b) Xỏc định hoạt tớnh AChE theo phƣơng phỏp đo quang phổ huỳnh quang.
3.7.Xõy dựng phƣơng phỏp phỏt hiện HCBVTV trờn cơ sở sử dụng AChE 1 Nghiờn cứu, ứng dụng AChE tinh sạch phỏt hiện một số loại thuốc
3.7.1. Nghiờn cứu, ứng dụng AChE tinh sạch phỏt hiện một số loại thuốc trừ sõu phospho hữu cơ.
Phương phỏp phỏt hiện hoỏ chất bảo vệ thực vật dựa trờn nguyờn lý: AChE xỳc tỏc phản ứng thuỷ phõn acetylcholine thành acide acetic và choline. Lượng acide acetic tạo thành sau phản ứng sẽ làm chuyển màu chỉ thị. Khi hợp chất phospho hữu cơ và carbamate ức chế AChE, phản ứng phõn huỷ acetylcholine bị kỡm hóm, acide acetic khụng sinh ra, màu chất chỉ thị khụng đổi. Hoặc: AChE xỳc tỏc phản ứng thủy phõn acetylthiocholine tạo thành thiocholine và acetate, cho thiocholine phản ứng với 5, 5'-dithio-bis-2- nitrobenzoic acide (DTNB) tạo thành 5-thio-2-nitro benzoic acide và 2- nitrobenzoate-5-mercaptothiocholine. Sản phẩm 2-nitrobenzoate-5- mercaptothiocholine cú màu vàng hấp thụ cực đại ở bước súng = 412 nm. Acetylthiocholine + H2O Thiocholine + Acetate. Thiocholine + DTNB → 5-thio-2-nitro benzoic acide
+ 2-nitrobenzoate-5- mercaptothiocholine
(khụng màu) (màu vàng)
Chỳng tụi tiến hành thử nghiệm sử dụng AChE đó tinh sạch để phỏt hiện một số loại thuốc trừ sõu phospho hữu cơ như sau: Lấy 7 ống nghiệm sạch, đỏnh số thứ tự từ 1 đến 7. Ống nghiệm thứ nhất khụng cho dịch enzyme, từ ống nghiệm thứ 2 đến ống nghiệm thứ 7 cho vào lượng dịch enzyme bằng nhau, tiếp theo cho thuốc trừ sõu vào từng ống với nồng độ tăng dần, ủ 2 phỳt, cho cơ chất vào, để ở nhiệt độ phũng. Sau 5 phỳt dừng phản ứng, cho vào mỗi
ống lượng chỉ thị màu như nhau. So màu bằng mắt thường. Ảnh 3.1 cho thấy cường độ màu của cỏc ống thay đổi theo nồng độ chất độc tăng dần. Điều này cú nghĩa là khi nồng độ chất độc tăng dần thỡ khả năng ức chế enzyme AChE cũng tăng dần, nờn khụng cú phản ứng enzyme AChE thuỷ phõn acetylthiocholine tạo thành thiocholine kết hợp với DTNB, tạo phức khụng màu. Đõy là cơ sở để nhận biết nồng độ cỏc chất độc tăng lờn trong mẫu cần xỏc định.
Ảnh 3.1: Khả năng phỏt hiện thuốc trừ sõu của AChE ốc bươu vàng khi nồng độ thuốc tăng dần
Chỳng tụi đó thử nghiệm trờn một số mẫu khỏc: nước cỏc sụng, hồ ở Hà Nội (Kim Ngưu, Tụ Lịch, Hoàn Kiếm, Bảy Mẫu, Hồ Tõy) và cỏc mẫu rau. Kết quả như sau:
Ảnh 3.2: Khả năng phỏt hiện thuốc trừ sõu trong cỏc mẫu nước sụng, hồ của AChE ốc bươu vàng
Thời điểm lấy mẫu nước ở cỏc sụng, hồ là thỏng 10 trong năm. Lỳc này đang là mựa khụ, nước trong cỏc hồ cạn nhiều do đú nồng độ cỏc chất trong nước tăng lờn. Trờn ảnh 3.2, chỳng ta thấy ống số 2 (ống đối chứng) cú màu giống cỏc mẫu nước lấy làm thớ nghiệm, ở ống đối chứng mẫu nước làm thớ nghiệm được thay bằng nước cất. Nếu màu của cỏc ống thớ nghiệm giống màu ống đối chứng thỡ cú nghĩa là AChE khụng bị ức chế bởi ion kim loại nặng và phospho hữu cơ. Do vậy, phản ứng thủy phõn acetylcholine vẫn diễn ra bỡnh thường, sản phẩm phản ứng bắt màu với DTNB, dễ nhận biết bằng mắt thường. Từ kết quả thớ nghiệm trờn, chỳng tụi đưa ra một số nhận xột như sau:
1. Đối chứng 2. Hoàn Kiếm 3. Kim Ngưu 4. Tụ Lịch 5. Bảy Mẫu 6. Hồ Tõy
* Nước trong cỏc sụng, hồ ở Hà Nội mà chỳng tụi nghiờn cứu chỉ cú thể bị ụ nhiễm hữu cơ, khụng bị ụ nhiễm chất độc phospho hữu cơ.
* Mẫu nước tại cỏc sụng, hồ ở Hà Nội được lấy làm thớ nghiệm khụng bị ụ nhiễm kim loại nặng.
Ảnh 3.3: Khả năng phỏt màu của AChE ốc bươu vàng khimẫu thớ nghiệm cú P2O5
P2O5 là một oxit mạnh, cú khả năng gõy độc cao, thường được dựng để sản xuất thuốc trừ sõu phospho hữu cơ và một vài loại chất độc quõn sự phospho hữu cơ. Chỳng tụi đó tiến hành thớ nghiệm trờn 3 mẫu với nồng độ lần lượt là 0,002 mg/l; 0,003 mg/l và 0,005 mg/l. Ở cả 3 mẫu thớ nghiệm đều thấy AChE bị ức chế rất mạnh, thể hiện qua độ màu của 3 mẫu thớ nghiệm so với mẫu đối chứng. Qua kết quả đú, chỳng ta thấy rằng độ nhạy của phản ứng cú thể phỏt hiện được chất độc cú nồng độ từ 0,002 mg/l trở lờn.
1. 0,002 mg/l 2. 0,003 mg/l 3. 0,005 mg/l
Ảnh 3.4: Kiểm tra, phỏt hiện rau nhiễm thuốc BVTV bằng giấy đó tẩm AChE ốc bươu vàng
Chỳng tụi tiến hành thớ nghiệm kiểm tra chất lượng rau bằng giấy đó tẩm AChE như sau: Rau sạch, được chỳng tụi trồng để đối chứng, được chăm súc bằng nước mỏy thụng thụng thường, khụng sử dụng cỏc loại phõn bún. Rau ở chợ, được mua ngẫu nhiờn ngoài chợ, bằng cỏch chọn cỏc loại rau cú lỏ xanh mỡ màng, khụng bị sõu. Theo kinh nghiệm của những người nội trợ thỡ những loại rau đú là rất dễ nhiễm thuốc trừ sõu, vỡ trước khi thu hoạch khoảng 2 ữ 3 ngày được người dõn phun thuốc kớch thớch bảo vệ rau.
Chỳng tụi tiến hành thớ nghiệm như sau: nhỏ nước cất (khụng độc) và dung dịch cú chứa 0,003 mg/l chất độc phospho hữu cơ lờn giấy đó tẩm AChE từ ốc bươu vàng. Kết quả cho thấy: khi giấy tẩm AChE được nhỏ nước cất thỡ phản ứng màu vẫn diễn ra bỡnh thường; cũn giấy tẩm AChE được nhỏ dung dịch cú độc với nồng độ 0,003 mg/l thỡ phản ứng thuỷ phõn acetylcholine khụng xảy ra vỡ AChE bị ức chế bởi chất độc phospho hữu cơ, do đú khụng cú phản ứng màu.