nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của protein thủy phân từ sinh khối artemia

Protein thủy phân có giá trị sinh học chứa các peptide, acid amin có hoạt tính chống oxy hóa được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như thực phẩm, thực phẩm chức năng, thực phẩm thuốc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TS HUỲNH NGUYỄN DUY BẢO

NHA TRANG - NĂM 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan toàn bộ nội dung thực hiện của luận văn này là kết quả nghiên cứa của bản thân, không sao chép kết quả nghiên cứu của người khác Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn nếu có bất kì sự gian dối nào

Người cam đoan

Nguyễn Hồng Ngân

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành Luận văn này tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ tận tình của các quý thầy cô và đồng nghiệp Xin chân thành cảm ơn:

Ban Giám hiệu, các phòng ban chức năng, quý thầy cô giáo đã giảng dạy, giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập tại Trường

Quý thầy cô Trung tâm thí nghiệm Thực hành đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện Luận văn

Đồng nghiệp đã tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi trong thời gian học tập Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và TS.Nguyễn Anh Tuấn đã hướng dẫn khoa học hết sức tận tình và chu đáo trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành báo cáo Luận văn

Kính chúc các thầy cô, đồng nghiệp sức khỏe, thành công và hạnh phúc

Khánh Hòa, ngày 23 tháng 9 năm 2012

Học viên thực hiện

Nguyễn Hồng Ngân

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BẢNG viii

DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 3

1.1 Artemia 3

1.1.1.Phân loại 3

1.1.2.Vòng đời và đặc điểm sinh học của Artemia 3

1.1.3.Thành phần hóa học của Artemia 4

1.1.4 Tình hình nuôi và sử dụng Artemia trên thế giới 5

1.1.5 Tình hình nuôi và sử dụng Artemia ở Việt Nam 6

1.2 Gốc tự do và chất chống oxy hóa 7

1.2.1 Gốc tự do 7

1.2.2 Chất chống oxy hóa 8

1.3 Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được áp dụng phổ biến 9

1.3.1 In vitro 9

1.3.1.In vivo 12

1.4 Protein thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa 13

1.4.1 Khái quát về protein thủy phân 13

1.4.2 Một số nghiên cứu về protein thủy phân trong nước và thế giới 14

1.4.3 Thành phần chống oxy hóa của protein thủy phân 18

1.4.4 Ứng dụng của sản phẩm protein thủy phân 20

1.5 Thủy phân protein 21

1.5.1 Khái quát về quá trình thủy phân protein [13] 21

1.5.2.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein 22

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất 26

2.1.1 Nguyên vật liệu 26

2 1.1.1 Artemia 26

2.1.1.2 Enzyme protease 26

2.1.2 Hóa chất 27

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 27

2.2.2 Bố trí thí nghiệm thu và xử lý mẫu 28

2.2.3 Xác định thành phần hóa học của Artemia 29

2.2.4 Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại 30

2.2.5 Chọn loại enzyme protease thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 31

2.2.6 Xác định các điều kiện thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 32

2.2.3 Xác định thành phần có hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân 38

2.3 Phương pháp phân tích 39

2.2.3 Các máy móc thiết bị sử dụng 39

2.2.4 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu 39

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Thành phần hóa học của Artemia 40

3.2 Hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại 43

3.3 Chọn loại enzyme bổ sung thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 46

3.4 Xác định các điều kiện thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 49

3.4.1 Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 49 3.4.1 Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để dịch protein Artemia thủy phân

có hoạt tính chống oxy hóa cao 51

3.4.2 Xác định pH thích hợp để dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính

chống oxy hóa cao 53

3.4.3.Xác định thời gian thủy phân thích hợp để dịch thủy phân Artemia có hoạt tính chống oxy hóa cao .55

3.4 Xác định thành phần có hoạt tính chống oxy hóa trong dịch protein Artemia thủy phân 58

3.4.1 Khối lượng phân tử của protein 58

3.4.2 Thành phần có hoạt tính chống oxy hóa trong dịch protein Artemia thủy phân 58

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 61

1 KẾT LUẬN 61

2 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Vòng đời phát triển của Artemia 3

Hình 1.2 Phản ứng trung hòa gốc tự do DPPH 10

Hình 1.3 Cơ chế phản ứng tạo màu của nitrite bằng thuốc thử Greiss 11

Hình 1.4 Phản ứng tạo acid uric 11

Hình 1 5 Phản ứng tạo phức màu giữa MDA và acid thiobarbituric 12

Hình 1.6 Hỗn hợp protein thủy phân 14

Hình 1.7 Qúa trình hấp thu các acid amin và peptide qua thành ruột 20

Hình 1.8 Qúa trình thủy phân protein và các peptide bằng endoprotease và exopeptidase 22

Hình 1.9 Qúa trình thủy phân để hình thành các peptide có hoạt tính sinh học 23

Hình 2.1 Hình ảnh sinh khối Artemia franciscana 26

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 27

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu và xử lý mẫu 28

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học của Artemia 29

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại 30

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn loại enzyme protease thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 31

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 33

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 34

Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 35

Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao 36

Hình 2.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần có hoạt tính chống oxy hóa trong dịch protein Artemia thủy phân 38

Hình 3.1 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại 44

Hình 3.2 Tổng năng lực khử của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại45 Hình 3.3 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch protein Artemia thủy phân bằng các enzyme bổ sung khác nhau 47 Hình 3.4 Tổng năng lực khử của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme bổ sung khác nhau 48 Hình 3.5 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme Protamex ở các tỷ lệ enzyme/cơ chất khác nhau 49 Hình 3.6 Tổng năng lực khử của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme

Protamex ở các tỷ lệ enzyme/cơ chất khác nhau 50 Hình 3.7 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme Protamex ở các nhiệt độ thủy phân khác nhau 51 Hình 3.8 Tổng năng lực khử của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme

Protamex ở các nhiệt độ thủy phân khác nhau 52 Hình 3.9 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch protein protein Artemia thủy phân bằng enzyme Protamex ở các pH khác nhau 54 Hình 3.10 Tổng năng lực khử của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme

Protamex ở các pH khác nhau 55 Hình 3.11 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme Protamex ở các khoảng thời gian thủy phân khác nhau 56 Hình 3.12 Tổng năng lực khử của dịch thủy phân protein Artemia bằng enzyme

Protamex ở các khoảng thời gian thủy phân khác nhau 57 Hình 3.13 Khối lượng phân tử của protein trong dịch protein Artemia thủy phân 58

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của Artemia franciscana[8] 4

Bảng 1.2 Thành phần acid amin của Artemia franciscana [8] 4

Bảng 2.1 Điều kiện hoạt động thích hợp và điều kiện xử lý để vô hoạt các enzyme 26

Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng trong phân tích 27

Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của sinh khối Artemia 40

Bảng 3.2 Thành phần acid amin của sinh khối Artemia 40

Bảng 3.3 Thành phần acid béo của sinh khối Artemia 41

Bảng 3.4 Thành phần có hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân 59

DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT

Kí hiệu viết tắt Diễn giải

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây ngành chế biến thủy sản đạt được nhiều thành tựu đáng ghi nhận Bên cạnh những giá trị mang lại từ các sản phẩm chủ lực của ngành như sản phẩm đông lạnh, sản phẩm khô… thì việc nghiên cứu phát triển sản phẩm mới

để sử dụng hiệu quả hơn các nguồn nguyên liệu sẵn có là yêu cầu cấp thiết đặt ra đối với ngành thủy sản trong điều kiện nguồn nguyên liệu thủy sản khai thác tự nhiên ngày càng suy giảm

Không phải là đối tượng thủy sản có giá trị xuất khẩu cao, Artemia hiện đang là đối tượng được diêm dân nhiều tỉnh miền Trung và miền Tây nam bộ nuôi và coi là

con “xóa đói giảm nghèo”

Artemia là tên của một loài giáp xác nhỏ sống ở những vùng nước mặn có biên

độ mặn rộng từ vài phần nghìn đến 250‰ Với chu trình sinh trưởng ngắn, sau 10 - 15

ngày chúng có thể đạt giai đoạn trưởng thành và tham gia sinh sản Artemia có thể

sinh sản lần đầu sau 8 ngày phát triển Mỗi lần đẻ khoảng 300 trứng hoặc con, với chu

kỳ đẻ 4 ngày /lần vì vậy lượng sinh khối Artemia thu được rất lớn Hiện tại, các nghiên cứu chế biến Artemia còn rất hạn chế đặc biệt là chế biến Artemia thành thực phẩm cho người chưa được quan tâm Artemia chủ yếu được sử dụng dưới dạng sinh khối tươi dùng làm thức ăn nuôi thủy sản Phần sinh khối dư thừa hiện chưa được sử dụng một cách hiệu quả; do vậy việc nghiên cứu chế biến Artemia thành các sản phẩm thực phẩm là cần thiết nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng loại nguyên liệu thủy sản giàu protein này

Hiện nay, có nhiều nghiên cứu tách chiết các chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các chất có hoạt tính chống oxy hóa từ protein của sinh vật biển Protein thủy phân có giá trị sinh học chứa các peptide, acid amin có hoạt tính chống oxy hóa được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như thực phẩm, thực phẩm chức năng, thực phẩm thuốc và

mỹ phẩm Ngoài ra, protein thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa được coi là chất chống oxy hóa tự nhiên nên đáp ứng tốt cho xu thế tiêu dùng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên

Từ các phân tích trên cho thấy “Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của protein

thủy phân từ sinh khối Artemia ” là cần thiết, là một hướng đi mới nhằm khai thác các

chất chống oxy hóa tự nhiên từ sinh vật biển và góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng sinh khối Artemia

Mục tiêu của đề tài

Thăm dò khả năng chống oxy hóa của protein thủy phân từ Artemia để làm cơ sở cho việc nghiên cứu ứng dụng vào sản xuất chế phẩm có hoạt tính chống oxy hóa từ Artemia

Nội dung nghiên cứu:

1 Xác định thành phần hóa học của Artemia

2 Xác định loại enzyme và điều kiện thủy phân thích hợp để thu được sản phẩm protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa

3 Xác định thành phần có hoạt tính chống oxy hóa trong sản phẩm protein Artemia thủy phân

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN 1.1 Artemia

franciscana, Artemia perrsimilis, Artemia monica, Artemia urmiana

1.1.2 Vòng đời và đặc điểm sinh học của Artemia

Để hoàn thành vòng đời của mình, Artemia trải qua nhiều giai đoạn phát triển khác nhau như giai đoạn trứng bào xác, giai đoạn bung dù, giai đoạn ấu trùng, giai đoạn lột xác và giai đoạn trưởng thành Artemia tiền trưởng thành và trưởng thành được gọi là sinh khối Vòng đời của Artemia được thể hiện ở Hình 1.1

Hình 1.1 Vòng đời phát triển của Artemia

Artemia có thể sống ở những vùng nước mặn có biên độ mặn rộng từ vài phần nghìn đến 250‰ Artemia ăn lọc không có tính chọn lựa, thức ăn chủ yếu là các hạt lơ lửng trong nước và các sinh vật kích thước nhỏ như tảo và vi khuẩn Với chu trình sinh trưởng ngắn, sau 10 - 15 ngày chúng có thể đạt giai đoạn trưởng thành và tham gia sinh sản Tùy theo điều kiện môi trường, Artemia có sự sinh trưởng và sinh sản khác nhau, có dòng đơn tính, dòng lưỡng tính, đẻ con hay đẻ trứng Khi nồng độ muối trong

môi trường sống cao hơn 70‰, dinh dưỡng kém và nhiệt độ cao thì Artemia có xu hướng đẻ trứng bào xác [9] Artemia có thể sinh sản lần đầu sau 8 ngày phát triển,

thường là sau 12 - 15 ngày Mỗi lần đẻ khoảng 300 trứng hoặc con, với chu kỳ đẻ 4 ngày/lần Trong điều kiện tốt Artemia sống được khoảng 6 tháng [1, 10]

1.1.3 Thành phần hóa học của Artemia

Thành phần hóa học cơ bản của Artemia được thể hiện ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của Artemia franciscana[8]

Bảng 1.2 Thành phần acid amin của Artemia franciscana [8]

* Aicd amin không thay thế

Protein Artemia rất giàu acid amin không thay thế, đặc biệt là giàu tyrosine và

lysine; hàm lượng tyrosine chiếm 27% và hàm lượng lysine chiếm 12% tổng hàm lượng acid amin Tyrosine là acid amin giúp trẻ tỉnh táo và tiếp nhận thông tin nhanh; lysine là acid amin kích thích tiêu hóa tạo cảm giác ngon miệng, gia tăng chuyển hóa,

giúp hấp thu tối đa dinh dưỡng và phát triển chiều cao

Artemia rất giàu các acid béo không no; hàm lượng các acid béo không no chiếm 68,4% tổng hàm lượng acid béo Trong đó, hàm lượng các acid béo không no có từ 2 nối đôi trở lên chiếm 45,9% và hàm lượng các acid béo không no có từ 4-6 nối đôi chiếm 9,2% tổng hàm lượng acid béo không no [8] Các acid béo không no như eicosapentaenoic aicd (EPA) và docosahexaenoic acid (DHA) là các acid béo thiết yếu đối với cơ thể EPA có tác dụng làm giảm triglyceride và cholesterol, giảm độ nhớt của máu, chống tăng huyết áp, phòng ngừa bệnh tim mạch và chống viêm DHA đóng vai trò quan trọng trong sự hoàn thiện chức năng nhìn của mắt và sự phát triển của hệ thần kinh; bên cạnh đó DHA còn có tác dụng giảm cholesterol toàn phần, giảm triglyceride trong máu và phòng ngừa xơ vữa động mạch

Vì vậy, nghiên cứu sử dụng Artemia làm nguyên liệu chế biến thực phẩm giàu dinh dưỡng phục vụ cho con người là hướng đi đầy triển vọng góp phần đẩy mạnh phát triển thực phẩm thủy sản và nâng cao hiệu quả cho nghề nuôi Artemia.

