1. 4.1 Hemagglutinin (HA)
2.3.10.Thu đoạn DNA từ gel agarose
Để thu đoạn DNA từ gel agarose, chỳng tụi sử dụng bộ sinh phẩm kit Bioneer. Quỏ trỡnh này gồm cỏc bƣớc cơ bản:
Lấy mẫu chạy điện di trờn gel agarose 1% cựng loading dye
Thu băng DNA cần quan tõm: đƣa bản gel lờn soi trờn tia cực tớm, cắt bDNA mong muốn, đƣa vào ống effpendop cõn xỏc định trọng lƣợng, bổ sung dung dịch thụi gel theo tỷ lệ 1:1
Ủ ở nhiệt độ 55 0 C trong 10 phỳt, đảo nhẹ cho gel tan hoàn toàn.
Li tõm 1000 vũng / phỳt
Gắn DNA lờn cột
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tỏch chiết RNA tổng số
Cỏc phõn tử RNA khụng bền, dễ bị phõn hủy bởi cỏc enzym cú bản chất là cỏc ribonuclease (RNase). Hơn nữa cỏc RNase lại cú mặt ở nhiều nơi nhƣ mồ hụi, tay ngƣời thao tỏc…. Vỡ vậy việc tỏch chiết RNA đũi hỏi nhiều biện phỏp thận trọng để trỏnh nhiễm RNase từ mụi trƣờng ngoài vào mẫu. Thao tỏc trong điều kiện vụ trựng, mọi dụng cụ húa chất đều đƣợc xử lớ bằng DEPC sau đú đƣợc khử trựng bằng nhiệt độ và ỏp suất cao, khi thao tỏc phải đeo găng tay…
RNA trong nghiờn cứu sinh học đũi hỏi phải cú độ tinh sạch cao (khụng lẫn protein, DNA). Để đo nồng độ và độ tinh sạch RNA cần dựng cho việc tạo cDNA chỳng tụi sử dụng phƣơng phỏp quang phổ kế xỏc đinh độ hấp phụ tại bƣớc súng 260nm (A260). Kết quả trỡnh bày tại bảng dƣới:
A260
(độ pha loóng 20 X)
Cụng thức tớnh Tỷ lệ A260/A280 Nồng độ RNA
0,13 0,13 x 40 x 20 1,87 104 μg/ml
Ở bảng trờn cho thấy, ƣớc tớnh cú 104 ng trong 1 àl dung dịch RNA đó tỏch chiết. RNA cú độ tinh sạch cao đủ điều kiện cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
3.2. Thiết kế hộp gen M1 của virus cỳm A/H1N1.
RNA tổng số tinh sạch đƣợc sử dụng để tạo cDNA sử dụng bộ kit tổng hợp cDNA của Invitrogen (Mỹ). Cỏc bƣớc tiến hành đƣợc mụ tả ở mục 2.2.3. Nguồn cDNA thu đƣợc sau đú đƣợc sử dụng làm khuụn để khuếch đại gen mó húa protein M1 bằng phƣơng phỏp PCR với cặp mồi đặc hiệu M1pBac-F và M1pBac-R.
Để gen M1 cú thể biểu hiện tốt trong tế bào cụn trựng chỳng tụi đƣa thờm trỡnh tự Kozak, trỡnh tự đúng vai trũ quan trọng trong việc khởi đầu quỏ trỡnh dịch mó ở sinh vật nhõn chuẩn (Kozak, 1987) vào đầu 5’ của gen ngay trƣớc mó mở đầu ATG của mồi xuụi. Sản phẩm PCR (hộp gen M1) đƣợc kiểm tra trờn gel agarose 1% (hỡnh 3.1). Kết quả cho thấy cú một băng DNA duy nhất với kớch thƣớc khoảng 780 bp tƣơng đƣơng với kớch thƣớc gen M1 cú gắn thờm cỏc trỡnh tự thiết yếu theo tớnh toỏn lý thuyết. Nhƣ vậy cú thể sơ bộ kết luận hộp gen M1 của virus cỳm A/H1N1 đó đƣợc khuếch đại đặc hiệu.
Hỡnh 3.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhõn gen M1 trờn gel agarose 1%.
