơ quan khác nhau trong cơ thể Do đó, virus có thể nhân lên trong toàn bộ cơ thể, gây nguy hiểm tới tính mạng vật chủ

Hình 2.3: Mô hình cấu trúc phân tử HA

Các nhà khoa học đã phát hiện 17 loại HA gây bệnh ở gia cầm và vật nuôi, nhưng chỉ có 3 loại là có khả năng gây bệnh ở người (H1, H2 và H3) Sự phù hợp cấu hình không gian giữa thụ thể chứa axít sialic của tế bào đích với vị trí gắn thụ thể này trên phân tử HA của virus cúm quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus đối với các loài vật chủ khác nhau Ở hầu hết các loại virus cúm lưu hành trong tự nhiên, vị trí amino axít 226 và 228 của tiểu phần HA1 quyết định khả năng liên kết của protein HA với thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào chủ Sự thay đổi các amino axít trên làm thay đổi thụ thể đặc trưng của virus, giúp virus vượt qua rào cản loài và thích ứng với một loại

vật chủ mới Protein HA của virus cúm gia cầm chứa gốc Gln 226 và Gly 228 hình thành nên một dạng hốc hẹp phù hợp để gắn thụ thể axít sialic dạng α2,3 Trong khi

đó, chủng virus gây bệnh ở người chứa Leu 226 và Ser 228 hình thành nên một dạng hốc rộng để thích hợp với axít sialic dạng α2,6 Do đó, đột biến điểm trên HA có thể chuyển đổi đặc tính gắn thích hợp sang axít sialic dạng α2,6 Đây chính là điều kiện cần để chúng tiến hóa thành một chủng có khả năng gây nên dịch cúm ở người [32]

1.1.4 2 Neurominidase (NA)

Protein neurominidase còn gọi là sialidase là một protein có bản chất là glycoprotein được gắn trên bề mặt capsid của virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trưng theo từng phân type NA Có khoảng 100 phân tử NA xen giữa các phân tử

HA trên bề mặt capsid hạt virus Phân tử NA có dạng nút lồi hình nấm, đầu tự do (chứa vùng hoạt động) gồm 4 tiểu phần dưới đơn vị giống như hình cầu nằm trên cùng một mặt phẳng, và phần kị nước gắn vào vỏ capsid Protein NA có vai trò là một enzym cắt đứt liên kết giữa gốc sialic acid của màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate của protein HA, giải phóng hạt virus ra khỏi màng tế bào vật chủ, đẩy nhanh sự lây nhiễm của virus trong cơ thể vật chủ, và ngăn cản sự tập hợp của các hạt virus mới trên màng

tế bào Mặt khác, NA tham gia vào phân cắt liên kết này trong giai đoạn “hòa màng”, đẩy nhanh quá trình cởi áo “uncoating” giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương tế bào, giúp cho quá trình nhân lên của virus diễn ra nhanh hơn Ngoài ra, NA còn phân cắt các liên kết glycoside, giải phóng neuraminic acid làm tan loãng màng nhầy bề mặt biểu mô đường hô hấp, tạo điều kiện cho virus nhanh chóng tiếp cận tế bào biểu mô và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu Cùng với vai trò của kháng nguyên HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh của virus cúm A ở cơ thể vật chủ Do đó, NA là đích tác động của các thuốc, hóa dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, đặc biệt là Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu) phong tỏa enzym này, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích, bảo vệ cơ Bên cạnh đó, NA còn là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia

kích thích hệ thống miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng

nguyên NA của các chủng virus đương nhiễm có tác dụng phong tỏa protein NA Như

vậy, kháng nguyên NA cùng với kháng nguyên HA của virus là các đích chủ yếu của

cơ chế bảo hộ miễn dịch của cơ thể với virus cúm A, và là cơ sở điều chế các vaccine

phòng cúm hiện nay cho người và gia cầm, nhằm ngăn chặn dịch cúm ở gia cầm và hạn

chế lây truyền sang người

Men neuraminidase có dạng nút lồi hình nấm trên bề mặt virus Nó có một đầu

gồm 4 tiểu đơn vị hình dạng gần hình cầu trên cùng mặt phẳng, và một vùng kị nước

gắn vào bên trong màng virus Đây là gen mã hóa tổng hợp protein NA, kháng nguyên

bề mặt capsid của virus, có khối lượng phân tử khoảng 50.103 Dal Các nghiên cứu

phân tử gen NA của virus cúm cho thấy phần đầu 5’- của gen này (hay phần tận cùng

