Trung tâm hoạt động của AChE có các nhóm chức và cấu trúc không gian phù hợp với các hợp chất phospho hữu cơ nên rất dễ kết hợp với các chất này và mất hoạt tính rất nhanh.. Nắm được tín
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Trang 2ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1 GS.TS NGUYỄN QUỐC KHANG
Trang 31.1.3 Các biện pháp diệt ốc bươu vàng ở Việt Nam 6
Trang 41.3.2.1 Các chất độc hóa học dùng trong chiến tranh 23
3.1 Khảo sát hàm lượng AChE của một số đối tượng nghiên cứu 37 3.2 Kết quả khảo sát đặc điểm sinh học của ốc bươu vàng 39
3.2.2 Ảnh hưởng của các yếu tố môi trường tới các đặc điểm sinh thái của
ốc bươu vàng
40 3.2.2.1 Ảnh hưởng của bùn tới khả năng đẻ trứng của ốc bươu vàng 40 3.2.2.2 Ảnh hưởng của độ sâu lớp nước đến khả năng đẻ trứng và tỉ lệ chết
của ốc bươu vàng
41
Trang 53.2.3 Hàm lượng AChE của ốc bươu vàng qua các thời kỳ trong năm 43 3.2.4 Lựa chọn nguồn tách chiết và tinh sạch AChE 46
3.3 Tách chiết, nghiên cứu tính chất của AChE từ ốc bươu vàng 47
3.3.1 Tinh sạch AChE bằng sắc ký trao đổi ion 49
3.3.2 Kiểm tra độ sạch và xác định KLPT của AChE bằng phương pháp
điện di trên Gel SDS-PAGE
50 3.3.3 Quy trình tách chiết và tinh sạch AChE 51 3.3.4 Xác định khối lượng phân tử của AChE từ ốc bươu vàng 54 3.3.4.1 Xác định khối lượng phân tử của AChE bằng phương pháp HPLC 54 3.3.4.2 Xác định hoạt độ thuỷ phân acetylcholin của chế phẩm AChE từ ốc
Trang 63.5.3.2 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Secsaigon đến hoạt độ AChE 70
3.5.3.3 Ảnh hưởng của thuốc diệt ốc bươu vàng Dioto 250EC đến hoạt độ
AChE
72
3.5.3.4 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Topsin đến hoạt độ AChE 73
3.6.1 Các thông số động học đặc trưng VM, KM của AChE 74 3.6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng ức chế của flavonoid từ các cây thuốc
3.7.1 Nghiên cứu, ứng dụng AChE tinh sạch phát hiện một số loại thuốc
trừ sâu phospho hữu cơ
81
3.7.2 Nghiên cứu cố định AChE trên màng polymer đồng trùng hợp 86
Trang 7ĐỀ NGHỊ 88 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
89
Trang 8MỞ ĐẦU
Ốc bươu vàng là loài sinh vật được du nhập vào nước ta từ những năm
80 của thế kỷ trước và hiện nay đã sinh sôi trên diện rộng gây hại cho cây trồng, hoa màu; đặc biệt là cây lúa Ốc bươu vàng có nguồn gốc từ Trung và Nam Mỹ nhưng thích ứng rất nhanh với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm của Việt Nam Ốc bươu vàng có mặt ở khắp nơi: đồng ruộng, kênh mương, ao hồ,… Vì thức ăn chủ yếu là lá lúa nên ốc bươu vàng đã trở thành sinh vật phá hoại lúa nghiêm trọng Đến nay, diệt ốc bươu vàng triệt để là việc không thể dù hàng năm Nhà nước đã tốn nhiều tỷ đồng
Bên cạnh những tác hại, thì về một khía cạnh thực tiễn nào đó, ốc bươu vàng lại là động vật có lợi Ốc bươu vàng là nguồn thức ăn có hiệu quả kinh tế cao đối với chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ hải sản; đặc biệt là nuôi tôm, vì chúng có hàm lượng dinh dưỡng và can-xi rất cao
Về mặt hóa sinh học, ốc bươu vàng là nguồn nguyên liệu tự nhiên rất giàu Acetylcholinesterase (AChE) AChE là một enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong vận truyền tín hiệu của hệ thần kinh động vật Trung tâm hoạt động của AChE có các nhóm chức và cấu trúc không gian phù hợp với các hợp chất phospho hữu cơ nên rất dễ kết hợp với các chất này và mất hoạt tính rất nhanh Nắm được tính chất này, người ta đã sản xuất các chất ức chế AChE là phospho hữu cơ làm chất độc hóa học vô cùng nguy hiểm sử dụng trong chiến tranh như Tabun, Cyclosarin, Sarin, Soman, VX cũng như làm thuốc bảo vệ thực vật sử dụng trong sản xuất nông nghiệp
Sau khi sử dụng, chất độc hóa học sẽ tồn dư lại trong môi trường đất, nước, trong các sản phẩm nông nghiệp (thực phẩm, rau, củ, quả v.v…) Chúng là những chất vô cùng độc hại đối với môi trường sinh thái, ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, động vật và còn có thể là những tác
Trang 9nhân gây nhiều bệnh nguy hiểm, trong đó có bệnh ung thư Vì vậy, việc phân tích phát hiện nhanh các chất độc hóa học là rất cần thiết, đặc biệt ngày nay các chất độc này được người dân sử dụng tràn lan
Dựa trên tính chất của chất ức chế, chúng ta có thể nghiên cứu sử dụng enzyme AChE làm phương tiện phân tích, phát hiện nhanh các chất độc hóa học phospho hữu cơ Kế thừa các thành quả nghiên cứu về ốc bươu vàng của những nhà khoa học trên thế giới, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu tinh sạch, tính chất đặc trưng và ứng dụng của Acetylcholinesterase từ ốc bươu vàng”
Mục đích chính của đề tài là tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào trong
nước; nghiên cứu, khai thác, ứng dụng AChE làm phương tiện phát hiện nhanh một số loại thuốc trừ sâu phospho hữu cơ tồn dư trong lương thực, thực phẩm
Với mục đích nêu trên, đề tài của chúng tôi không những có ý nghĩa về khoa học và thực tiễn mà còn có ý nghĩa về mặt kinh tế, sử dụng hợp lý tài nguyên; đặc biệt là đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả bảo vệ môi trường sinh thái