1.1.4 Tình hình nuôi và sử dụng Artemia trên thế giới

Artemia được biết đến vào những năm 30 của thế kỷ XX khi người ta phát hiện ra chúng là loại thức ăn sống có giá trị dinh dưỡng cao cho việc ương nuôi giống các loài

thủy sản như tôm, cá cảnh, động vật thân mềm Artemia có thể đáp ứng rất tốt cho nhu cầu dinh dưỡng trong giai đoạn ấu trùng của các loài tôm, cá

Các quần thể Artemia được tìm thấy rải rác khắp các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới Chúng phân bố dọc ven biển hay cả những hồ nước mặn trong nội địa Artemia có nhiều ở vịnh San Francisco và hồ Mono ở Mỹ, vịnh Bohai ở Trung Quốc

Mỹ và ương nuôi trên ruộng muối nên sản lượng Artemia hàng năm đều tăng cao Một

số khu vực của Đông Nam Á có diện tích sản xuất muối lớn nhưng không có Artemia

phân bố tự nhiên như Thái Lan, Philippine và Việt Nam thì việc chủ động di giống và

thuần hóa loài Artemia thích hợp cho việc nuôi trên ruộng muối sẽ làm tăng thêm

nguồn thu nhập, đáp ứng nhu cầu về trứng và sinh khối Artemia phục vụ cho nghề nuôi thủy sản

Hiện nay, sản phẩm Artemia thương mại thường là dạng trứng đóng hộp, phần sinh khối Artemia chủ yếu được sử dụng ở dạng tươi hoặc chế biến thành thức ăn dạng bột để ương nuôi các loài thủy sản [10]

1.1.5 Tình hình nuôi và sử dụng Artemia ở Việt Nam

Artemia không phân bố tự nhiên ở Việt Nam, năm 1982 nó được du nhập vào

Việt Nam dưới dạng thức ăn dùng cho ấu trùng tôm càng xanh Sau đó, Artemia bắt

đầu được thả nuôi thử nghiệm ở Khánh Hòa (1982), Bạc Liêu (1984), Sóc Trăng (1984), Bình Thuận (1991) và Vũng Tàu (1995) Mặc dù được thả nuôi thử nghiệm ở nhiều vùng nhưng Artemia được nuôi khá thành công ở vùng ven biển Sóc Trăng, Bạc Liêu nhờ vào kỹ thuật nuôi Artemia của Viện Khoa học Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ Đến năm 1990 đối tượng này được triển khai sản xuất đại trà cho các hộ diêm dân ở Sóc Trăng và Bạc Liêu Sóc Trăng và Bạc Liêu trở thành hai vùng nuôi trọng điểm cung cấp trứng bào xác có chất lượng cao cho thị trường [10] Ngoài ra, Artemia còn được nuôi ở một số địa phương khác như Khánh Hòa, Bình Thuận…

Artemia có nhiều loài, Artemia được nuôi rộng rãi ở Việt Nam là loài Artemia

franciscana Với hàm lượng đạm trên 50%, chất béo trên 10% và hàm lượng acid

béo acid béo không no bậc cao biến động trong khoảng 0,3 - 15mg/100g trọng lượng khô [36] Sinh khối Artemia ngày càng trở thành nguồn thức ăn được lựa chọn để thay thế cho nhiều loại thức ăn sống trong nuôi trồng thủy sản như monia, trùng chỉ, giun đỏ [10]

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về sử dụng sinh khối Artemia tươi sống

và chế biến thức ăn viên từ Artemia sấy khô làm thức ăn cho các đối tượng tôm sú, tôm càng, cá kèo, cua biển tại khoa nuôi trồng Đại học Cần Thơ [10] Tuy nhiên, mục đích chính của nuôi Artemia hiện nay là thu trứng bào xác làm thức ăn cho ấu trùng tôm, cá cảnh; còn lại một lượng lớn sinh khối Artemia chưa được sử dụng một cách có hiệu quả [9] Đã có một số nghiên cứu tận dụng nguồn sinh khối Artemia sản xuất thức ăn dạng bột dùng cho nuôi thủy sản [10]; các nghiên cứu sử dụng Artemia làm thực phẩm dùng cho con người chưa được quan tâm

Vì vậy, nghiên cứu phát triển thực phẩm cho người đặc biệt là thực phẩm chứa các hoạt chất sinh học từ sinh khối Artemia mở ra một hướng đi mới góp phần thúc đẩy nghề nuôi Artemia, nâng cao thu nhập cho diêm dân và đa dạng nguồn thực phẩm cho con người

1.2 Gốc tự do và chất chống oxy hóa

1.2.1 Gốc tự do

Gốc tự do là một thuật ngữ khoa học dùng để chỉ các phân tử hóa học có điện tử độc thân không ghép đôi Vì chứa điện tử độc thân nên gốc tự do hoạt động rất mạnh gây ra các tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA… [55]

Trong cơ thể con người gốc tự do được sinh ra do nhiều nguyên nhân khác nhau như quá trình hô hấp tế bào, cơ chế giải độc ở gan, ảnh hưởng của tia bức xạ, tia tử ngoại, môi trường sống bị ô nhiễm, thực phẩm có chứa chất màu tổng hợp và nước có nhiều chlorine [31]

- Lợi ích của gốc tự do

Trong điều kiện có kiểm soát, gốc tự do là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần cho thị giác, góp phần tạo ra prostaglandin - có tác dụng ngăn ngừa nhiễm trùng, tăng cường miễn dịch, hỗ trợ quá trình dẫn truyền tín hiệu thần kinh và co duỗi cơ [44, 51]

- Tác hại của gốc tự do

Đối với sức khỏe con người: Khi cơ thể khỏe mạnh, gốc tự do sản sinh ra có giới hạn vì bị cân bằng bởi hệ thống chống oxy hóa có sẵn trong cơ thể Khi hệ thống chống oxy hóa của cơ thể bị suy giảm số lượng gốc tự do sinh ra ngày càng tăng, các gốc tự do thúc đẩy phản ứng lên ty lạp thể gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc khiến chúng mất khả năng sản xuất năng lượng; gây hủy hoại màng tế bào và cấu trúc di truyền trong nhân tế bào Gốc tự do là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nguy hiểm như ung thư, loét dạ dày, viêm khớp, đẻ non [26], thiếu máu cục bộ, xơ vữa động mạch [38], đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không rõ nguyên nhân [53], Alzheimer, Parkinson [50] và bị lão hóa sớm [57]