N của polypeptide NA) có tính biến đổi cao và phức tạp giữa các chủng virus cúm A,

sự thay đổi này liên quan đến quá trình thích ứng và gây bệnh của virus cúm trên nhiều

đối tượng vật chủ khác nhau Đặc trưng biến đổi của gen NA trong virus cúm A là hiện

tượng đột biến trượt-xóa một đoạn gen là 57 nucleotide, rồi sau đó là 60 nucleotide,

làm cho độ dài vốn có trước đây của NA(N1) là 1410 bp còn 1350 bp

1.1.4.3 Matrix protein ( M1) của virus cúm

Hình 2.4 Cấu trúc siêu hiển vi của M1 (A) và cấu trúc không gian 3 chiều của M1 (B)

M1 là một loại protein nền bao quanh vRNP, liên kết vRNP với vỏ virus và

kênh ion ( Hiện nay đã biết được trình tự acidamine từ 91 đến 116 và từ 165 đến 252

thực hiện chức năng này) M1 có trọng lượng khoảng 27.8 kDal Đơn phân của M1 là

A B

các cấu trúc hình que dài khoảng 60A0 Các nghiên cứu về protein M1 đã chỉ rằng M1 chứa hai cấu trúc cơ bản là α – Helicase ( được đánh dấu từ H1 đến H9) và cấu trúc cặp tóc – loop ( được đánh dấu từ L1 đến L8) Theo tính chất hóa sinh M1 được phân chia thành hai vùng acidamine tạo cấu trúc hình cầu Vùng thứ nhất từ acidamine số 1 đến 164 và vùng thứ hai từ acidamine 165 đến 252 Hai vùng này được nối với nhau bởi vùng nhạy cảm với protease, do vậy trong quá trình tinh sạch và biểu hiện nếu có mặt của protease nó thường bị loại bỏ [16]

Protein M1 không chỉ là thành phần cấu trúc của virion, mà nó còn thực hiện rất nhiều chức năng trong chu trình sống của virus, đó là:

 Tương tác với vRNP và NS2 và vận chuyển vRNP ra vào nhân, M1 là yếu tố điều chỉnh quá trình xuất nhập này Sau khi virus đi vào endoxom dưới tác dụng của pH thấp do sự vận chuyển của ion H+ qua kênh ion M2 của virus và phức hợp M1 - vRNP bị phân tách hoàn toàn cho phép vRNP đi vào nhân Ngược lại, khi các vRNP mới được tạo thành trong nhân thì M1 và NS2 sẽ đi vào nhân và kết hợp với vRNP cùng được vận chuyển ra khỏi nhân Sự tương tác của M1 với vRNP đã được nghiên cứu khá rõ Hai vùng trong M1 bám vào RNA được xác định ở hai vùng độc lập: ngón tay kẽm (a zinc finger motif, ở vị trí axit amin 148 tới 162) và một chuỗi axit amin KKLKR (ở vị trí axit amin 101 tới 105)

 Điều hòa sao chép vRNP; vRNP chỉ được sao chép khi tách khỏi M1

 Tương tác với protein vỏ của virus HA, NA, M2 trong quá trình nảy chồi

 Huy động các thành phần của virus với vị trí lắp ráp và khởi đầu nảy chồi

 M1 là yếu tố trung tâm trong việc lắp ráp các thành phần của virus phân

tử M1 liên kết với vRNP, màng tế bào qua các đuôi hướng tế bào chất của cả hai glicoprotein là HA, NA, một số phân tử M1 khác thì tạo thành một lớp dưới vỏ bọc của virus Liên kết của M1 với màng dựa vào sự tổ hợp của cả hai tương tác tĩnh điện và kỵ nước cũng như sự tương tác của protein đặc hiệu với protein vỏ

 Huy động các thành phần của tế bào chủ cho việc hoàn thiện nảy chồi và

sự giải phóng virus

 Tỷ lệ M1/NP của phân tử virus ảnh hướng đến hình thái của virion và sự lan truyền của virus khi được giải phóng