Để đạt được mục tiêu nêu trên chúng tôi tiến hành thực hiện các nội dung chính sau:
1 Tìm hiểu các đặc điểm sinh học của ốc bươu vàng, đặc biệt là
enzyme AChE từ đối tượng này
2 Khảo sát các điều kiện sinh thái, môi trường sống ảnh hưởng đến
khả năng sinh AChE của ốc bươu vàng
3 Nghiên cứu tinh sạch và các tính chất đặc trưng của AChE từ ốc
bươu vàng
4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại chất độc hóa học tới hoạt độ
của AChE từ ốc bươu vàng
5 Nghiên cứu sử dụng AChE để xây dựng phương pháp phát hiện
nhanh một số loại thuốc trừ sâu phospho hữu cơ tồn dư trong lương thực, thực phẩm
Trang 10CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Ốc bươu vàng
Ốc bươu vàng có tên khoa học là Pomacea canaliculata thuộc họ
Pilidae, lớp chân bụng (Gastropoda), ngành thân mềm (Mollusca), có nguồn
gốc từ Trung và Nam Mỹ [15, 24]
Ốc trưởng thành có kích thước lớn, dạng mập tròn gồm đầu, thân và chân Đầu có hai đôi xúc tu (một đôi dài và một đôi ngắn), thân nằm trên chân, là một khối xoắn ẩn kín trong vỏ; chân rộng, hình đĩa, màu trắng kem nằm ở phía bụng, mặt lưng của chân có nắp vỏ che đậy, đầu và chân thường thò ra ngoài vỏ khi di chuyển Toàn bộ cơ thể ốc nằm trong lớp vỏ Con đực
có nắp miệng hơi nhô gợn sóng, con cái có nắp miệng bằng phẳng hơi lõm xuống Sau khi thụ tinh xong, ốc bươu vàng thường đẻ trứng vào chiều tối Khi đẻ, ốc leo lên giá thể cao trên mặt nước, trứng có màu hồng bám thành chùm trên giá thể và mỗi lần đẻ có khoảng 150 - 500 trứng (1 chùm); sau khoảng 12 - 15 ngày thì trứng nở và nở hết trong 2 - 7 ngày Tỉ lệ nở khoảng 70%, tỉ lệ sống sau 10 ngày tuổi khoảng 80% Tuổi thành thục sớm (khoảng
100 ngày sau khi nở), thời gian tái phát dục ngắn, khoảng 3 ngày Tuổi thọ 2 -
3 năm Trong quần đàn, tỉ lệ con đực/cái khoảng 1/4
Ốc bươu vàng là loài có tốc độ sinh sản rất nhanh, kích thước của buồng trứng phản ánh kích thước cơ thể của con cái Có nghĩa là nếu số lượng trứng nhiều, buồng trứng lớn thì kích thước của con cái lớn [54] Kích thước cơ thể ốc cũng phản ánh điều kiện môi trường sống như là: mật độ cá thể, nguồn thức ăn
Tốc độ sinh trưởng, phát triển của ốc bươu vàng nhanh hay chậm tuỳ thuộc vào từng loại thức ăn và môi trường sinh sống Điều kiện sinh thái, khí
Trang 11hậu, hệ thống kênh mương và lưu lượng nước của từng khu vực khác nhau cũng dẫn đến tỉ lệ con đực/cái có sự thay đổi Kết quả nghiên cứu này hoàn
toàn phù hợp với báo cáo kết quả nghiên cứu của Banpavichit [24]
Hình 1.1: Ốc bươu vàng
1.1.1 Tác hại và lợi ích của ốc bươu vàng
1.1.1.1 Tác hại của ốc bươu vàng
Trong tự nhiên, ốc bươu vàng có rất ít kẻ thù kiểm soát được chúng Hiện nay, ốc bươu vàng đang là loài sinh vật phá hại nguy hiểm và gây nên những tổn thất nặng nề cho người nông dân trồng lúa trên thế giới cũng như các nước ở châu Á [48, 166], trong đó có Việt Nam
Ốc bươu vàng cắn ngang cây lúa non hoặc chồi lúa từ ngay sau khi sạ cho đến lúc lúa được 21 ngày tuổi Ốc hoạt động chủ yếu vào ban đêm Dấu hiệu dễ nhận biết lúa bị ốc phá hại là những đoạn thân, lá lúa nổi trên mặt nước và những chỗ nước cạn có thể thấy rõ cây lúa bị cắn mất ngọn
Trang 12Hình 1.2: Trứng ốc có mặt khắp nơi
1.1.1.2 Lợi ích của ốc bươu vàng
Bên cạnh tác hại phá hoại mùa màng thì về một khía cạnh thực tiễn nào
đó, ốc bươu vàng không những có giá trị khoa học mà còn là một nguồn thức ăn
có giá trị kinh tế cho chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản [154] Nghêu, sò, ốc, hến nói chung và ốc bươu vàng nói riêng là loại thức ăn giàu đạm (37%), trong
đó có nhiều amino acide thiết yếu, khoáng chất nên thường xuyên được dùng làm thức ăn bổ sung cung cấp đạm, các chất khoáng cho gia cầm, gia súc
Bảng 1.1: Một số amino acide trong protein ốc bươu vàng [36]
Trang 13Để giải quyết phần nào nạn ốc bươu vàng phá hại lúa và hoa màu, các địa phương cần khuyến khích nông dân bắt ốc về chế biến thành thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm, bởi ốc và trứng ốc bươu vàng có hàm lượng dinh dưỡng và can-xi rất cao
1.1.2 Các biện pháp diệt ốc bươu vàng
Tháng 10 năm 2004, hội thảo Quốc tế mở rộng bàn về các biện pháp khống chế, quản lý và diệt ốc bươu vàng được tổ chức tại Đài Loan Hội thảo
đã đưa ra 20 phương pháp; trong đó có các phương pháp hoá học, vật lý, cơ học, sinh học và phương pháp tổng hợp Sau đây, chúng tôi xin giới thiệu khái quát một số phương pháp: Bẫy bắt và thu gom ốc, dùng muối khoáng để diệt
ốc bươu vàng, dùng chế phẩm thảo mộc để diệt ốc bươu vàng, dùng thuốc trừ sâu Ngoài các phương pháp trên, chúng ta còn thấy tại một số vùng đã có các cách diệt ốc bươu vàng khác nhau: Song chắn, nhiệt độ, sốc điện, thuỷ nông, thu nhặt bằng tay, cạnh tranh sinh học, nuôi gia cầm và thuỷ cầm, v.v
1.1.3 Các biện pháp diệt ốc bươu vàng ở Việt Nam
Để loại trừ ốc bươu vàng, người nông dân Việt Nam chủ yếu dùng các
biện pháp thủ công như bắt bằng tay, giăng lưới…(hầu như đã thành “nghề” của người nông dân) Ngoài các biện pháp nêu trên, chế phẩm sản xuất từ thảo mộc cũng được sử dụng để diệt ốc bươu vàng [156] Tại Việt Nam, hệ thực vật nhiệt đới vô cùng phong phú và đa dạng, trong đó gồm rất nhiều loài chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao Do đó, chúng ta có thể khai thác những loại cây có độc tính diệt trừ ốc bươu vàng như cây sở, cây chẩu và cây thàn mát dùng làm nguyên liệu đáp ứng cho việc sản xuất các chế phẩm diệt