Trong lĩnh vực thực phẩm: Oxy hóa lipid là mối lo ngại lớn vì nó tạo ra các chất

có phân tử lượng thấp như aldehyd, xeton, alcol, alkan, các acid ngắn mạch… dẫn đến

sự hình thành màu sắc, mùi vị không mong muốn; làm giảm thời hạn sử dụng của thực phẩm và có khả năng gây độc đối với cơ thể [49]

Vì vậy, nghiên cứu chất chống oxy hóa trở thành vấn đề được ngành dược, thực phẩm thuốc cũng như ngành chế biến và bảo quản thực phẩm rất quan tâm [47]

1.2.2 Chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là các chất có khả năng ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa chất khác [32] Chất chống oxy hóa được chia làm hai loại là chất chống oxy hóa tự nhiên và chất chống oxy hóa tổng hợp

Chất chống oxy hóa được coi là tự nhiên nếu nó được tách chiết từ nguyên liệu tự nhiên hay được chuyển hóa bằng con đường sinh học như sử dụng tế bào của chính nó hoặc sử dụng enzyme Một số chất chống oxy hóa được thu nhận từ tự nhiên như retinoids (vitamine A), tocopherols (vitamine E), ascorbic acid (vitamine C), polyphenols, carotenoids, manganese, zinc, selenium [32] Protein thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa thu nhận từ quá trình thủy phân protein động thực vật bằng enzyme cũng được coi là chất chống oxy hóa tự nhiên

Chất chống oxy hóa tổng hợp là các chất chống oxy hóa được tạo thành bằng con đường hóa học Một số chất chống oxy hóa tổng hợp được sử dụng rộng rãi như butylated hydrotolene (BHT), butylated hydroanisole (BHA), propyl gallate (PG), ethoxyquin, nordihydroguai acetic acid (NDGA), 2,4,5-trihydroybutyrophenone

(THBP), octyl gallate (OG), tertiary butyl hydroquinone (TBQH, tertiary butyl hydroquinone (TBQH) [ 3 2 ]

Các nghiên cứu về chất chống oxy hóa tự nhiên và chất chống oxy hóa tổng hợp cho thấy các chất chống oxy hóa tự nhiên đa dạng hơn, tạo ra nhiều tác động tích cực đến chất lượng cảm quan khi bổ sung vào thực phẩm và dễ dàng được chấp nhận bởi người tiêu dùng và các cơ quan y tế [34] Tuy nhiên, so với các chất chống oxy hóa tổng hợp thì các chất chống oxy hóa tự nhiên trong thành phần còn có nhiều chất khác

và hoạt tính chống oxy hóa thấp hơn

Các thăm dò xu thế tiêu dùng trên thế giới về các chất chống oxy hóa cho thấy, hiện nay người tiêu dùng ngày càng có xu hướng sử dụng các chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên vì giá trị dinh dưỡng và tính an toàn của nó [34] Do đó, nhiều quốc gia trên thế giới đặc biệt quan tâm, đầu tư vào việc nghiên cứu thu nhận và ứng dụng các chất chống oxy hóa tự nhiên trong các lĩnh vực như thuốc, thực phẩm chức năng, mỹ phẩm

1.3 Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa được áp dụng phổ biến

độ hấp phụ của hỗn hợp cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của hỗn hợp tăng

3 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng ức chế gốc tự do nitric oxide

Nguyên tắc

Nitric oxide ( NO ) phản ứng với oxy tạo ra sản phẩm bền vững là nitrite và nitrate, chất ức chế gốc tự do ( NO ) sẽ phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả làm giảm hàm lượng nitrite tạo thành trong dung dịch nước, nồng độ nitrite trong dung dịch nước được xác định bằng phương pháp phân tích quang học sử dụng thuốc thử Greiss Trong đó, nitrite phản ứng với thuốc thử Greiss tạo thành hợp chất màu diazo naphthyl

- amino azobenzene sulfonic bền vững và có bước sóng hấp thụ cực đại ở 540 nm Dựa trên sự giảm nồng độ nitrite tạo thành tính được khả năng khử gốc tự do ( NO ) của chất chống oxy hóa [47, 42]

DPPH

Màu tím

DPPH-H Màu vàng Chất chống oxy hóa

.

Hình1.3 Cơ chế phản ứng tạo màu của nitrite bằng thuốc thử Greiss

4 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng tạo phức càng cua với ion sắt II

Nguyên lý

Ion sắt hay đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do Khi cho ion

Fe2+ tác dụng với thuốc thử Ferrozin sẽ sinh ra phức màu có độ hấp phụ cực đại tại bước sóng 562 nm [42] Mẫu thử sẽ khóa các kim loại vào phức, không cho kim loại tồn tại ở dạng tự do nên làm mất khả năng xúc tác của kim loại

Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử sẽ được đánh giá dựa trên khả năng ngăn chặn sự tạo thành phức chất có màu giữa ion Fe2+ với thuốc thử Ferrozin

5 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng ức chế enzyme Xanthine oxidase

Nguyên lý

Xanthine oxidase là một enzyme oxy hóa, xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine tạo thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O Acid uric có bước sóng hấp phụ cực đại tại 290 nm [46] Nếu mẫu thử có khả năng ức chế enzyme XO càng cao càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm độ hấp phụ

Hình 1.4 Phản ứng tạo acid uric

1.3.1 In vivo

1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào hàm lượng Malondialdehyde

Malondialdehyde (MDA) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên được áp dụng rộng rãi để nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid của màng tế bào

Nguyên tắc

MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi cho MDA phản ứng với acid thiobarbituric ở môi trường pH bằng 2-3, nhiệt độ 90-100OC trong thời gian từ 10-15 phút sẽ tạo phức màu hồng Phức màu được hòa tan trong dung môi hữu cơ như butanol sau đó được đo phổ hấp phụ tại bước sóng 532nm Dựa trên sự giảm cường độ hấp phụ của phức tính được khả năng chống oxy hóa của chất cần nghiên cứu [52]

Phản ứng tạo phức giữa MDA và acid thiobarbituric được biểu diễn như sau:

Malondialdehyde Acid Thiobarbituric Phức NIFES (màu hồng)

Hình 1 5 Phản ứng tạo phức màu giữa MDA và acid thiobarbituric

2 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên sự khử Glutathione

Glutathione là thành phần thiết yếu của tế bào, nó đóng vai trò quan trọng trong các chuyển hóa của cơ thể, với các chức năng chính bao gồm: Chất chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch, giải độc, tăng cường năng lượng, làm trắng da và mờ vết nám

Sự thiếu hụt glutathione trong các sinh vật sống sẽ dẫn đến sự rối loạn và tổn thương các mô, là nguyên nhân của các bệnh lý như ung thư, bệnh tim mạch, bệnh phổi, bệnh tiêu hóa, Alzheimer, tiểu đường… Khi cơ thể khỏe mạnh, mỗi tế bào trong cơ thể sản sinh đủ glutathione để bảo vệ cơ thể khỏi ô nhiễm môi trường, stress và các chất độc hại khác

Nguyên lý

Mức độ glutathione của tế bào được xác định bằng cách cho hỗn hợp chứa glutathione đã được đồng hóa phản ứng với thuốc thử Ellman (5-5 dithiobis-2nitrobenzoic acid) Hỗn hợp được đo ở bước sóng 412 nm, độ hấp phụ của hỗn hợp được so sánh với đường cong glutathione chuẩn, từ đó tính được hàm lượng glutathion trong mô [52]

3 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng ức chế enzyme catalase

Catalase là enzyme đóng vai trò phân hủy hydroperoxide (H2O2) trong hầu hết các cơ thể sinh vật Enzyme catalase có nhiều trong peroxisome của tế bào và xúc tác phản ứng chuyển hóa H2O2 thành nước và oxy; bảo vệ tế bào khỏi sự phá hủy của hydroperoxide và hydroxyl

Nguyên lý

Hoạt tính của enzyme catalase được xác định theo phương pháp của Aebi bằng cách cho hỗn hợp chứa enzyme catalase phản ứng với H2O2 trong đệm phosphat Tỷ lệ

H2O2 bị phân hủy được xác định bằng cách đo độ hấp phụ của hỗn hợp tại bước sóng

240 nm Hoạt tính chống oxy hóa của enzyme được đánh giá dựa trên sự giảm hàm lượng H2O2 [52]

Các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên ngày càng được sử dụng rộng rãi trong đánh giá hoạt tính chống oxy hóa; nhằm tìm ra những hợp chất có khả năng ức chế gốc tự do cũng như ngăn chặn các quá trình sinh ra nó, những hợp chất này được gọi là các chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa có thể được sản sinh

tự nhiên trong cơ thể như các enzyme superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase; có sẵn trong các loại thực phẩm như vitamin E, vitamin C và các hợp chất thuộc họ phenolic như flavonoid, stilbene, lignan, tannin hoặc các chất chống oxy hóa được hình thành từ quá trình chế biến thực phẩm như các acid amin, các dipeptide và tripeptide

Mặc dù hiện nay có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa nhưng đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa vào khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử được sử dụng rộng rãi vì đây là các phương pháp đơn giản, có độ tin cậy cao,

ít tốn kém và dễ áp dụng

1.4 Protein thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa

1.4.1 Khái quát về protein thủy phân

Protein thủy phân là hỗn hợp sản phẩm thủy phân protein, bao gồm các acid amin

tự do, các polypeptide, các peptide với chiều dài mạch khác nhau và cả các protein chưa bị thủy phân [21, 22]

Hình 1.6 Hỗn hợp protein thủy phân

Nguyên liệu để sản xuất protein thủy phân có thể là protein đã qua tinh chế hoặc nguyên liệu thô giàu protein [22] Trong quá trình sản xuất protein thủy phân, điều quan trọng nhất là không làm giảm đi các tính chất chức năng của protein ban đầu [35] Do đó, các phương pháp sản xuất cũng như các thông số của quá trình thủy phân cần được chọn lọc và kiểm soát nghiêm ngặt nhằm hạn chế tối đa việc làm biến tính protein [41, 43] Nhiều nghiên cứu đang hướng đến ứng dụng những kỹ thuật mới,

hiện đại, điều kiện vận hành nhẹ nhàng để thu được sản phẩm chất lượng cao [54, 53] 1.4.2 Một số nghiên cứu về protein thủy phân trong nước và thế giới

1 Nghiên cứu trong nước

Trong nước có nhiều công trình công bố về ứng dụng enzyme trong sản xuất các sản phẩm thủy phân, các công trình nghiên cứu tập trung chủ yếu ở các lĩnh vực như sản xuất nước mắm ngắn ngày, sản xuất dịch đạm thủy phân, bột đạm thủy phân, pasta, bột dinh dưỡng Một số công trình nghiên cứu ở trong nước như sau:

- Ngô Thị Mại và Nguyễn Thị Dự (1991) đã thủy phân cá bằng bổ sung enzyme

Bacillus subtilis Kết quả cho thấy khi bổ sung 0,3% chế phẩm B subtilis vào chượp

thì thời gian chế biến nước mắm giảm xuống còn 30 - 35 ngày trong điều kiện tự nhiên của mùa hè, sản phẩm thu được là dịch đạm có hàm lượng acid amin cao [14]

- Nguyễn Văn Lệ (1996) công bố nghiên cứu về sản xuất bột đạm thủy phân từ đầu tôm và từ cá bằng cách sử dụng enzyme protease tách chiết từ đầu tôm Kết quả thu được bột đạm có hàm lượng acid amin cao, có mùi thơm đặc trưng [11]

- Vũ Ngọc Bội (2004) đã công bố các nghiên cứu về thu nhận và sử dụng

protease B subtilis S5 trong sản nước mắm ngắn ngày và sản xuất bột đạm thủy phân

từ nguyên liệu cá cơm Kết quả thu được bột đạm có hàm lượng acid amin tự do cao hơn, mùi thơm hơn và đạt các chỉ tiêu vi sinh vật; bên cạnh đó nước mắm cá cơm cao

đạm sản xuất bằng cách sử dụng enzyme B subtilis S5 để thủy phân có hàm lượng,

thành phần acid amin cao hơn nước mắm cốt sản xuất bằng phương pháp truyền thống

và các phương pháp khác [2]

- Đỗ Văn Ninh (2004) đã công bố nghiên cứu về sản xuất dịch đạm thủy phân từ

cá mối và pasta cá bằng cách sử dụng enzyme protease tách chiết từ nội tạng cá và gan mực Kết quả nghiên cứu cho thấy bột protein cá thủy phân có hàm lượng nitơ acid amin cao, có đầy đủ và cân đối các acid amin không thay thế và tương đối đủ khoáng chất; lượng acid amin tự do trong bột protein thủy phân cao gấp 16 lần so với thịt cá tươi Từ bột đạm protein thủy phân có thể sản xuất bột dinh dưỡng cao đạm bằng cách phối chế với các loại bột đậu, bột gạo, dầu ăn, khoáng và các vitamin Nghiên cứu cũng cho thấy có thể sản xuất pasta cá bằng cách phối chế bột đạm protein thủy phân với tinh bột, đường, sorbitol và các loại gia vị khác [16]

- Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004) công bố các nghiên cứu về sử dụng protease từ đầu tôm bạc nghệ trong sản xuất bột đạm thủy phân từ thịt cá mối Kết quả nghiên cứu cho thấy bột đạm thủy phân thịt cá mối bằng enzyme có hàm lượng các acid amin cao,

có mùi thơm đặc trưng [20]

- Lý Thị Minh Phương (2008) nghiên cứu sản xuất chế phẩm dịch thủy phân từ thịt hàu biển Kết quả nghiên cứu cho thấy thịt hàu thủy phân bằng enzyme Allzyme

FD thu được dịch thủy phân có hàm lượng acid amin cao, có mùi thơm đặc trưng và đảm bảo các tiêu chuẩn về vi sinh vật [17] Kết quả phân tích acid amin cho thấy dịch thủy phân hàu chứa hàm lượng cao acid amin phenylalanine, tyrosine và lysine

- Lâm Tuyết Hận (2009) nghiên cứu sản xuất bột cá thủy phân bằng cách sử dụng enzyme protease thu từ nội tạng cá chẽm làm xúc tác cho quá trình thủy phân thịt cá Kết quả thu được bột cá có giá trị dinh dưỡng cao, mùi thơm đặc trưng, hòa tan tốt trong nước và khả năng tạo gel cao [7]

- Huỳnh Dự (2010) nghiên cứu sản xuất dịch thủy phân từ phế liệu mực để bổ sung vào thức ăn nuôi cá Kết quả thu được dịch thủy phân có hàm lượng acid amin cao, dễ tiêu hóa, dễ hấp thụ; khi bổ sung vào thức ăn nuôi cá cho thấy tốc độ lớn của

cá nhanh hơn [5]

- Triệu Minh Hiển (2010) nghiên cứu chế biến bột đạm từ sinh khối Artemia bằng phương pháp sử dụng enzyme protease Kết quả thu được sản phẩm bột đạm thủy

phân có màu nâu nhạt, mùi thơm đặc trưng và hàm lượng acid amin cao; thành phần acid amin chủ yếu là tyrosine, lysine và histidine [8]

Mặc dù trong nước có nhiều nghiên cứu về protein thủy phân từ động vật thủy sản nhưng chưa có công trình nào nghiên cứu về protein thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa đặc biệt là protein thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa từ sinh khối Artemia

Vì vậy, nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của protein thủy phân từ sinh khối Artemia là hoàn toàn mới mẻ

2 Nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất protein thủy phân từ các nguồn thực vật và động vật khác nhau Một số nghiên cứu tiêu biểu:

- Klompong và cộng sự (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của mức độ thủy phân và loại enzyme đến hoạt tính chống oxy hóa và đặc điểm, tính chất của protein thủy phân

từ cá chỉ vàng Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của protein thủy phân từ cá chỉ vàng thay đổi theo mức độ thủy phân và loại enzyme sử dụng Khả năng tạo nhũ, tạo bọt của protein thủy phân cũng phụ thuộc vào hai nhân tố này Thêm vào đó tính chất, chức năng của protein thủy phân còn bị ảnh hưởng bởi pH Vì vậy, protein thủy phân từ cá chỉ vàng có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm như là một chất chống oxy hóa tự nhiên [38]

- Saiga (2003) nghiên cứu đặc tính, chức năng chống oxy hóa và chống tăng huyết áp của peptide có nguồn gốc từ protein thịt Nghiên cứu cho thấy sản phẩm thủy phân từ thịt bằng enzyme papain có hoạt tính lớn hơn sản phẩm thủy phân do enzyme actinase mặc dù thành phần chính của sản phẩm thủy phân bởi hai enzyme đều là các acid amin như glycine, asparagine, lysine.Tuy nhiên, tính kị nước của các acid amin thu được từ quá trình thủy phân protein do enzyme papain lớn hơn tính kị nước của các acid amin thu được từ quá trình thủy phân protein do enzyme actinase Điều đó chứng tỏ hoạt tính chống oxy hóa có liên quan tới tính kị nước của các acid amin Hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm thủy phân từ thịt heo bằng enzyme papain tương đương với hoạt tính chống oxy hóa của vitamin E tại pH 7 [51]

- Thiansilakul và cộng sự (2005) nghiên cứu thành phần, tính chất chức năng và hoạt tính chống oxy hóa của protein cá nục thủy phân Kết quả cho thấy, khi sử dụng enzyme Flavourzyme với mức độ thủy phân 60% thì protein thủy phân có màu vàng nâu Protein thủy phân chứa hàm lượng cao các acid amin thiết yếu (48,04%) và có

hàm lượng cao các acid amin như arginine, lysine; ngoài ra sản phẩm thủy phân có hàm lượng Na+ cao Protein thủy phân có khả năng hòa tan, khả năng tạo bọt cao Khi bảo quản ở 25OC và 4OC trong 6 tuần cho thấy hoạt tính chống oxy hóa và khả năng hòa tan của protein thủy phân cá nục giảm nhẹ Màu vàng của sản phẩm thủy phân trở nên sậm hơn khi kéo dài thời gian bảo quản và mức sẫm màu khi bảo quản ở 25OC nhanh hơn khi bảo quản ở 4OC [54]

- Foh và cộng sự (2010) nghiên cứu ảnh hưởng của mức độ thủy phân đến tính chất, chức năng và đặc tính chống oxy hóa của protein cá rô phi thủy phân Nghiên cứu đã chứng minh enzyme Alcalase là một enzyme phù hợp cho sản xuất protein cá

rô phi thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa Bột đạm thủy phân từ cá rô phi có màu vàng nhạt, mùi thơm, dễ tiêu hóa, dễ hấp thụ [27]

- Picot và cộng sự (2006) nghiên cứu hoạt tính chống sự phát triển của tế bào ung thư vú từ protein cá thủy phân Kết quả cho thấy protein thủy phân từ cá có khả năng chống ung thư Tuy nhiên, nghiên cứu trên chưa xác định rõ mối quan hệ giữa khối lượng phân tử của các peptide và hoạt tính chống sự phát triển của tế bào ung thư vú Nghiên cứu cho thấy thành phần của protein thủy phân chủ yếu là các dipeptide và tripeptide rất dễ hấp thụ [46]

- Rajaram và Nazeer (2010) nghiên cứu tính chất chống oxy hóa của sản phẩm thủy phân protein cá hố và cá nhám Nghiên cứu cho thấy enzyme pepsin thích hợp để thủy phân cá hố và cá nhám Sản phẩm thủy phân protein của hai loại cá này đều có hoạt tính chống oxy hóa Tuy nhiên, sản phẩm thủy phân protein cá hố có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn, và hoạt tính chống oxy hóa phụ thuộc vào thành phần và hàm lượng các acid amin [50]

- Liu và Chiang (2008) nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa, đặc điểm, tính chất của sản phẩm thủy phân từ hạt vừng tách béo Kết quả thu được sản phẩm là các peptide ngắn mạch, có khối lượng phân tử khoảng 4 - 6 kDa, có hoạt tính chống oxy hóa cao và có tác dụng làm giảm huyết áp Bên cạnh đó nghiên cứu còn cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm thủy phân phụ thuộc vào loại enzyme thủy phân và các thông số của quá trình thủy phân như nhiệt độ, pH, tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) và thời gian thủy phân [41]

- Nilsang (2004) nghiên cứu các thông số tối ưu cho quá trình thủy phân thịt cá hòa tan cô đặc bằng enzyme protease Kết quả cho thấy enzyme Flavourzyme có hiệu

quả thủy phân tốt nhất đối với thịt cá hòa tan cô đặc và điều kiện hoạt động tối ưu của enzyme là 50 LAPU enzyme/1gam protein, thời gian thủy phân 6 giờ, nhiệt độ thủy phân 45OC Với điều kiện này protein thủy phân từ thịt cá có vị đắng thấp, sản phẩm này có thể sử dụng bổ sung vào các thực phẩm khác để tăng thêm mùi vị [43]

- Kim và cộng sự (2007) nghiên cứu tinh chế và xác định đặc điểm của peptide chống oxy hóa từ cá hoki Peptide thu được sau khi thủy phân protein cá hoki bằng enzyme protease có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn α - tocopherol Các peptide có hoạt tính chống oxy hóa có khối lượng phân tử khoảng 1801 Da và có chứa các acid amin sau: Glutamine - serine - threonine - valine - proline - glutamine - arginine - threonine - histidine - proline - alanine - cysteine - proline - asparagine - phenylalanine

- asparagine [37]

- Kamau và Lu (2011) nghiên cứu ảnh hưởng của enzyme và điều kiện thủy phân đến mức độ thủy phân và hoạt tính chống oxy hóa của protein huyết thanh sữa thủy phân Kết quả cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của các peptide thu được từ quá trình thủy phân protein huyết thanh sữa phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH,

tỷ lệ E/S và thời gian thủy phân; bên cạch đó sự tinh sạch của enzyme cũng ảnh hưởng tới hoạt tính chống oxy hóa của peptide thu được từ quá trình thủy phân protein huyết thanh sữa [38]

Các nghiên cứu trên cho thấy sản phẩm thủy phân protein bằng enzyme có hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm phụ thuộc vào loại enzyme thủy phân và các thông số của quá trình thủy phân như nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, thời gian thủy phân…; bên cạnh đó hoạt tính chống oxy hóa còn liên quan tới thành phần của dịch thủy phân

1.4.3 Thành phần chống oxy hóa của protein thủy phân

Không chỉ có peptide và các acid amin thu được từ quá trình thủy phân protein có hoạt tính chống oxy hóa mà bản thân protein cũng có hoạt tính chống oxy hóa [21] Trong phân tử protein đã chứa sẵn những đoạn peptide có hoạt tính sinh học Tuy nhiên, khi nằm trong mạch protein (hay polypeptide) các hoạt tính này tồn tại dưới dạng tiềm ẩn, không được thể hiện Khi được giải phóng ra khỏi mạch bằng cách thủy phân với enzyme đặc hiệu, các đoạn peptide và các acid amin tự do này sẽ thể hiện được hoạt tính của chúng [48, 51]

Các acid amin tự do thường thể hiện hoạt tính chống oxy hóa không cao trong thực phẩm và các hệ thống sinh học; sự phân giải triệt để protein tạo thành các acid amin tự do thường làm giảm hoạt tính chống oxy hóa [27, 41]

Hoạt tính chống oxy hóa của các peptide thường cao hơn so với các acid amin tự

do, khả năng đó có liên quan tới tính chất đặc biệt được hình thành từ thành phần cấu tạo, tính chất vật lý và sự ổn định của các peptide [22, 43]

- Phần lớn các peptide chống oxy hóa có nguồn gốc thực phẩm có khối lượng khoảng 500 - 800 Da, một số peptide có khối lượng phân tử 8 - 15 kDal Trong thành phần cấu tạo của các peptide này có chứa các acid amin kị nước như valine, leucine tại đầu nitơ tận cùng và proline, histidine, tyrosine, tryptophan, methionine trong thành phần chuỗi [25, 50]

- Các acid amin kị nước như valine và leucine có thể làm tăng sự tương tác giữa peptide và acid béo để loại gốc tự do [31]

- Hoạt tính chống oxy hóa của histidine trong chuỗi peptide được xác định là do khả năng cho hydro, giữ gốc peroxy lipid, hoặc khả năng tạo phức kim loại của vòng imidazol [35]

Thành phần acid amin và vị trí sắp xếp của các acid amin trong chuỗi peptide sẽ quyết định khả năng chống oxy hóa của các peptide Vì vậy, khi thay đổi vị trí sắp xếp

và thành phần các acid amin sẽ làm thay đổi hoạt tính chống oxy hóa của các peptide [41, 50]

- Trong chuỗi peptide, acid amin histidine và proline đóng vai trò quan trọng trong hoạt động chống oxy hóa và peptide có cấu trúc proline - histidine - histidine có khả năng chống oxy hóa cao hơn Hơn thế nữa peptide này có sự tương tác với các chất chống oxy hóa tan trong lipid như α - tocopherol, BHA và làm tăng hoạt tính chống oxy hóa của chúng [27, 45]

- Tripeptide chứa 2 acid amin tyrosine có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với tripeptide chứa 2 acid amin histidine trong hệ thống peroxy hóa của linolic [38]

- Nếu loại gốc histidine của đầu carbon tận cùng của chuỗi peptide thì hoạt tính chống oxy hóa sẽ giảm trong khi loại gốc leucine ở đầu nitơ tận cùng thì không ảnh hưởng tới hoạt tính chống oxy hóa [50]

Những kết quả nghiên cứu trên cho thấy vai trò của thành phần acid amin, vị trí sắp xếp của các acid amin và chiều dài chuỗi peptide trong việc quyết định hoạt tính chống oxy hóa của peptide

1.4.4 Ứng dụng của sản phẩm protein thủy phân

Khi protein được thủy phân thành hỗn hợp các peptide mạch ngắn và một số acid amin thì khả năng tiêu hóa dễ dàng hơn [21, 40] Do đó, sản phẩm thủy phân protein được sử dụng trong khẩu phần ăn của những bệnh nhân mắc bệnh về đường tiêu hóa như phenylketone niệu [46], dị ứng thực phẩm, các bệnh về gan cấp và mãn tính, viêm

dạ dày, viêm ruột [42]… đóng vai trò quan trọng trong dinh dưỡng trị liệu [47]

Hình1.7 Qúa trình hấp thu các acid amin và peptide qua thành ruột

Chính nhờ giá trị dinh dưỡng cao và tính chất dễ tiêu hóa, protein thủy phân là thành phần chính trong các công thức dinh dưỡng dành cho người già [43], vận động viên thể thao [44], bệnh nhân trong thời kỳ dưỡng bệnh hay hồi sức [43], các sản phẩm thức uống giàu năng lượng [50]

Với những tính chất chức năng quan trọng như khả năng hòa tan trong nước và giữ nước, khả năng tạo độ nhớt, khả năng tạo gel, khả năng tạo nhũ, khả năng tạo bọt, khả năng cố định mùi; protein thủy phân ngày càng được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm

Bên cạnh những ứng dụng về dinh dưỡng thông thường, thì protein thủy phân còn

có nhiều ứng dụng khác nhờ có chứa các peptide có hoạt tính sinh học Do những tính chất đặc biệt ảnh hưởng đến chức năng sinh lý của cơ thể của các peptide có hoạt tính sinh học nên protein thủy phân được ứng dụng trong dược phẩm và thực phẩm chức năng Các chức năng đáng chú ý của các peptide sinh học trong protein thủy phân là

làm giảm huyết áp, ảnh hưởng đến hệ thần kinh (giảm căng thẳng, dễ ngủ…) [45], vận chuyển khoáng trong cơ thể, tăng cường miễn dịch (chống vi sinh vật, chống ung thư), chống đông máu, chống oxy hóa [47, 46]

1.5 Thủy phân protein

1.5.1 Khái quát về quá trình thủy phân protein

Thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dương trong hợp chất hữu cơ thành các đơn phân dưới tác dụng của chất xúc tác có sự tham gia của nước trong phản ứng [13]

H2N – CH – CO – NH – CH – CO – NH – H2N – CH – COOH + H2N – CH – CO – NH–

Dưới tác dụng của chất xúc tác protein bị phân giải thành các polypeptide, peptide và cuối cùng là các acid amin Có nhiều chất xúc tác cho quá trình thủy phân như enzyme, acid mạnh, kiềm mạnh, nhiệt độ cao, áp suất cao

- Thủy phân bằng acid: Trong sản xuất thường dùng HCl; ngoài ra có thể dùng

H2SO4 Acid phân ly càng mạnh thì phản ứng thủy phân xảy ra càng nhanh Sản phẩm thủy phân thu được chủ yếu là các acid amin tự do dưới dạng hydrogenclorate Một số acid amin như serine và threonine bị phá hủy một phần, tryptophane bị phá hủy hoàn toàn, glutamine và asparagine phân ly thành acid glutamic, acid aspartic và NH4+[13]

- Thủy phân bằng kiềm: Thường thực hiện bằng cách đun nóng cơ chất trong

NaOH Sản phẩm thu được là các acid amin nhưng đều bị recemic hóa chuyển từ dạng

L sang dạng D, trong khi cơ thể người và động vật chỉ hấp thụ được acid amin dạng L; dạng D đôi khi ảnh hưởng xấu đến quá trình trao đổi chất [13]

Dưới điều kiện thủy phân của acid, kiềm xảy ra hàng loạt các phản ứng khử amin, một phần cystein và cystin bị phá hủy; sản phẩm mất đi giá trị dinh dưỡng cũng như các tính chất chức năng cần thiết Hơn nữa quá trình thủy phân bằng acid hay kiềm rất khó kiểm soát, đòi hỏi thiết bị chịu được acid, kiềm; không an toàn với công nhân sản xuất; là mối đe dọa đối với môi trường [13]

- Thủy phân bằng enzyme: Là phương pháp được áp dụng rộng rãi trong nhiều

lĩnh vực khoa học khác nhau Sử dụng enzyme làm chất xúc tác có ưu điểm là không

có sản phẩm phụ do enzyme có tính đặc hiệu cao, thủy phân trong điều kiện nhiệt độ

khoảng 40 - 60OC, pH khoảng 6 - 8 nên không gây biến tính protein cũng như tổn hao các aicd amin, sản phẩm vẫn giữ được giá trị dinh dưỡng và bảo tồn được các tính năng sinh học Ngoài ra, thủy phân bằng enzyme còn dễ dàng kiểm soát quá trình thủy phân; không cần sử dụng thiết bị chịu acid, chịu kiềm, nhiệt độ và áp suất cao; không gây độc hại với công nhân và thân thiện với môi trường [13]

Việc lựa chọn enzyme là một nhân tố quan trọng trong quá trình thủy phân protein vì những protease khác nhau có đặc tính thủy phân khác nhau Enzyme thủy phân được phân loại dựa vào cơ chế thủy phân của chúng, gồm hai loại enzyme là endoprotease và exopeptidase [12]

+ Enzyme endoprotease thủy phân liên kết peptide bên trong phân tử protein một cách ngẫu nhiên, tạo ra nhiều peptide lớn và lượng rất ít các acid amin tự do

+ Enzyme exopeptidase thủy phân các liên kết peptide từ hai đầu của chuỗi polypeptide; kết quả thu được một hỗn hợp các acid amin tự do và một phần các peptide lớn

Hình 1.8 Qúa trình thủy phân protein và các peptide bằng endoprotease và exopeptidase 1.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein

Thủy phân là công đoạn quan trọng nhất trong sản xuất protein thủy phân Tùy thuộc vào loại enzyme và điều kiện thủy phân mà sản phẩm thủy phân có thể là các peptide hay acid amin Mức độ thủy phân sẽ quyết định các tính chất chức năng của sản phẩm, do đó cần kiểm soát nghiêm ngặt quá trình thủy phân nhằm thu được sản phẩm với những đặc tính mong muốn [38, 43] Mức độ thủy phân sẽ tăng dần theo thời gian phản ứng, khi đạt giá trị yêu cầu (có thể xác định một cách tương đối dựa vào thời

gian thủy phân) quá trình thủy phân sẽ được dừng lại bằng cách vô hoạt enzyme [49] Quá trình thủy phân thường chịu ảnh hưởng của các yếu tố sau:

1 Ảnh hưởng của loại enzyme thủy phân

Tính chất đặc hiệu là biểu hiện khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nhất định Enzyme có tính đặc hiệu rất cao; tính đặc hiệu của enzyme cho thấy sự khác biệt rất lớn giữa enzyme với các chất xúc tác khác Trong nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân thì enzyme thủy phân đóng vai trò rất quan trọng vì nó quyết định thành phần và tính chất của sản phẩm thủy phân [41]

Hình 1.9 Qúa trình thủy phân để hình thành các peptide có hoạt tính sinh học

2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Bản chất của enzyme là protein nên kém bền với nhiệt, khi tăng hay giảm nhiệt

độ thường ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme Cũng như các enzyme khác, enzyme protease chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định, nhiệt độ thích hợp với đa số enzyme nằm trong khoảng 40OC - 50OC Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme, cứ nhiệt độ tăng 10OC thì tốc độ thủy phân tăng

từ 1,5 - 2 lần Ở nhiệt độ lớn hơn 70OC đa số enzyme bị mất hoạt tính [12] Do vậy, nhiệt độ 70OC gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme Bên cạnh đó nhiệt độ thủy phân còn ảnh hưởng đến các chất có hoạt tính sinh học của dịch thủy phân [40] Nhiệt độ thích hợp của một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH và cơ chất

3 Ảnh hưởng của pH môi trường

pH có ảnh hưởng lớn tới hoạt tính của enzyme vì pH ảnh hưởng đến mức độ ion

hóa cơ chất, ion hóa enzyme và độ bền của phức hợp protein - enzyme Mỗi enzyme

nói chung và protease nói riêng chỉ hoạt động ở một khoảng pH nhất định gọi là pH tối thích; pH tối thích của đa số protease nằm trong vùng trung tính, acid yếu hoặc kiềm yếu, chