Như đó trỡnh bày ở trờn, trong dung dịch enzyme cú thể cú hai loại lực tương tỏc là tương tỏc enzyme - enzyme và tương tỏc enzyme - dung mụi. Ngoài ra, cú thể cũn cú tương tỏc giữa dung mụi - dung mụi. Cũng tương tự như phương phỏp muối tỏch, trong dung dịch enzyme cú chứa cỏc dung mụi hữu cơ, chẳng hạn như cồn thỡ với hàm lượng cồn lớn dần lờn sẽ làm cho lớp ỏo nước của phõn tử enzyme giảm dần, tức là tương tỏc dung mụi - dung mụi tăng lờn và tương tỏc giữa cỏc phõn tử enzyme - enzyme với nhau tăng lờn làm cho cỏc phõn tử enzyme cú khuynh hướng co cụm, kết tủa lại với nhau.
2.2.3. Tinh sạch enzyme.
* Nhồi gel DEAE vào cột: gel đó trương nở trong đệm sẽ được nhồi từ từ vào cột cho đến khi đạt thể tớch 10 ml gel, chỳ ý khụng để mặt gel khụ và phải nhồi sao cho mặt gel bằng phẳng, cỏc lớp gel phải đồng đều, khụng tạo bọt.
* Cõn bằng cột: đưa mụi trường xung quanh gel về mụi trường đệm. Thể tớch đệm phosphate sử dụng cõn bằng cột gấp khoảng 5 - 10 lần thể tớch cột (100 ml). Tốc độ chảy 40 - 60 ml/h.
* Gắn mẫu lờn cột: Cho dịch chiết lờn cột (35 ml). Lờn cột 3 lần với tốc độ là 97 ml/h.
* Rửa cột: Chỉ khoảng 5 ml gel phớa trờn cú gắn protein, do đú rửa cột cú tỏc dụng loại cỏc protein khụng gắn hoặc gắn khụng đặc hiệu. Rửa cột với tốc độ 40 - 50 ml/h, đến khi OD 280 < 0,05 thỡ dừng lại. Mỗi phõn đoạn rửa là 4 ml (thu được 8 phõn đoạn).
* Đẩy và thu cỏc phõn đoạn: Tiến hành đẩy cột bằng cỏch sử dụng gradient muối NaCl cú nồng độ 1M trong đệm phosphate. Thể tớch ở mỗi phõn đoạn là 3 ml (4’5’’/phõn đoạn). Thu được 38 phõn đoạn.
2.2.4. Kiểm tra độ sạch của AChE bằng điện di biến tớnh trờn gel Polyacrylamide (SDS - PAGE). Polyacrylamide (SDS - PAGE).
Điện di trờn gel là phương phỏp tốt nhất để phõn tỏch một hỗn hợp protein và đỏnh giỏ độ sạch của protein.
a) Húa chất
* Polyacrylamide 30%.
* Tris-HCl pH = 8,8 và pH = 6,8 cú SDS. * APS 10%.
* TEMED.
* Đệm chạy điện di protein cú SDS. * CBB 0,5%.
* Dung dịch tẩy protein.
b) Tiến hành
Đổ gel SDS - PAGE 12,5% gồm 2 lớp: gel tỏch và gel cụ với cỏc thành phần như sau: Bảng 2.1: Thành phần gel SDS - PAGE STT Gel tỏch Gel cụ Dịch gel gốc 4,7 ml 0,22 ml Đệm gel tỏch x 4 pH = 8,8 1,25 ml Đệm gel cụ x 4 pH = 6,8 0,05 ml 0,42ml SDS 10% 0,05 ml 0,17 àl H2O 1,8 ml 1 ml
c) Tra mẫu
* Chuẩn bị mẫu: Cho vào mỗi ống epp 30 μl mẫu và 10 μl đệm mẫu 4x. Lờn mẫu là 20 μl (trừ Marker là 5 àl).
* Sau khi tra mẫu vào giếng, tiến hành chạy điện di trong thời gian 70 phỳt. * Nhuộm bản gel bằng CBB 0,5%.
* Tẩy gel bằng dịch tẩy cú thành phần: methanol 40%, acide acetic 7%.
2.2.5. Cỏc phƣơng phỏp xỏc định hoạt độ enzyme AChE. a) Xỏc định hoạt độ AChE theo phƣơng phỏp so màu [51]. a) Xỏc định hoạt độ AChE theo phƣơng phỏp so màu [51].
AChE xỳc tỏc phản ứng thủy phõn acetylthiocholine tạo thành thiocholine và acetate. Cho thiocholine phản ứng với 5, 5'-dithio-bis-2- nitrobenzoic acide (DTNB) tạo thành 5-thio-2-nitro benzoic acide và 2- nitrobenzoate-5-mercaptothiocholine. Sản phẩm 2-nitrobenzoate-5- mercaptothiocholine cú màu vàng, hấp thụ cực đại ở bước súng = 412 nm. Phản ứng tiến hành ở 25°C trong cuvette ổn nhiệt.
Acetylthiocholine + H2O Thiocholine + Acetate. Thiocholine + DTNB → 5-thio-2-nitro benzoic acide
+ 2-nitrobenzoate-5-mercaptothiocholine
(khụng màu) (màu vàng = 410 nm)
Cú thể dựng Butyrylthiocholine làm cơ chất thay cho Acetylthiocholine
Butyrylthiocholine + H2O Thiocholine + ButyratAChE AChE
* Cỏch tớnh hoạt độ AChE:
Để tớnh hoạt độ AChE dựa vào cụng thức sau: U/g = [a x OD/30S]/m.
Trong đú:
a: Số đó được chuẩn hoỏ trờn mỏy Photometer 4010.
OD/30S: Độ hấp thụ quang tại = 470 nm trong 30 giõy. m: Trọng lượng mẫu làm thớ nghiệm.
* Dụng cụ, hoỏ chất, nguyờn liệu:
+ Dụng cụ: Thiết bị phõn tớch bao gồm mỏy Photometer và thiết bị ổn nhiệt.
+ Bộ kớt cú mó số (code number) là 1442368 của hóng Boehringer Mannheim (Roche Diagnostics).
+ Nguyờn liệu: AChE từ dịch chiết ốc bươu vàng.