ốc có hiệu lực cao, không gây độc hại tới môi trường với số lượng lớn
Trang 141.2 Acetylcholinesterase (AChE)
1.2.1 Giới thiệu chung về Acetylcholinesterase (AChE)
AChE được phát hiện trong nhiều cơ thể sinh vật từ bậc thấp tới bậc cao như nhuyễn thể, nghêu, sò, ốc, cá, ngan, vịt, thỏ, chuột, ngựa, bò…và ở người [97, 117, 118]
Trong cơ thể, AChE không chỉ có ở các mô thần kinh mà còn có ở trong hồng cầu và các mô khác: mô cơ, huyết thanh, …[21, 87, 148]
Trên thế giới, AChE được nghiên cứu từ rất sớm [95, 161] Ban đầu, enzyme này được tách chiết từ một số loài cá điện như cá đuối điện
Pomatoschistus microps [97], Torpedo marmorata [28, 116], cá chình điện Electrophorus electricus và có rất ít công trình nghiên cứu về AChE tách chiết từ
Hình 1.3: Cầu gai
Trang 15AChE bị ức chế khi nồng độ cơ chất vượt quá nồng độ sinh lý tế bào một vài milimol còn butyrylcholinesterase thì độ nhạy kém hơn
Ở Việt Nam, AChE bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1960 Trường Đại học Y khoa Hà Nội, Học viện Quân y 103 đã nghiên cứu enzyme này trong máu để chẩn đoán một số bệnh về gan và nhiễm độc thuốc trừ sâu Một số tác giả của Viện Bảo vệ Thực vật đã tiến hành nghiên cứu và ứng dụng AChE vào việc xây dựng phương pháp chẩn đoán nhanh dư lượng thuốc bảo vệ thực vật trong rau quả Tuy nhiên, việc nghiên cứu AChE ở nước ta còn gặp rất nhiều khó khăn do hạn chế về trang thiết bị máy móc, dụng cụ thí nghiệm cũng như cơ sở hạ tầng của các trung tâm nghiên cứu, vì vậy chưa có nhiều công trình mang tính hệ thống
1.2.1.1 Phân loại
Trong hệ thống phân loại, AChE được xếp vào nhóm các enzyme xúc tác phản ứng thủy phân ester carboxyl (EC 3.1.1 Carboxylic Ester Hydrolases) thuộc lớp các enzyme thủy phân Hydrolase AChE có ký hiệu phân loại là EC 3.1.1.7
Phản ứng đặc hiệu của AChE là thủy phân acetylcholine tạo thành choline
và acetate với tốc độ 25.000 phân tử acetylcholine trong 1 giây:
Acetylcholine + H2O = choline + acetate
Enzyme này có tên phân loại là acetylcholine acetylhydrolase và các
tên khác như: choline esterase I, cholinesterase, acetylthiocholinesterase, acetylcholine hydrolase
Trong nghiên cứu cholinesterase của các mô khác nhau, người ta phát hiện thấy còn một enzyme nữa, tuy thủy phân cơ chất khác acylcholine nhưng cũng cho sản phẩm là choline Để phân biệt, người ta gọi enzyme AChE thủy
Trang 16Acylcholine + H2O = choline + carboxylate
“Cholinesterase giả” thường được gọi là Butyrylcholinesterase với ký
hiệu EC 3.1.1.8 Ngoài tên phân loại là acylcholine acylhydrolase, enzyme này còn có các tên khác như: anticholineesterase, benzoylcholinesterase, non-specific cholinesterase, propionylcholinesterase
“Cholinesterase thật” có trong hồng cầu và mô não, thủy phân
acetylcholine và acetyl--metylcholine một cách dễ dàng nhưng không thủy
phân được benzoylcholine Trong khi đó, “Cholinesterase giả” tìm thấy trong
gan, ruột, tim và máu có hoạt tính rất thấp hoặc không có hoạt tính đối với acetyl--metylcholine nhưng thủy phân benzoylcholine và acetylcholine một cách rất dễ dàng
AChE - “Cholinesterase thật” và Butyrylcholinesterase - “Cholinesterase
giả” liên quan chặt chẽ đến độc tính của thuốc trừ sâu phospho hữu cơ
1.2.1.2 Cấu trúc trung tâm hoạt động của AChE
Qua các kết quả nghiên cứu AChE cho thấy: bản chất của AChE là một
phân tử protein thuần tuý có cấu trúc bậc 4, trên bề mặt có các trung tâm hoạt động đóng vai trò xúc tác [124, 132]
Trung tâm hoạt động của AChE
Qua kết quả nghiên cứu về cơ chế xúc tác của AChE đối với cơ chất, đã chứng minh rằng ở trung tâm hoạt động của AChE có nhóm anion đóng vai trò quan trọng trong tác dụng xúc tác của enzyme không chỉ thực hiện chức năng “cố định” cơ chất khi tương tác với “đầu” cation của cơ chất acetylcholine mà tương tác này còn làm biến đổi cấu trúc protein trong vùng trung tâm hoạt động theo hướng tạo điều kiện cho sự tạo thành các liên kết khác với phân tử cơ chất cần thiết cho hiệu ứng xúc tác
Trang 17Khi nghiên cứu, các nhà khoa học đã chứng minh được rằng nếu trong trung tâm hoạt động của AChE có một nhóm anion thì điện tích bằng -1 còn nếu có 2 nhóm thì điện tích bằng -2
Phần thứ hai trong trung tâm hoạt động của AChE là phần esterase Chức năng chủ yếu của phần này là thủy phân acetylcholine Phần esterase được cấu tạo không những bởi các amino acide mạch nhánh trong mạch polypeptide xếp gần nhau mà còn do sự bố trí gần xa của các nhóm tạo thành cấu trúc bậc 2 hoặc 3 Sở dĩ, hoạt tính của enzyme mất đi hoặc bị giảm có lẽ
do sự thay đổi cấu trúc bậc 2 hoặc 3 này
Trong trung tâm hoạt động này có mặt các gốc serin, histidin và tyrosin Sự sắp xếp chính xác của các gốc này thì chưa rõ, nhưng chi tiết là tyrosin và serin đặt rất xa nhau trong mạch polypeptide Bộ ba xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzyme là Glutamat ở vị trí 334 (Glu334), Histidin ở