1: thang DNA 1kb chuẩn (fermentas, Đức) 2: sản phẩm PCR
3.3. Tỏch dũng hộp gen M1 vào vector pCR2.1
Trƣớc khi đƣa vào vector biểu hiện baculovirus, sản phẩm PCR của gen M1
đƣợc tinh sạch qua kit tinh sạch PCR (Fermentas, Đức), sau đú đƣợc đƣa vào vector tỏch dũng pCR2.1 (Invitrogen, Mỹ). Việc tỏch dũng đƣợc thực hiện bằng cỏch gắn trực
1 2 2
tiếp sản phẩm PCR vào vector tỏch dũng pCR2.1 sau đú biến nạp vào E.coli rồi tỏch chiết lại plasmid để chọn lọc vector tỏi tổ hợp. Cỏc vector chứa gen M1 đƣợc kớ hiệu là pCRM1.
3.3.1. Gắn sản phẩm PCR chứa hộp gen M1 vào vector pCR2.1
Phản ứng gắn đƣợc thực hiện với mục đớch tạo vector tỏi tổ hợp mang đoạn gen cần tỏch dũng. Quỏ trỡnh gắn dựa vào đặc tớnh xỳc tỏc hỡnh thành liờn kết nối hai đoạn DNA của enzym T4 DNA ligase. Chỳng tụi sử dụng enzym T4 DNA ligase cú nguồn gốc từ phage T4 xõm nhiễm E.coli, enzym này cú khả năng nối hai trỡnh tự DNA cả đầu so le và đầu bằng. Mẫu đƣợc ủ ở 14°C trong 16 giờ. Đõy là nhiệt độ thớch hợp nhất cho enzym T4 DNA ligase hoạt động. Vector tỏi tổ hợp mong muốn sẽ là vector gắn với sản phẩm PCR mang gen mó húa protein M1.
3.3.2. Biến nạp vector tỏi tổ hợp vào tế bào E.coli chủng DH5α
Plasmid tỏi tổ hợp thu đƣợc từ phản ứng gắn trờn đƣợc biến nạp vào tế bào
E.coli chủng DH5α bằng phƣơng phỏp sốc nhiệt. Nhờ bộ mỏy tổng hợp của vi khuẩn,
plasmid sẽ đƣợc tạo ra cỏc bản sao với số lƣợng lớn. Sau khi biến nạp, thể biến nạp đƣợc cấy trải trờn mụi trƣờng LB đặc cú bổ sung Amp (100àg/ml), IPTG (1mM) và X- gal (100 àg/ml) (5- brome – 4 chloro -3 indonyl ò galactoside). Sau đú nuụi trong tủ ấm 370C qua đờm. Kết quả thu đƣợc hai loại khuẩn lạc cú màu xanh, trắng (hỡnh 3.2). Cỏc khuẩn lạc màu xanh đƣợc dự đoỏn là cỏc khuẩn lạc mang vector pCR2.1 khụng chứa hộp gen M1, vector tự đúng vũng. Điều này là do gen Lac-Z hoạt động bỡnh thƣờng, tổng hợp đƣợc enzym ò- galactosidase, enzym này sẽ thủy phõn cơ chất X- gal thành sản phẩm cú khả năng kết hợp với oxi tạo chất cú màu xanh da trời là 5,5 dibrome -4,4 dichloro indigo. Ngƣợc lại những khuẩn lạc màu trắng đƣợc dự đoỏn chứa vector tỏi tổ hợp mang hộp gen mó húa protein M1. Việc gen M1 chốn vào giữa Lac – promotor và gen cấu trỳc Lac –Z dẫn đến gen Lac – Z bị dịch chuyển khung đọc mở (ORF) do đú khụng tổng hợp đƣợc enzym ò- galactosidase.
Hỡnh 3.2: Kết quả biến nạp DNA plasmid vào DH5α (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.3. Tỏch chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli
Để chọn đƣợc dũng plasmid tỏi tổ hợp pCRM1 mang hộp gen M1, chỳng tụi nhặt một số khuẩn lạc trắng và một khuẩn lạc xanh, nuụi cấy trong mụi trƣờng LB cú bổ sung khỏng sinh Amp (100àg/ml), lắc tốc độ 200v/p ở 37°C qua đờm. Tỏch chiết plasmid từ cỏc tế bào nuụi cấy, sau đú tiến hành chạy điện di trờn gel agarose 1% kốm theo đối chứng là plasmid gốc. Kết quả đƣợc thể hiện ở hỡnh 3.3.
Hỡnh 3.3: Chọn lọc cỏc dũng plasmid pCR2.1 tỏi tổ hợp mang hộp gen M1 bằng điện di trờn gel agarose 1%.
Đƣờng chạy từ 1-4: DNA plasmid tỏch từ khuẩn lạc trắng Đƣờng chạy 5: DNA plasmid tỏch từ khuẩn lạc xanh
Theo lớ thuyết điện di thỡ phõn tử DNA nào cú kớch thƣớc càng lớn thỡ di chuyển càng chậm, tức là trờn ảnh quan sỏt đƣợc nú sẽ tạo đƣợc vạch sỏng cao hơn so với cỏc phõn tử DNA cú kớch thƣớc nhỏ hơn. Trong vector tỏi tổ hợp ngoài phần gốc là vector pCR2.1 cũn gắn thờm sản phẩm PCR nờn sẽ di chuyển chậm hơn vector gốc pCR2.1 là plasmid tỏch từ khuẩn lạc xanh.
Quan sỏt kết quả điện di trờn cho thấy cú sự chờnh lệch về kớch thƣớc giữa plasmid tỏch từ khuẩn lạc xanh và plasmid tỏch từ khuẩn lạc trắng. Cỏc plasmid từ 1 đến 4 đƣợc tỏch từ khuẩn lạc trắng đều cú đƣờng chạy cao hơn plasmid số 5 đƣợc tỏch từ khuẩn lạc xanh. Điều đú chứng tỏ cỏc dũng plasmid từ 1-4 cú khả năng mang hộp gen M1.
Để khẳng định cỏc plasmid đƣợc tỏch từ khuẩn lạc trắng cú mang hộp gen hay khụng chỳng tụi tiến hành kiểm tra bằng phản ứng cắt với enzym giới hạn.
3.3.4. Chọn lọc vector tỏi tổ hợp bằng cắt với enzym giới hạn
Để khẳng định chắc chắn cỏc dũng DNA plasmid cú mang hộp gen M1, chỳng tụi tiến hành cắt kiểm tra cỏc DNA plasmid này bằng enzym giới hạn BamH I và Hind III. Hai enzym này đƣợc gắn tƣơng ứng ở đầu 5’ và 3’ của gen. Theo lý thuyết, cỏc dũng plasmid gắn sản phẩm PCR sau khi đƣợc cắt bằng hai enzym giới hạn BamH I và
Hind III sẽ văng ra một đoạn cú kớch thƣớc tƣơng đƣơng với kớch thƣớc của sản phẩm PCR. Ba dũng plasmidcú kớch thƣớc lớn hơn plasmid gốc đƣợc chọn để phõn tớch tiếp bằng phản ứng cắt với hai enzym giới hạn BamH I và Hind III . Sau đú kiểm tra điện di trờn gel agarose 1% (hỡnh 3.4).
Hỡnh 3.4: Kiểm tra cỏc dũng vector tỏi tổ hợp mang hộp gen M1 bằng điện di trờn gel agarose 1%.
1: Sản phẩm PCR gen M1 (dựng làm đối chứng)
2 – 4 : 3 dũng DNA plasmid tỏi tổ hợp đƣợc xử lý bằng enzym giới hạn
BamH I và Hind III. M : Marker DNA
1 2 3 4 M
780bp
3000bp
Kết quả phõn tớch sản phẩm cắt DNA plasmid tỏi tổ hợp cho thấy ở đƣờng chạy số 3, 4 xuất hiện băng cú kớch thƣớc khoảng 780bp tƣơng đƣơng với kớch thƣớc của gen M1. Đƣờng chạy số 2 chỉ xuất hiện băng DNA plasmid mở vũng, cú khả năng plasmid này khụng mang sản phẩm PCR hoặc do trỡnh tự nhận biết của enzym giới hạn
BamH I và Hind III ở sản phẩm PCR đó bị biến đổi khiến cho enzym khụng thể nhận biết để cắt. Từ kết quả trờn, chỳng tụi cú thể kết luận sơ bộ đó thu đƣợc 2 dũng plasmid tỏi tổ hợp mang hộp gen M1. Tuy nhiờn để khẳng định cần cú cỏc phõn tớch tiếp theo.
