b) Xỏc định hoạt tớnh AChE theo phƣơng phỏp đo quang phổ huỳnh quang.
3.3.4.1. Xỏc định khối lƣợng phõn tử của AChE bằng phƣơng phỏp HPLC.
Sắc ký chế phẩm AChE được tiến hành trờn mỏy HPLC với cột sắc ký 60x10 mm (5 m) chứa Superdex - 75 được cõn bằng bởi dung dịch đệm citrate pH = 6,2). Sau sắc ký thu được sắc ký đồ của chế phẩm AChE (Hỡnh 3.7).
S75 E Sy 50mg 5 9 06001:1_UV S75 E Sy 50mg 5 9 06001:1_Flow 100 150 200 250 300 350 mAU 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 ml
Hỡnh 3.7: Sắc ký trờn mỏy HPLC của chế phẩm AChE
Trờn sắc ký đồ thu được 3 đỉnh protein tương ứng với 31,38; 40,08 và 44,38 ml rỳt ra.
Kớch thước phõn tử của chế phẩm AChE được xỏc định dựa vào cỏc protein chuẩn: Serum albumin (66,2 kDa), Carbonic anhydrase (30 kDa) và Lysozyme (14,4 kDa).
Trờn cơ sở protein chuẩn, chỳng tụi đó xỏc định khối lượng phõn tử của cỏc thành phần trong chế phẩm AChE. Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.9.
Bảng 3.9: Khối lượng phõn tử của cỏc protein chuẩn và chế phẩm AChE
STT Protein chuẩn Thể tớch rỳt (ml) KLPT (kDa)
1 Serum albumin 28,7 66,2 2 Carbonic anhydrase 34,2 30 4 Lysozyme 39,6 14,4 5 Chế phẩm AChE 31,38 42 40,08 13 44,38 7
Dựa vào đồ thị chuẩn để xỏc định khối lượng phõn tử của cỏc thành phần trong chế phẩm AChE cho thấy: 3 đỉnh cú khối lượng phõn tử lần lượt là 42 kDa, 13 kDa và 7 kDa. Kết quả xỏc định khối lượng phõn tử của cỏc thành phần trong chế phẩm AChE cho thấy: enzyme AChE cú 3 tiểu phần với khối lượng phõn tử lần lượt là 42 kDa, 13 kDa và 7 kDa nhưng tiểu phần cú khối lượng phõn tử 7 kDa cú thể là mảnh vỡ protein của 2 tiểu phần trờn.