vị trí 447 (His447) và Serin ở vị trí 203 (Ser203) Ba acide amin này liên kết với nhau bằng liên kết hydrogen Túi acyl là Phenylalanin ở vị trí 295 (Phe295) và Phenylalanin ở vị trí 297 (Phe297) Phần phụ choline là Tryptophan ở vị trí 86 (Trp86), Glutamat ở vị trí 202 (Glu202) và Tyrosin ở vị trí 337 (Tyr337) Phần trung tâm là Triptophan ở vị trí 286 (Trp286), Tyrosin ở vị trí 72 (Tyr72), Tyrosin ở vị trí 124 (Tyr124) và Aspactat ở vị trí 74 (Asp74), Tyrosin ở vị trí
341 và 449 (Tyr341, Tyr449) có thể làm ổn định một số cấu tử Sau đây là cấu tạo không gian ba chiều và công thức hoá học của một số nhóm tạo thành trung tâm hoạt động của enzyme
Trang 18Hình 1.4: Mô phỏng cấu trúc bậc 4 của AChE
Trong phần esterase, còn có nhóm phân tử của các gốc amino acide cho proton và nhóm nhận proton Các nhóm này có thể là hydroxyl của tyrosin và nhóm imidazol của histidin Phân tử cholinesterase có trục đối xứng nhất định,
nó có thể chuyển từ trạng thái này sang trạng thái khác khi phản ứng với cơ chất, chất hoạt hoá hay chất ức chế theo nguyên lý cảm biến trung tâm xúc tác [25]
Sự phù hợp không gian giữa các nhóm chức trong trung tâm hoạt động
của AChE với các nhóm của phân tử cơ chất acetylcholine (Acetylcholine là
cơ chất đặc hiệu của AChE) được thể hiện ở hình 1.5
O
Hình 1.5: Sự phù hợp không gian giữa các nhóm chức của
trung tâm hoạt động với các nhóm của phân tử cơ chất acetylcholine
(-)
H O - H
Trang 19Hình 1.6: Công thức hoá học của Acetylcholine
Cơ chế xúc tác của AChE
Trung tâm hoạt động của enzyme này chứa hai phần với những nhóm chức khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau trong quá trình xúc tác thủy phân acetylcholine:
* Phần anion tích điện âm: có nhóm COO- nơi mà N+ của cơ chất được gắn vào theo liên kết tĩnh điện
* Phần esterase có các gốc Ser, Tyr, His với chức năng xúc tác thủy phân là nơi hoạt động chính của AChE
Để chuẩn bị cho quá trình thủy phân: Phần N+
của cơ chất acetylcholine được gắn vào phần anion có COO-
tích điện Phần -CH2-O-C-O-CH3 của cơ chất được gắn vào phần esterase cùng phân tử nước để thực hiện xúc tác thủy phân
Trong quá trình phản ứng, proton được phân ly từ nhóm phenol của Tyr
sẽ kết hợp với oxy trong nhóm rượu của choline, nhờ đó sinh ra điện tích dương tại C của nhóm acetyl trong cơ chất Carbon này sẽ bị hút bởi oxy tích điện âm của nhóm rượu đã phân ly của Ser trong trung tâm hoạt động Liên kết giữa C và O bị đứt ra và acetyl được giải phóng sẽ phản ứng với Ser ở dạng trung gian tạm thời acetylserin Proton bắn ra từ Ser được hút tới oxy tích điện âm của nhóm phenol phân ly từ tyrosin, nhóm hydroxyl được hình thành cùng với sự phục hồi trạng thái ban đầu của tyrosin trong trung tâm hoạt động
Sự thủy phân được bắt đầu chính bằng sự phân ly của phân tử H2O: H+
Trang 20công liên kết ester được hình thành tạm thời của acetylserin Quá trình này giải phóng phân tử acide acetic H+
vốn liên kết tạm thời với nitơ của imidazol được giải phóng và gắn trở lại O-
của Ser Trạng thái ban đầu của tất cả ba gốc amino acide trong trung tâm hoạt động được phục hồi Choline và acide acetic được giải phóng ra khỏi trung tâm bởi khoảng cách giữa các gốc chức năng đó Sự thuỷ phân acetylcholine được diễn ra từ phản ứng liên hợp của tất cả các nhóm chức năng ở vị trí xúc tác trong trung tâm hoạt động Tiến trình phản ứng chịu ảnh hưởng bởi khoảng cách giữa các gốc amino acide chứa các nhóm chức năng đó
Các nghiên cứu cũng đã đưa ra kết luận: phản ứng diễn ra một cách bình thường nếu nhóm imidazol nằm cách nhóm COO-
của acetyl 0,5 nm và nếu gốc tyrosin nằm cách Ser 0,25 nm
Tính chất xúc tác của AChE
Trung tâm esterase có nhóm chức hydroxylnucleophil của Ser, nhóm này được hoạt hoá bởi imidazol của histidin nhờ một liên kết cầu hydro Vị trí anion mang một điện tích âm gây ra bởi nhóm carboxyl của acide aspartat nằm cạnh Ser
Trong cấu trúc của acetylcholine, nguyên tử N tích điện dương Nguyên
tử carbon thuộc nhóm carbonyl xích lại gần trung tâm esterase của AChE làm xuất hiện những điều kiện thuận lợi cho tác dụng nucleophil của nhóm hydroxyl thuộc gốc Ser vào nhóm carbonyl của acetylcholine, đồng thời nguyên tử N tích điện dương tương tác với gốc oxy mang điện âm của gốc glutamyl Hai tương tác đồng thời này co kéo liên kết ester C-O ở giữa phân
tử acetylcholine trong môi trường có nước dẫn tới phản ứng thủy phân acetylcholine thành choline và acide acetic
Trang 21HO C O
Actylcholinesterase
Hình 1.7: Mô hình trạng thái trung gian tương tác giữa chất dẫn truyền thần kinh acetylcholine với enzyme AChE làm lỏng lẻo liên kết C-O dẫn
đến thủy phân acetylcholine thành choline và acide acetic
1.2.2 Vai trò của AChE trong hoạt động thần kinh
AChE giữ vai trò quan trọng đặc biệt trong hoạt động thần kinh, đó là
“Thủy phân acetylcholine” Mặc dù, acetylcholine đã được các nhà khoa học tổng hợp từ năm 1867 nhưng đến năm 1914, Henry Hallett Dale mới phát hiện tác động của nó đối với tế bào màng tim và vai trò của nó trong hoạt động thần kinh [161]