3.4. Tinh sạch cỏc plasmid tỏi tổ hợp
Để khẳng định chớnh xỏc những plasmid tỏi tổ hợp mang hộp gen M1, chỳng tụi tiến hành giải trỡnh tự plasmid đú. Vỡ chất lƣợng của phản ứng xỏc định trỡnh tự phụ thuộc rất nhiều vào độ tinh sạch của mẫu DNA plasmid, do đú phải tiến hành tinh sạch plasmid tỏi tổ hợp. Hai trong số 3 dũng plasmid mang sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch lại bằng bộ sinh phẩm S.N.A.P Miniprep Kit (Invitrogen). Kết quả tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng điện di DNA trờn gel agarose 1% (hỡnh 3.5) và đo quang phổ kế ở bƣớc súng 260-280nm. Kết quả đo OD260-280 (khụng nờu ở đõy) và kết quả điện di kiểm tra trờn gel agarose cho thấy, plasmid tỏi tổ hợp cú độ tinh sạch cao, cú thể sử dụng cho mục đớch giải trỡnh tự gen.
Hỡnh 3.5: Kết quả kiểm tra tinh sạch DNA plasmid trờn gel agarose 1%. 1,2: 2 dũng plasmid tỏi tổ hợp số sau tinh sạch.
3.5. Kết quả xỏc đinh trỡnh tự
Bộ sinh phẩm BigDyeR Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit của Applied Biosystems đƣợc sử dụng để xỏc định trỡnh tự DNA. Qỳa trỡnh giải trỡnh tự đƣợc thực hiện trờn mỏy giải trỡnh tự tự động ABI3100 (Applied Biosystems). Quy trỡnh của phản ứng giải trỡnh tự đƣợc trỡnh bày trong phần phƣơng phỏp nghiờn cứu. Sau khi giải trỡnh, trỡnh tự gen mó húa protein M1 của virus H1N1 đƣợc phõn tớch bằng phần mềm PC – Gen (hỡnh 3.6).
ID M1-PCR PRELIMINARY; DNA; 775 BP.
SQ SEQUENCE 775 BP; 223 A; 174 C; 210 G; 168 T;
GGATCCGGTC ATGGGTCTTC TAACCGAGGT CGAAACGTAC GTTCTCTCTA TCATCCCGTC
AGGCCCCCTC AAAGCCGAGA TCGCGCAGAA ACTTGAAGAT GTCTTTGCAG GAAAGAACAC
CGATCTCGAG GCTCTCATGG AATGGCTAAA GACAAGACCA ATCCTGTCAC CTCTGACTAA
AGGGATTTTG GGATTTGTAT TCACGCTCAC CGTGCCCAGT GAGCGAGGAC TGCAGCGTAG (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ACGCTTTGTC CAGAACGCCC TAAATGGAAA TGGAGATCCA AATAATATGG ATAGGGCAGT
TAAGCTATAT AAGAAGCTGA AAAGAGAAAT AACATTCCAT GGGGCTAAGG AGGTCGCACT
CAGCTACTCA ACCGGTGCAC TTGCCAGTTG CATGGGTCTC ATATACAACA GGATGGGAAC
GGTGACTACG GAAGTGGCTT TTGGCCTAGT GTGTGCCACT TGTGAGCAGA TTGCAGATTC
ACAGCATCGG TCTCACAGAC AGATGGCAAC TATCACCAAC CCACTAATCA GACATGAGAA
CAGAATGGTG CTGGCCAGCA CTACAGCTAA GGCCATGGAG CAGATGGCGG GATCAAGTGA
GCAGGCAGCG GAAGCCATGG AGATTGCTAA TCAGGCTAGG CAGATGGTGC AGGCAATGAG
GACAATTGGG ACTCATCCTA ACTCTAGTGC TGGTCTGAGA GATAATCTTC TTGAAAATTT
GCAGGCCTAC CAGAAACGAA TGGGAGTGCA GATGCAGCGA TTCAAGTGAA AGCTT
Hỡnh 3.6: Trỡnh tự hộp gen M1cú thờm cỏc yếu tố cần thiết.