Hình 2.5 Ảnh hiển vi điện tử chụp các thể virus cúm A đang tiến hành nảy chồi và vai

trò của các yếu tố tham gia trong quá trình nảy chồi

(nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov)

1.1.5 Tình hình dịch bệnh H1N1

Chủng virus cúm A/H1N1/09 được phát hiện lần đầu tiên trên thế giới ở Mêxico vào tháng 3/2009, đến tháng 4/2009 bệnh lây nhanh thành dịch sang các bang Texas, California, rồi lan sang nhiều nơi tại Mỹ và các nước Bắc bán cầu Trước tình hình cúm diễn biến ngày 25/4/2009 tổ chức y tế thế giới (WHO) chỉ đưa cảnh báo dịch lây lan cấp độ 3 (chưa lây người sang người), nhưng sau 5 ngày sau nâng lên cấp 4 (đã xuất hiện cúm lây từ người sang người), sau 6 tuần sau nâng lên cấp 6 cấp đại dịch ( lây lan rộng khắp cộng đồng) Theo thông báo của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ngày 06/8/2010, toàn thế giới đã ghi nhận 214 quốc gia và vùng lãnh thổ có xét nghiệm dương tính với virus cúm A(H1N1), trong đó 18.449 trường hợp tử vong rải rác tại các khu vực như Trung Mỹ, Nam châu Á, Ấn Độ, Nepal và Bhutan

Ngày 10/8/2010, sau 14 tháng tuyên bố đại dịch cúm A(H1N1) trên toàn cầu tổ chức Y tế Thế giới đã đưa ra Thông báo: Thế giới không còn trong giai đoạn đại dịch cúm (giai đoạn 6) mà đã chuyển sang giai đoạn sau đại dịch ( theo http://vncdc.gov.vn)

Tại Việt Nam trường hợp nhiễm cúm A/ H1N1 đầu tiên là một du học sinh từ

Mỹ Sau 03 tháng từ khi dịch lây ra cộng đồng đã có tới 7156 trường hợp nhiễm bệnh trong đó có 09 ca tử vong Nguyên nhân do biến chứng phổi nặng dẫn đến suy hô hấp cấp rồi suy đa tạng Theo ghi nhận của các nước một khi dịch bệnh bùng phát tốc độ lan truyền sẽ tăng theo cấp số nhân, nguy cơ mắc bệnh và tử vong sẽ tiến dần tới đỉnh cao Ngày 22/01/2011 đã xuất hiện ca tử vong đầu tiên do cúm H1N1 trong năm 2011

( theo www.soyte.hanoi.gov.vn) Tình hình hiện tại của H1N1 bắt đầu đáng lo ngại

thông tin trên cho thấy cúm A/H1N1 vẫn đang tiềm tàng nguy cơ bùng phát cao khuyến cáo mọi người cần thực hiện tốt công tác phòng chống dịch để hạn chế sự tái bùng phát của dịch cúm A/H1N1 Trước tình hình cúm hiện nay cho thấy việc tạo ra vaccine tối ưu hóa trong việc phòng chống cúm đặc biệt là cúm H1N1 là vấn đề cấp thiết

1.2 Vaccine phòng chống cúm

1.2.1 Đại cương về vaccine

Mỗi khi dịch cúm bùng phát, các quốc gia thường có những biện pháp kiểm soát

vệ sinh như đeo khẩu trang, rửa tay bằng xà phòng đặc biệt là sau khi ho, hắt hơi vì virus cúm A/H1N1 có sức đề kháng yếu, dễ bị bất hoạt bởi bức xạ mặt trời, tia cực tím

và các chất tẩy rửa thông thường (xà phòng, chất tẩy natri hypochlorite 0,05%, cồn Ethanol 70 0…) Đồng thời tiến hành tiêu hủy gia súc bị nhiễm bệnh hoặc nghi là bị nhiễm tại khu vực có dịch Tuy nhiên, việc làm này là chưa đủ để ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh, đặc biệt là những khu đông dân cư và có mật độ động vật nuôi cao vì virus cúm A/H1N1 có thể tồn tại hàng giờ ở ngoại cảnh, đặc biệt khi thời tiết lạnh Ngoài ra bệnh còn gây ảnh hưởng nặng nề tới nền kinh tế mỗi quốc gia và đặc biệt là người nông dân, môi trường sinh thái bị ô nhiễm ảnh hưởng tới sức khỏe con người Trên thực tế, thế giới đã sử dụng phổ biến một số loại thuốc dùng trong điều trị cúm A,

cơ chế hoạt động của thuốc dựa trên chu trình hoạt động của virus cúm Cụ thể là:

Amantadine và Rimantadine: Đây là hai loại thuốc cản trở sự hoạt động của

kênh ion M2 Dẫn tới ức chế quá trình cởi bỏ lớp vở ngoài của virus vRNP không được đưa vào nhân cài xen vào gemone của tế bào chủ Ở nồng độ nhỏ Amantadine gây hiệu quả cao với virus cúm A song kém hiệu quả với virus cúm B và C ( do sự khác biệt về kênh ion) Amantadine còn hoạt động như một bazo yếu, trung hòa H+

trong endosome và bộ máy golgi Trong hai loại thuốc này thì Rimantadine được sử

dụng phổ biến hơn vì gây ít tác dụng phụ Tuy nhiên thực tế chúng đều gây tác đông phụ tới hệ thần kinh đồng thời cũng xuất hiện những chủng cúm kháng thuốc Sự kháng thuốc này chủ yếu liên quan tới các đột biến xảy ra trong trình tự nucleotid mã hóa cho kênh M2

Leptomycine B: Cơ chế của loại thuốc này là ngăn cản sự vận chuyển vRNP ra

khỏi nhân tế bào

Zanamivir ( Relenza) và Tamiflu (Oseltmavir): hai loại này có cấu hình không

gian tương tự như NA Do vậy chúng ngăn cản sự liên kết của NA với các thụ thể sialic acid, cản trở quá trình giải phóng virus, ức chế sự lan nhiễm virus

Việc tiêm phòng được xem là lựa chọn đầu tiên để chống lại sự xâm nhiễm và lây lan của dịch cúm Trên thế giới có nhiều quốc gia tham gia vào việc nghiên cứu sản xuất vaccine phòng cúm , chủ yếu tập trung ở những nước phát triển như: Mỹ, Pháp, Đức, Hà Lan, … Với mỗi loại vaccine, yêu cầu cơ bản là phải có tính miễn dịch bảo

hộ, tính kháng nguyên, tính đặc hiệu và tính không độc Việt Nam đang trong giai đoạn tập duyệt sản xuất vaccine để phòng cúm H1N1 Các vắc-xin ngừa bệnh cúm mùa trước đây không có hiệu quả đối với cúm A /H1N1 mới Các vaccine phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vaccine truyền thống và vaccine thế hệ mới

 Vaccine truyền thống:

- Vaccine bất hoạt:

Vaccine này được tạo ra từ các chủng virus ngoài tự nhiên, đã bị làm bất hoạt bằng các tác nhân lý hóa khác nhau và không còn khả năng nhân lên trong vật chủ [5] Hiện nay, phương pháp tạo vaccine này được sử dụng phổ biến nhất là nuôi virus trong trứng rồi làm bất hoạt bằng các tác nhân vật lý như: nhiệt độ, sóng siêu âm, tia tử ngoại, hay các tác nhân hóa học như: các loại thuốc nhuộm, axít, formol Loại vaccine này có ưu điểm dễ sản xuất và bảo quản, giá thành rẻ, độ an toàn cao Tuy nhiên, nhược điểm lớn của loại vaccine này là gây đáp ứng miễn dịch ngắn hạn, cần tiêm nhắc lại nhiều lần, khả năng sinh đáp ứng miễn dịch chậm, lượng vaccine tiêm mỗi lần nhiều

và hiệu quả không cao

- Vaccine giảm độc lực:

