1. 4.1 Hemagglutinin (HA)
2.3.7. Biến nạp DNAplasmid vào tế bào E.coli
Cơ chế biến nạp bao gồm việc làm thay đổi cấu trỳc thành tế bào vi khuẩn để DNA plasmid dễ dàng chui vào tế bào thể nhận. Những tế bào cú khả năng tiếp nhận DNA- plasmid ngoại lai đƣợc gọi là tế bào khả biến. Quỏ trỡnh biến nạp DNA plasmid vào tế bào E.coli gồm 2 giai đoạn:
Tạo tế bào khả biến:
Tế bào E.coli đƣợc nuụi qua đờm trong 5ml mụi trƣờng LB lỏng.
Pha loóng huyền dịch tế bào đó nuụi cấy theo tỷ lệ 1:100 trong 5ml mụi trƣờng LB.
Nuụi lắc ở 37°C, 200v/phỳt. Sau 2 giờ tiến hành kiểm tra mật độ tế bào bằng phƣơng phỏp quang phổ kế ở bƣớc súng 600nm. Khi giỏ trị OD600 đạt từ 0,6 – 1 là đạt yờu cầu.
Chuyển 1ml dịch tế bào sang ống eppendorf vụ trựng.
Để trờn đỏ 10 phỳt. Sau đú ly tõm thu sinh khối ở 4°C, tốc độ 4.000v/phỳt, trong thời gian 10 phỳt; loại dịch nổi.
Rửa cặn tế bào bằng CaCl2 100mM (tỷ lệ 1:10) ở 4°C. Ly tõm 4.000v/phỳt, loại dịch nổi.
Rửa lại bằng CaCl2 100mM ( tỷ lệ 1:20) ở 4°C; ly tõm thu cặn.
Hũa cặn tế bào thành huyền dịch trong 100àl CaCl2 100mM, giữ trong đỏ ớt nhất 1 giờ trƣớc khi tiến hành biến nạp.
Biến nạp:
Bổ sung 3-4àl DNA plasmid vào ống tế bào khả biến.
Để trờn đỏ trong 30 phỳt.
Sốc nhiệt ở 42°C trong 1phỳt 30 giõy.
Chuyển ống tế bào vào trong đỏ xốp để 3 phỳt.
Bổ sung 250àl mụi trƣờng LB lỏng; nuụi lắc ở 37°C trong 1 giờ.
Cấy trải 100àl-150àl trờn mụi trƣờng thạch LBA (mụi trƣờng LB đặc cú bổ sung Amp(100àg/ml)).
Ủ đĩa đó cấy trong tủ ấm 37°C qua đờm.