Acetylcholine là vật liệu truyền tín hiệu thần kinh của hệ thần kinh ngoại biên và hệ thần kinh trung ương ở nhiều cơ thể trong đó có cơ thể người Acetylcholine được tổng hợp chủ yếu trong các nơron từ choline và acetyl-CoA do enzyme choline acetyltransferase xúc tác cho quá trình này
Trong khớp thần kinh, acetylcholine làm nhiệm vụ mang tín hiệu thần kinh giữa hai nơron, đó là nơron truyền và nơron nhận Tác dụng truyền dẫn của acetylcholine chỉ được phép phát huy hiệu lực trong một thời gian rất ngắn (khoảng 10-3
giây), vì vậy màng tế bào phải nhanh chóng hồi phục để tiếp nhận xung mới
Trang 22Hình 1.8: Khớp thần kinh - cấu trúc truyền xung thần kinh
Acetylcholine nằm trong các túi ở axon, chờ khi nhận được các xung thần kinh thì chuyển vào vùng đệm của khớp để truyền cho bộ phận nhận nằm ngay trên mặt của dendrite làm nhiệm vụ gửi những thông điệp chuyển mệnh lệnh hoạt động cho các cơ bắp Sau một thời gian ngắn (khoảng 10-3
giây), khi acetylcholine đã hoàn thành nhiệm vụ, enzyme AChE đã nằm sẵn trong vùng đệm của khớp chịu trách nhiệm làm mất tác dụng của acetylcholine và nhanh chóng tách chúng ra khỏi hệ thống thần kinh bằng cách phá vỡ để giải phóng choline và acetat [124] Đấy là nhiệm vụ quan trọng của AChE Nếu AChE bị
ức chế, thì chúng không phá vỡ được vật liệu truyền tín hiệu thần kinh acetylcholine Nếu acetylcholine này không bị phá vỡ thì chúng liên tục truyền tín hiệu làm cho các cơ bắp không thể nghỉ, co thắt liên tục dẫn đến liệt
và các vấn đề sinh lý bất lợi khác Ngược lại, nếu AChE có hoạt tính quá
Trang 23mạnh thì luôn luôn phá vỡ các acetylcholine trước khi hoàn thành nhiệm vụ
Do đó, các tín hiệu thần kinh không kịp truyền đi từ axon làm cho dendrit não
bộ không nhận được tín hiệu, não bộ không ghi nhận được gì, do đó gây nên
“Bệnh lãng quên” Alzheimer hay “Mất trí nhớ” [103, 127, 133, 139]
1.2.3 Cơ chế ức chế AChE
Khi phospho hữu cơ tiến gần tới trung tâm hoạt động của enzyme AChE thì liên kết P-R3 của chúng mang điện tích dương sẽ có xu hướng nhanh chóng tiến tới oxy của gốc Ser dư điện tích âm của phần ester hình thành tương tác P -
O Trong khi đó thì gốc RL có xu hướng nhanh chóng tiến tới phần ion âm của trung tâm hoạt động của enzyme tạo nên trạng thái trung gian Sự co kéo trong trạng thái trung gian hoạt động làm lỏng lẻo liên kết P- RL dẫn đến phá vỡ liên kết này và hình thành liên kết vững chắc giữa phospho hữu cơ và oxy của nhóm Ser (P-O) đồng thời giải phóng gốc RL-O- Như vậy, phospho hữu cơ hoàn toàn che lấp phần ester của trung tâm hoạt động của AChE dẫn đến enzyme mất hoạt tính [45, 144]
P
OR2
R3
O O
Trang 24-O Serin
O Serin
H+
RL O
-Hình 1.11: -Hình thành liên kết vững chắc giữa phospho và oxy
của nhóm P-O làm mất hoạt tính AChE
Bẻ gãy liên kết
kích thước và điện tích
hoặc H2O
Trang 25Sau khi hình thành liên kết vững chắc P-O làm trung tâm hoạt động của AChE mất hoạt tính, thủy phân liên kết P-O có thể làm enzyme có hoạt tính trở lại Trong 2 khả năng thủy phân thì khả năng thủy phân liên kết P-O sẽ cắt được phần che lấp ester làm trung tâm hoạt động của AChE có hoạt tính trở lại
Acetylcholinesterase
P
OR2
R3O
O Serin
R2O
RL OH
Hình 1.12: Thủy phân liên kết P-O cắt phần che lấp ester làm tái lập
trung tâm hoạt động của AChE, có hoạt tính trở lại
Acetylcholinesterase
P
O Serin
O
RLOH
R2OH
Hình 1.13: Thủy phân liên kết R 2 O-P tạo thành R L OH và R 2 OH
không cắt phần che lấp ester trong trung tâm hoạt động của AChE,
Nếu H 2 O cộng vào đây thì
có hiện tượng thuỷ phân
Nếu H 2 O cộng vào đây thì có hiện tượng lão hóa
Liên kết rất bền, không thể thuỷ phân được
Trang 26Khi nghiên cứu một số chất như antidote, 2-PAM, atropine…cho thấy chúng có thể tương tác với trung tâm hoạt động của AChE đã bị ức chế để cắt phần che lấp ester, trả lại hoạt tính cho enzyme Những chất này chính là chất giải độc phospho hữu cơ
2-PAM là một trong các oxime có tác dụng tách liên kết giữa chất ức
chế và AChE [84, 145], 2-PAM và atropine có hiệu ứng đồng lực Các kết quả nghiên cứu cho thấy độc tính của phospho hữu cơ mất đi nhanh chóng khi
sử dụng atropine và 2-PAM, hiệu ứng đồng lực này có tác dụng gấp 35 lần khi sử dụng atropine riêng lẻ [18]
Acetylcholinesterase
P
OSerin
O
N
CH
N OH
CH32-PAM
Hình 1.14: 2-PAM tiến gần đến AChE bị ức chế bởi chất độc hóa
học thần kinh phospho hữu cơ hóa trị 5
Trang 27Hình 1.15: 2-PAM tương tác với AChE đang bị ức chế bởi chất độc
hóa học thần kinh phospho hữu cơ hóa trị 5
Hình 1.16: AChE được giải phóng khỏi chất ức chế là
chất độc hóa học thần kinh phospho hữu cơ hóa trị 5
Hình thành liên kết
Phá bỏ liên kết
Trang 281.2.4 Nghiên cứu khả năng sử dụng AChE để phát hiện thuốc trừ sâu
Ngộ độc thực phẩm đang là vấn đề thời sự nóng bỏng, là mối quan tâm của mọi người, mọi nhà nhất là khi các vụ ngộ độc thực phẩm đang có chiều hướng gia tăng như hiện nay Một trong những nguyên nhân chính gây nên là
do hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) (12-17%)
Hiện nay ở nước ta đã và đang sử dụng phổ biến 4 loại hóa chất bảo vệ thực vật họ phospho hữu cơ là:
* Thiophos (Parathion) màu vàng, mùi tỏi, dạng nhũ tương
* Vofatoc (methyl parathion) màu nâu thẫm, dạng nhũ tương hoặc màu
đỏ tươi, dạng bột có mùi cỏ thối
* Dipterec dạng tinh thể, màu trắng
* DDVP (dichloro diphenyl vinyl phosphat) màu vàng nhạt
Ngoài ra vẫn có một số ít trường hợp sử dụng loại thuốc nguy hiểm (đã
bị cấm sử dụng) như nhóm thuốc khai hoang (Paraquat)
AChE bị ức chế bởi phospho hữu cơ, vì vậy việc xác định hoạt độ của AChE khi có mặt và không có mặt của phospho hữu cơ được ứng dụng làm
cơ sở phát hiện HCBVTV họ phospho hữu cơ trong lương thực, thực phẩm
Hiện nay, một vài nước trên thế giới đã sản xuất được một số loại phương tiện phát hiện nhanh lương thực, thực phẩm nhiễm HCBVTV, tuy nhiên giá thành khá cao và với điều kiện kinh tế ở nước ta như hiện nay thì khó có thể đưa vào sử dụng cho đại bộ phận người dân
1.2.5 Ứng dụng của AChE
Với cơ chất đặc biệt là acetylcholine, AChE được ứng dụng trong các lĩnh vực liên quan tới hoạt động thần kinh như sau:
Trang 29* Dựa vào tính chất ức chế AChE, các nhà khoa học đã tổng hợp được nhiều loại chất ức chế là những chất độc hóa học có tác động tới hệ thần kinh
sử dụng trong chiến tranh hoặc dùng làm thuốc trừ sâu BVTV
* Cũng dựa vào tính chất ức chế AChE, những nhà khoa học đã tìm ra nhiều loại chất ức chế từ tự nhiên được dùng làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm chữa bệnh thần kinh Alzheimer
* Ứng dụng quan trọng của AChE là dùng để sản xuất ra các phương tiện phát hiện nhanh thuốc trừ sâu bảo vệ thực vật họ phospho hữu cơ trong môi trường, nông sản, rau quả
1.3 Chất ức chế AChE
Chất ức chế acetylcholinesterase (AChEI) hoặc là anti-cholinesterase là chất kìm hãm enzyme cholinesterase trong quá trình thủy phân acetylcholine, đồng thời tăng mức độ hoạt động cũng như thời gian tác động của chất truyền thần kinh acetylcholine [46, 59, 61, 87, 93, 159], điển hình là Diisopropylphospho-fluoridate
Về bản chất, chất ức chế acetylcholinesterase có thể là các chất hóa học tổng hợp hoặc các hợp chất thiên nhiên được chiết tách từ những nguồn sinh vật khác nhau
Theo cơ chế hoạt động, các chất ức chế AChE được chia làm 2 loại: ức chế thuận nghịch và ức chế không thuận nghịch Chất ức chế không thuận nghịch AChE còn có thể là ức chế không cạnh tranh [19, 102, 113]
1.3.1 Chất ức chế AChE từ thiên nhiên
Những chất ức chế từ thiên nhiên có nhiều khả năng là các alkaloid và flavonoid Ví dụ, gần đây, các nhà khoa học Brazil đã chiết tách được hàng
Trang 30trăm hợp chất ức chế AChE từ thiên nhiên Trong đó, có 139 hợp chất thuộc các nhóm alkaloid và 14 hợp chất thuộc các nhóm flavonoid [20, 26]
Những chất ức chế từ thiên nhiên thường được chú ý đặc biệt hơn vì chúng chính là nguồn dược liệu quý dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh “lãng quên” Alzheimer [27]
1.3.2 Các chất ức chế tổng hợp hóa học
Các chất phospho hữu cơ có cấu trúc không gian phù hợp với cấu trúc trung tâm hoạt động của AChE Đây là một trong các điều kiện để chúng kết hợp rất mạnh với enzyme làm mất hoạt tính của enzyme Dựa vào tính chất này, các nhà khoa học đã nghiên cứu, sản xuất ra nhiều chất phospho hữu cơ dùng làm chất độc thần kinh sử dụng trong chiến tranh, làm thuốc trừ sâu BVTV Sau này, trên cơ sở từ những chất ức chế phospho hữu cơ, các nhà khoa học đã nghiên cứu, sản xuất được nhiều loại thuốc chữa bệnh “lãng quên” Alzheimer
1.3.2.1 Các chất độc hóa học dùng trong chiến tranh
Ứng dụng đầu tiên của các chất phospho hữu cơ là sử dụng trong chiến tranh [42, 50] Năm 1936, phospho hữu cơ lần đầu được Dr Gerhard Schrader tổng hợp với mục đích làm chất diệt côn trùng là ethyl-N-dimethyl-phosphoroamidocyanate, sau gọi là “Tabun” Năm 1939, Tabun được sử dụng trên cánh đồng Munster Lager để diệt côn trùng, BVTV và từ năm 1942 trở đi được sản xuất nhiều hơn với quy mô công nghiệp Chất độc thần kinh Sarin được phát hiện muộn hơn, sau đó là Soman được phát hiện vào năm 1944 Sarin được sản xuất nhiều vào năm 1945 Sau này, các nhà khoa học đã phát hiện thêm nhiều chất độc thần kinh với các tên gọi khác nhau như Tabun C5H11N2O2P (GA), Cyclosarin C7H14FO2P (GF), Sarin C4H10FO2P (GB), Soman C7H16FO2P (GD),
VX C11H26NO2PS [157, 37, 122] Ester của acide monofluorophosphoric được phát hiện vào năm 1932 cùng với ester Diisopropyl fluorophosphate, tuy chúng
Trang 31không độc như các chất độc thần kinh nêu trên nhưng chúng được trộn với mù tạc làm hơi cay dùng trong lĩnh vực quân sự (như GA, GB, GD, GF)
Chất độc thần kinh được Đức sử dụng đầu tiên (trong Chiến tranh Thế giới lần thứ II), sau đó là các nước đồng minh chống Đức
Các chất độc hóa học vô cùng nguy hiểm, có độc tính rất cao, ảnh hưởng lâu dài tới sức khoẻ con người và được coi là một loại “vũ khí hóa học” sát thương hàng loạt [41, 42, 120, 130]
Sarin - C4H10FO2P Cyclosarin - C7H14FO2P
Soman - C7H16FO2P Tabun - C5H11N2O2P
VX - C11H26NO2PS Diisopropylfluorophosphate - C6H14FO3P
Hình 1.17: Cấu trúc một số chất độc hóa học phospho hữu cơ
1.3.2.2 Thuốc bảo vệ thực vật
Trang 32Trong sản xuất nông nghiệp, việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật (BVTV)
để bảo vệ mùa màng, cây trồng và vật nuôi là rất cần thiết Tới nay, người ta đã biết có hơn mười ngàn loài (10.000) trong số hơn 1 triệu loài côn trùng là tác nhân gây hại cho cây trồng và vật nuôi, truyền bệnh cho con người và phá hoại môi trường sống xung quanh gây tổn thất lên đến hàng chục tỉ đô la mỗi năm; chúng làm giảm năng suất, phẩm chất nông sản Hơn 700 loài côn trùng là đối tượng gây ảnh hưởng nặng nề nhất đối với nền nông nghiệp thế giới [40]
Thuốc BVTV là một loại thuốc trừ dịch hại được sử dụng để diệt côn trùng ở tất cả các giai đoạn biến thái, kể cả giai đoạn biến thái trứng và ấu trùng; được sử dụng rộng rãi nhất trong nông nghiệp tiếp đó là hộ gia đình, thậm chí cả trong y khoa Sử dụng thuốc BVTV là một nhân tố làm gia tăng sản phẩm nông nghiệp trong thế kỷ 20 Việc làm đó có nguy cơ gây biến đổi
hệ sinh thái môi trường và tích lũy trong chuỗi thức ăn
Song song với các lợi ích bảo vệ mùa màng, khống chế được một số loài gây hại, nâng cao năng suất cây trồng, HCBVTV luôn gây ra nhiều lo ngại về khía cạnh môi trường và sức khỏe Các chất độc hại này trong hoặc sau khi sử dụng có thể thâm nhập vào chuỗi thức ăn, môi trường nước, đất
Do khả năng tồn lưu rất bền nên những chất độc hại này tích lũy trong môi trường, nhiễm vào sản phẩm nông nghiệp, đặc biệt là tích lũy trong cơ thể con người, sinh vật Vì vậy, việc xác định lượng tồn lưu của chúng trong nông sản, thực phẩm và môi trường sinh thái để có biện pháp xử lý là hết sức cần thiết nhằm bảo vệ sức khoẻ người dân và hệ sinh vật
Thuốc bảo vệ thực vật có thể được phân loại theo độ độc (LD50), bản chất hóa học cũng như tính năng tác dụng Theo bản chất hóa học, có thể chia hóa chất bảo vệ thực vật thành các nhóm như sau:
* Nhóm 1: Chlorine hữu cơ
* Nhóm 2: Phospho hữu cơ
Trang 33 Nhóm 2: Phospho hữu cơ
Trong các nhóm nêu trên, loại thuốc BVTV Organophosphate (thuộc nhóm 2: Phospho hữu cơ) đã được nghiên cứu từ những năm 30 - 40 của thế
kỷ 20 và bắt đầu được dùng làm thuốc trừ sâu vào cuối chiến tranh Thế giới thứ II
Thuốc bảo vệ thực vật phospho hữu cơ có độc tính đối với hệ thần kinh
và độc tính cao hơn loại thuốc bảo vệ thực vật chlorine hữu cơ, do đó lượng tồn lưu của chúng sẽ gây ảnh hưởng tới môi trường nhưng chúng lại có ưu điểm phân hủy nhanh và sản phẩm phân hủy của các chất này không độc Vì vậy, ngày nay, thuốc bảo vệ thực vật có bản chất phospho hữu cơ được sử dụng rộng rãi hơn loại có bản chất chlorine hữu cơ
Giống như các chất độc hoá học, nhóm phospho hữu cơ cũng là những chất hữu cơ có cấu trúc không gian phù hợp với cấu trúc trung tâm hoạt động của AChE Vì vậy, nhóm này có tác động rất mạnh tới hệ thần kinh của côn trùng gây hại Các loại thuốc BVTV này tác dụng với AChE của hệ thần kinh côn trùng giống như acetylcholine tạo thành phosphoryl hoặc cacbaryl và tích
tụ trong tế bào thần kinh Do đó acetylcholine không được phân huỷ đủ nhanh, gây kích thích ngộ độc tế bào thần kinh làm chết côn trùng [40]
Nhóm thuốc phospho hữu cơ tác động theo cơ chế ức chế không thuận nghịch, tức là khi chúng tác động có hại tới trung tâm hoạt động của AChE thì
Trang 34phospho hữu cơ không những có tác dụng diệt côn trùng gây hại mà còn diệt
cả các loài khác
Dipterex (Dylox) - Trichlorfon Ofatox - fenitrothion C9H12NO5PS
Vofatox - Methyl parathion Malathion
Hình 1.18: Một số thuốc bảo vệ thực vật nhóm phospho hữu cơ
Nhóm 3: Carbamate
Carbamate là các ester của acide N-methyl cacbarmic (CH3NHCOOH), hoặc trong một số trường hợp là acide N,N-dimethyl cacbarmic Tính chất độc của các thuốc bảo vệ thực vật carbamate phụ thuộc vào nhóm thế ở vị trí nhóm
OH- Một số carbamate có phổ trừ sâu phổ rộng Thuốc BVTV carbamate được
sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp, làm vườn và thường dùng ở dạng bột mịn Các loại thuốc bảo vệ thực vật carbamate không được xếp vào loại các hóa chất bền vững vì trong môi trường chúng rất dễ bị thủy phân và phân hủy [29]
Nhóm thuốc bảo vệ thực vật carbamate cũng có tác động tới trung tâm hoạt động của AChE tương tự như các chất nhóm Organophosphate nhưng yếu hơn Chúng tác động theo cơ chế ức chế thuận nghịch, tức là sau khi tác động, cấu trúc của trung tâm có thể phục hồi được, enzyme lại có hoạt tính gần như
Trang 35ban đầu [60] Cũng như thuốc bảo vệ thực vật phospho hữu cơ, thuốc bảo vệ thực vật carbamate cũng có độc tính đối với hệ thần kinh và độc tính cao hơn loại thuốc bảo vệ thực vật chlorine hữu cơ nhưng chúng lại có ưu điểm phân hủy nhanh nên hiện nay thuốc này vẫn được sử dụng rộng rãi hơn thuốc bảo vệ thực vật chlorine hữu cơ
Hiện nay, ngoài những loại thuốc bảo vệ thực vật đã có truyền thống sử dụng, Công ty Vật tư Bảo vệ Thực vật I Trung ương (PSC-I) đã đưa ra thị trường rất nhiều chủng loại thuốc trừ sâu, bảo vệ thực vật Trước đây, người nông dân chỉ sử dụng các loại thuốc có một thành phần hoạt chất Sau này, để nâng cao hiệu quả, người dân đã sử dụng các loại thuốc có hai thành phần hoạt chất (để có phổ tác động mạnh hơn) Một số loại thuốc bảo vệ thực vật hiện đang sử dụng ở nước ta và các thành phần hoạt chất của chúng được trình bày ở bảng 1.2
Bảng 1.2: Một số loại thuốc bảo vệ thực vật đang được sử dụng ở nước ta
và hoạt chất của chúng
2 DDVP Dimethyl Dichloro - Vinyl Phosphate
4
2
Difentox 20EC
Bitox 40EC, 50EC Etofenprox (Pyrethroid), Dimethoate
2 Cadusafos Cadusafos C10H23O2PS2
2 Ethoprophos Ethoprophos C8H19O2PS2
4 Cypermethrin Synthetic pyrethroid
2
Trang 362 Dichlovos Dichlovos
1 Dioto 250EC Nichlosamide (Niclocide)
4 Deltamethrin Pyrethroid insecticide
2 Dipterex, Dylox Trichlorfon
2 Dip 80SP, Chlorofos Trichlorfon
2 Monocrotophos Monocrotophos
2 New Hinosan 30EC Edifenphos
2 Ofatox 400EC, 400WP Fenitrothion và Trichlorfon
3 Padan 0,1%, Cartap hydrochloride (Thiocarbamate)
3 Patox 95SP, 4G Cartap
2 Profenofos Profenofos
3 Ricide 72WP Metalaxyl, Mancozed (carbamate)
4 Secsaigon 5EC-10EC-25EC Cypermethrin (pyrethroid.)
3 Subatox 75EC Fenitrothion, Fenobucarb (carbamate)
2 Thiophot Parathion, ethyl- parathion hoặc diethyl-
3 Topsin (R) M70%WP Thioallophanate (carbamate)
4 Trebon 10EC Ethofenprox (Pyrethroid)
2 Vofatox Methyl parathion
Trong các loại thuốc trừ sâu, bảo vệ thực vật ở bảng 1.2 có nhiều loại thuộc nhóm phospho hữu cơ và một số thuộc nhóm carbamate
Trang 37CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là: AChE trong ốc bươu vàng Chi tiết về ốc bươu vàng đã được trình bày ở chương I: Tổng quan tài liệu
2.2 Phương pháp
2.2.1 Định lượng protein
Protein được nghiên cứu và định lượng theo phương pháp Lowry Dựa vào phản ứng màu của protein và thuốc thử Fonlin-ciocalter, cường độ màu của dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ protein và dựa vào đường chuẩn protein
để tính hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu [7]
b) Loại bỏ tạp chất (sơ bộ làm sạch enzyme)
Trong dịch chiết thô thu được, ngoài protein enzyme còn có các protein tạp, các chất cao phân tử khác như polysaccharide, acide nucleic và các chất phân tử nhỏ như đường monose, các chất lipid, muối khoáng v.v Để loại bỏ
Trang 38c) Tách enzyme bằng dung môi hữu cơ
Như đã trình bày ở trên, trong dung dịch enzyme có thể có hai loại lực tương tác là tương tác enzyme - enzyme và tương tác enzyme - dung môi Ngoài ra, có thể còn có tương tác giữa dung môi - dung môi Cũng tương tự như phương pháp muối tách, trong dung dịch enzyme có chứa các dung môi hữu cơ, chẳng hạn như cồn thì với hàm lượng cồn lớn dần lên sẽ làm cho lớp
áo nước của phân tử enzyme giảm dần, tức là tương tác dung môi - dung môi tăng lên và tương tác giữa các phân tử enzyme - enzyme với nhau tăng lên làm cho các phân tử enzyme có khuynh hướng co cụm, kết tủa lại với nhau
2.2.3 Tinh sạch enzyme
* Nhồi gel DEAE vào cột: gel đã trương nở trong đệm sẽ được nhồi từ từ
vào cột cho đến khi đạt thể tích 10 ml gel, chú ý không để mặt gel khô và phải nhồi sao cho mặt gel bằng phẳng, các lớp gel phải đồng đều, không tạo bọt
* Cân bằng cột: đưa môi trường xung quanh gel về môi trường đệm Thể tích đệm phosphate sử dụng cân bằng cột gấp khoảng 5 - 10 lần thể tích cột (100 ml) Tốc độ chảy 40 - 60 ml/h
* Gắn mẫu lên cột: Cho dịch chiết lên cột (35 ml) Lên cột 3 lần với tốc độ là 97 ml/h
* Rửa cột: Chỉ khoảng 5 ml gel phía trên có gắn protein, do đó rửa cột
có tác dụng loại các protein không gắn hoặc gắn không đặc hiệu Rửa cột với tốc độ 40 - 50 ml/h, đến khi OD 280 < 0,05 thì dừng lại Mỗi phân đoạn rửa là
4 ml (thu được 8 phân đoạn)
* Đẩy và thu các phân đoạn: Tiến hành đẩy cột bằng cách sử dụng gradient muối NaCl có nồng độ 1M trong đệm phosphate Thể tích ở mỗi
phân đoạn là 3 ml (4’5’’/phân đoạn) Thu được 38 phân đoạn
Trang 392.2.4 Kiểm tra độ sạch của AChE bằng điện di biến tính trên gel Polyacrylamide (SDS - PAGE)
Điện di trên gel là phương pháp tốt nhất để phân tách một hỗn hợp protein và đánh giá độ sạch của protein
Trang 40* Tẩy gel bằng dịch tẩy có thành phần: methanol 40%, acide acetic 7%
2.2.5 Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme AChE
a) Xác định hoạt độ AChE theo phương pháp so màu [51]
AChE xúc tác phản ứng thủy phân acetylthiocholine tạo thành thiocholine và acetate Cho thiocholine phản ứng với 5, 5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acide (DTNB) tạo thành 5-thio-2-nitro benzoic acide và 2-nitrobenzoate-5-mercaptothiocholine Sản phẩm 2-nitrobenzoate-5-mercaptothiocholine có màu vàng, hấp thụ cực đại ở bước sóng = 412 nm Phản ứng tiến hành ở 25°C trong cuvette ổn nhiệt
Acetylthiocholine + H2O Thiocholine + Acetate
Thiocholine + DTNB → 5-thio-2-nitro benzoic acide
+ 2-nitrobenzoate-5-mercaptothiocholine
(không màu) (màu vàng = 410 nm)
Có thể dùng Butyrylthiocholine làm cơ chất thay cho Acetylthiocholine
Butyrylthiocholine + H2O Thiocholine + Butyrat AChE
AChE