Là loại vaccine đã được làm nhược độc hoặc vô độc nhưng vẫn bảo toàn tính kháng nguyên Thường vaccine được tạo từ các loại virus đã bị làm mất các gen quy định tính độc, do đó không còn khả năng gây bệnh nhưng vẫn còn khả năng gây đáp ứng miễn dịch Vaccine này có khả năng sinh đáp ứng miễn dịch nhanh chóng và tốt hơn vaccine bất hoạt, tác dụng bảo vệ phòng bệnh hiệu quả, không phải tiêm nhắc nhiều lần Theo một số nghiên cứu, loại vaccine này có khả năng bảo vệ chéo giữa các chủng virus cúm A khác nhau Tuy nhiên, mức độ an toàn của loại vaccine này thấp hơn so với vaccine bất hoạt do có khả năng biến đổi thành kiểu hoang dại và gây bệnh

Vaccine DNA:

Gen mã hóa kháng nguyên gây bệnh của virus được gắn vào một vector biểu hiện cùng với một promoter mạnh có khả năng biểu hiện tốt trong tế bào vật chủ Khi biến nạp thành công vào vật chủ, protein kháng nguyên sẽ được tổng hợp ra từ gen mã hóa cho kháng nguyên và kích thích cơ thể sinh miễn dịch chống lại protein đó Vaccine DNA rất gọn nhẹ, an toàn, phương thức gây miễn dịch đơn giản do chỉ chứa

DNA thuần khiết nên bền với nhiệt độ

Vaccine virus nhược độc nhân tạo sản xuất bằng kĩ thuật di truyền ngược:

Phương pháp này được áp dụng cho virus có hệ gen gồm một sợi RNA gồm nhiều phân đoạn nhỏ Các phân đoạn được lắp ghép tạo thành virus với đầy đủ hệ gen Trong

đó, các gen kháng nguyên H5 có vùng độc được biến đổi bằng kỹ thuật gen Có 3 loại vaccine đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vaccine trên thế giới hiện nay đó là NIBRG - 14 (NIBSC), VN/04xPR8 - rg (SJCRH) và VNH5N1 - PR8/CDC - rg (CDC)

Vaccine dưới đơn vị:

Là loại vaccine chỉ sử dụng một phần của hạt virus để kích thích đáp ứng miễn dịch Do các kháng nguyên đã được tinh chế khi sử dụng làm vaccine nên có độ an toàn cao, không gây các phản ứng phụ Quy trình sản xuất lượng lớn vaccine dưới đơn

vị khá đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp và đắt tiền

1.2.2 Tổng quan về VLPs

Công nghệ VLPs đã được khai triển bởi nhiều trung tâm nghiên cứu và đại học quốc tế để tạo vaccine thế hệ mới cho nhiều tác nhân virus như H1N1, H5N1, Adenovirus, HIV, Hepatitis C, Respiratory Syncytial (RSV), Varicella Zoster (VZV), Ebola, Chikungunya Novavax Inc là một trong những công ty đầu ngành khai triển VLPs cho các vaxin cúm ở Hoa Kỳ và một số nơi trên thế giới Các thử nghiệm của Novavax Inc trên sinh vật và lâm sàng ở người đã cho kết quả tốt đẹp, an toàn và có khả năng cao cho việc thương mại hóa trên thị trường trong tương lai

Về mặt cấu tạo VLPs được gọi là hạt giả virus vì hình thái cấu trúc của nó tương

tự như một virus tự nhiên Phía ngoài là lớp vỏ chứa thành phần chủ yếu là lớp kép photpholipid của tế bào vật chủ và các loại protein đặc trưng của từng chủng virus Tuy vậy bên trong của VLPs lại trống, không có lõi chứa vật liệu di truyền – đây là nguyên nhân khiến VLPs không gây hại cho tế bào vật chủ sau khi xâm nhiễm

Hình 2.6 Cấu trúc VLPs

Về phần kỹ thuật, VLPs là phương pháp cloning trình tự DNA của các siêu vi để tạo protein tái tổ hợp làm kháng nguyên cho vaccine Điểm đặc biệt là các protein kháng nguyên này có hình dạng và kích thước giống một virus nhưng không có DNA/RNA của virus Các ưu điểm của VLPs vaccine bao gồm:

Độ an toàn rất cao vì kháng nguyên VLPs không còn DNA/RNA của nhân

Ngoài ra, phương pháp của VLPs an toàn hơn phương pháp dung trứng trong việc sản xuất vaccine cổ điển Do tính an toàn, việc tạo VLPs cho hầu hết các tác nhân bệnh lý được thực hiện trong điều kiện thường của phòng thí nghiệm, không đòi hỏi những kỹ thuật hoặc phòng thí nghiệm độ an toàn quá cao như đối với các trường hợp tạo vaccine cổ điển

Khả năng tạo kháng thể mạnh và chuyên biệt Các kết quả nghiên cứu và thử

nghiệm đã cho thấy VLPs thường gây miễn dịch nhiều hơn các tiểu đơn vị hoặc các protein kháng nguyên tái tổ hợp, và có thể kích thích cả miễn dịch dịch thể và tế bào T của hệ miễn dịch [19] Vì vậy VLPs sẽ kích thích hệ miễn dịch tạo kháng thể chống

cấu trúc ba chiều (3D structure) và hai chiều (linear structure) của VLPs kháng nguyên

Sản xuất nhanh để đáp ứng khi dịch bệnh bộc phát Phương pháp cloning và dung

tế bào như Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) của côn trùng ( bởi hãng Novavax Inc.) hoặc

tế bào thực vật của cây thuốc lá và Alfalfa (dùng bởi hãng Medicaga Inc.) để tạo protein tái tổ hợp VLPs làm kháng nguyên có thể được thực hiện từ vài tuần đến hai tháng thay vì sáu tháng như vaccine cổ điển dùng trứng Ưu điểm này rất cần để tạo vaccine đáp ứng sự bộc phát và thay đổi gen (mutation) một cách nhanh chóng của các virus

Giá sản xuất thấp và khả thi ở Việt Nam Các định giá về mặt sản xuất VLPs cho

thấy phương pháp VLPs có giá thành thấp vì cloning có khả năng tạo số lượng kháng nguyên rất cao, gấp nhiều lần so với vaccine cổ điển

Để khai triển ứng dụng kết quả nghiên cứu vaccine VLP - H1N1, trước hết xét về mặt kĩ thuật sẽ phải biểu hiện 3 loại protein tương ứng của gen NA, HA, M1 của virus H1N1, sau đó VLPs được tạo ra bằng việc tổ hợp của ba loại protein, đồng thời cần thiết lập những thử nghiệm lâm sàng để minh chứng độ an toàn và hữu hiệu trong cộng đồng Nghiên cứu thành công VLP/H1N1 sẽ mở ra một đường hướng mới để tạo những loại vaccine cần thiết cho việc tiêm chủng ở Việt Nam để góp phần vào nỗ lực ngăn ngừa dịch bệnh hàng năm hoặc đột phá xảy ra trong tương lai

Hình 2.7: Mô hình chung của phương pháp tạo VLPs của H1N1 (A) và các bước

cơ bản trong quy trình tạo VLPs H1N1(B)

1.3 Hệ thống biểu hiện Baculovirus

Baculovirus là nhóm virus kí sinh ở hơn 600 loài côn trùng khác nhau Cái tên

Baculovirus bắt nguồn từ chữ baculum trong tiếng Latinh - có nghĩa là hình que, mô tả

hình dạng của virus Khi những côn trùng bị nhiễm độc baculovirus sẽ gây biến tính

cấu trúc keo, đặc biệt đối với các polyhedrin protein Trong môi trường sống của virus,

polyhedrin protein có chức năng bảo vệ virus khỏi tia cực tím

Baculoviruses

Tế bào côn trùng có thể thực hiện nhiều sửa đổi hợp lý đối với các hoạt động

sinh học của các protein phức tạp như quá trình đường hóa, sự hình thành mối liên kết

disulfua, và sự photphoryl hóa

Nhiều năm qua, hàng ngàn gen đã được tái bản thành công và nhanh chóng

trong tế bào côn trùng Với hệ thống sản xuất BEVS, protein có thể được sản xuất thời

gian tính theo tuần, thay vì tính thời gian theo tháng hay năm, bởi vì dòng gen của virus đƣợc biến đổi về mặt di truyền để gây độc cho tế bào côn trùng

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng virus cúm A/H1N1 đã được bất hoạt trong dung dịch Trizol được lưu giữ tại phòng Vi sinh phân tử - Viện Công nghệ sinh học

Hình 2.1: Sơ đồ vector pCR2.1

2.2.2 Vector biểu hiện trong tế bào côn trùng

Vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO đƣợc sử dụng để biểu hiện gen M1 trong tế bào côn trùng Vector có ƣu điểm nổi bật là sử dụng promoter polyhedrin của virus đa nhân (AcMNPV -Autographa californica Multiple Nuclear Polyhedrosis Virus) để biểu hiện các gen mong muốn ở mức độ cao (Crawford, Miller, 1998) Ngoài ra, vector này còn có thêm một số đặc điểm ƣu việt cho việc biểu hiện, gồm có:

Có đoạn peptide đầu C mã hóa epitop V5 và 6 Histidine thích hợp cho việc phát hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp

Có tín hiệu polyadenin hóa của SV40 tăng cường kết thúc dịch mã và tính ổn định cho mRNA

Mang promoter early-to-late (ETL) để biểu hiện β-galactosidase thích hợp cho việc chọn lọc các dòng tế bào côn trùng mang virus tái tổ hợp bằng X-gal (Vialard et al., 1990)

2.2.3 Hóa chất và sinh phẩm

Sinh phẩm:

 Bộ Kit tách dòng – TA cloning Kit (Invitrogen)

 Kit tinh sạch plasmid – S.N.A.P.TM (Invitrogen)

 Kit thôi gel – S.N.A.P free UV (Invitrogen)

 Kit tinh sạch sản phẩm PCR (Fermentas, Đức)

Hóa chất:

Các hóa chất dùng cho nghiên cứu được cung cấp từ các hãng BioRad, Invitrogen, New EnglDNA Biolabs, Sigma (Mỹ), Fermentas, Merck (Đức): cao nấm men, trypton, agar, Amp, X- gal, EDTA, MgCl2, SDS 10%, ethanol, NaCl, SolI, Sol II, Sol III

Các enzym giới hạn BamH I và Hind III (New EnglDNA Biolabs, Mỹ), T4 DNA ligase (Invitrogen, Mỹ)

2.2.4 Trang thiết bị:

 Lò vi sóng (Samsung)

 Máy lắc ổn nhiệt 37°C (Multitron-Đức)

 Máy khuấy từ (Rotolab,Osi)

 Máy ly tâm (microcentrifuge-sorvall,Mỹ)

 Tủ lạnh sâu (Sanyo)

 Máy khuấy trộn vortex (rotolab,osi)

 Máy soi ảnh gel (BIO-RAD)

 Cân phân tích (mettle toledo)

 Tủ cấy vô trùng (Sanyo)

 Nồi khử trùng (Nhật Bản)

 Máy ly tâm lạnh (sorvall biofuge fresco)

 Bộ điện đi DNA

 Máy xác định trình tự DNA tự động (ABI 3100, applied biosystems-Mỹ)

 Máy PCR (MJ Research-Mỹ); pipettman các loại (gilson)

2.3 Phương pháp nghiên cứu:

2.3.1 Tách chiết RNA tổng số

 Virus được bất hoạt bằng trizol với tỷ lệ 1:1 bằng xy lanh trộn đều

 Bổ sung dung dịch chlorophorm vào huyền dịch virus đã được bất hoạt trong trizol, đảo đều trong khoảng 1 giây

 Lưu giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, li tâm 10.000v/p trong 10 phút

 Chuyển pha trên vào ống efpendof mới

 Bổ sung 0,5ml isopropanol Đảo đều để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

 Li tâm 12.000v/p trong 30 phút tại 40C để thu tủa RNA

 Rửa tủa bằng 1 ml ethanol 70%, li tâm 12.000v/p trong 15 phút ở 40C

 Làm khô RNA trong box, hòa lại mẫu với 20 ml nước vô trùng đã loại RNAse

2.3.2 Kiểm tra RNA bằng quang phổ kế

Nguyên tắc: dựa vào sự hấp phụ ánh sáng tia tử ngoại ở bước sóng 260 nm của các bazơ nito là purin và pirimidin

Nồng độ RNA sợi đơn (µg/ ml) được tính theo công thức:

CRNA = A260 x 40 x d Với d là độ pha loãng mẫu cần đo Cách tiến hành:

 Pha loãng dung dịch ARN 20 lần trong nước vô trùng ( 5 µl dung dịch ARN trong 95 µl H2O