Ở hỡnh 3.6 thể hiện trỡnh tự hộp gen mó húa protein M1cú gắn cỏc trỡnh tự cần thiết (trỡnh tự kozak, mó khởi đầu – trỡnh tự in đậm) cho sự biều hiện của gen M1 trong tế bào cụn trựng đƣợc đƣa vào trong quỏ trỡnh thiết kế mồi và phản ứng PCR.
Phõn tớch tiếp bằng phần mềm tỡm kiếm BLAST và Fasta3 chỳng tụi khẳng định chắc chắn đoạn gen đƣợc tỏch dũng chớnh là gen M1 của virus cỳm A/H1N1. So sỏnh trỡnh tự đoạn gen M1 phõn lập từ virus cỳm ở Việt Nam với trỡnh tự đó cụng bố trong ngõn hàng dữ liệu gen quốc tế (phụ lục 1) cho thấy, trỡnh tự đoạn gen mó húa khỏng nguyờn M1 của virut cỳm phõn lập ở Việt Nam cú độ tƣơng đồng cao so với cỏc chủng lƣu hành trờn thế giới, đạt từ 99,5 -100%.
Kết quả này là hoàn toàn phự hợp, bởi vỡ protein M1 là protein đặc hiệu typ, chỳng cú tớnh bảo thủ cao đối với virus cỳm trong cựng một typ (vớ dụ typA).
Để kiểm tra khung đọc mở trƣớc khi thiết kế vào vector biểu hiện baculovirus, trỡnh tự nucleotid của gen M1 đƣợc dịch mó sang protein . Kết quả cho thấy gen M1
đƣợc dịch mó thụng suốt, khụng cú mó kết thỳc ở trong gen.
Thiết kế và biểu hiện thành cụng protein M1 ngoài mục tiờu phỏt triển vaccine VLP cỳm A/H1N1, protein tỏi tổ hợp cũn cú thể sử dụng cho nhiều mục đớch khỏc nhƣ tạo kit chẩn đoỏn. Vỡ vậy, cỏc thụng tin quan trọng của gen đó tỏch dũng cần đƣợc phõn tớch kỹ. Từ trỡnh tự amino acid suy diễn (hỡnh 3.7), sử dụng phần mềm dự đoỏn quyết định khỏng nguyờn để phõn tớch chỳng tụi thu đƣợc kết quả nhƣ ở trờn bảng 1.
ID M1_PROT PRELIMINARY;
SEQUENCE 252 AA; 27947 MW; 290537 CN;
MSLLTEVETY VLSIIPSGPL KAEIAQKLED VFAGKNTDLE ALMEWLKTRP ILSPLTKGIL
GFVFTLTVPS ERGLQRRRFV QNALNGNGDP NNMDRAVKLY KKLKREITFH GAKEVALSYS
TGALASCMGL IYNRMGTVTT EVAFGLVCAT CEQIADSQHR SHRQMATITN PLIRHENRMV
LASTTAKAME QMAGSSEQAA EAMEIANQAR QMVQAMRTIG THPNSSAGLR DNLLENLQAY
QKRMGVQMQR FK
Hỡnh 3.7: Trỡnh tự amino acid suy diễn của protein M1
Bảng 1: Bảy quyết định kháng nguyên dự đoán của protein M1 dịch mã từ gen đã đ-ợc khuếch đại và tạo dòng
N Start Position Sequence End Position
2 47 KTRPILSPLTKGILGFVFTLTV 68 3 95 RAVKLYK 101 4 111 GAKEVALSYSTGALASCMG 129 5 138 VTTEVAFGLVCATCEQ 153 6 177 NRMVLAS 183 7 233 LLENLQA 239
Kết quả ở bảng 1 cho thấy, protein M1 dịch mó từ gen đó đƣợc khuếch đại và tạo dũng cú 7 quyết định khỏng nguyờn (epitopes). Thụng tin này rất cần thiết cho việc thiết kế vector biểu hiện thu nhận protein tỏi tổ hợp. Đối với một số gen của virus, khụng phải lỳc nào cũng biểu hiện thành cụng toàn bộ gen để thu nhận protein tỏi tổ hợp. Việc thăm dũ chọn từng vựng epitope để thu nhận cỏc protein cú tớnh đặc hiệu và tớnh sinh miễn dịch cao là hết sức cần thiết.
3.6. Thiết kế vector biểu hiện baculovirus mang hộp gen M1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Đoạn DNA chứa hộp gen M1 đƣợc tỏch ra khỏi vector pCRM1 bằng BamH I và
Hind III, phõn tỏch trờn gel agarose 1% và thu nhận lại bằng kit thụi gel của Fermentas (Đức). Sản phẩm tinh sạch sau đú đƣợc gắn vào vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO tại 2 vị trớ enzym tƣơng ứng là BamH I và Hind III nhờ T4 DNA ligase tạo nờn vector tỏi tổ hợp pBluBacM1. Nhƣ vậy, hộp gen M1 đƣợc gắn vào vựng xen giữa gen lacZ và ORF 1629. Đõy là hai vị trớ sẽ xảy ra sự trao đổi chộo trỡnh tự tƣơng đồng giữa pBluBac4.5/V5-His-TOPO và DNA của baculovirus để tạo virus baculovirus tỏi tổ hợp. Qỳa trỡnh này đƣợc mụ phỏng ở hỡnh 3.8.
45
Hỡnh 3.8: Sơ đồ minh họa quỏ trỡnh thiết kế vector biểu hiện baculovirus mang gen M1
3.6.1. Thu nhận hộp gen M1 từ pCRM1 và chuẩn bị vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO TOPO
Vector pCRM1 và vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO đƣợc xử lý đồng thời bằng 2 enzym giới hạn BamH I và Hind III. Sản phẩm cắt đƣợc điện di phõn tỏch trờn gel agarose 1%. Cắt lấy phần gel mang hộp gen M1 và vector mở vũng, tinh sạch lại nhờ kit thụi gel của Fermentas (Đức) sau đú điện di kiểm tra trờn gel agarose 1%. Kết quả điện di cho thấy, hai đoạn DNA này đó đƣợc tinh sạch thành cụng, thể hiện bởi một băng DNA cú kớch thƣớc khoảng 775 bp (hộp gen M1) và một băng cú kớch thƣớc khoảng 5000 bp (vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO mở vũng) ở cỏc đƣờng chạy tƣơng ứng (hỡnh 3.9).
755bp 775bp
5000bp
Hỡnh 3.9: Kiểm tra gen M1 và vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO đó được xử lý bằng BamH I và Hind III sau tinh sạch trờn gel agarose 1%.
1: thang DNA chuẩn 1kb (fermentas) 2: gen M1
3: vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO.
3.6.2. Thiết kế vector biểu hiện pBluBac4.5/V5-His-TOPO mang hộp gen M1
Để tạo vector biểu hiện baculovirus mang hộp gen M1, chỳng tụi tiến hành ghộp nối đoạn gen M1 với vector pBluBac4.5/V5-His-TOPO mở vũng thu đƣợc ở trờn nhờ ezyme T4 DNA ligase. Phản ứng ghộp nối (ligation) đƣợc tiến hành ở 140C trong 16 giờ. Sản phẩm lai đƣợc biến nạp vào tế bào E.coli chủng DH5α theo phƣơng phỏp sốc nhiệt. Cỏc thể biến nạp sau đú đƣợc cấy trải trờn mụi trƣờng LB đặc cú bổ sung Ampicilin 100 àg/ml. Trờn mụi trƣờng này chỉ cú những dũng mang vector tỏi tổ hợp mới sinh trƣởng đƣợc do vậy những khuẩn lạc mọc đƣợc.
Chỳng tụi chọn ngẫu nhiờn 6 khuẩn lạc từ đĩa nuụi cấy để tỏch plasmid và kiểm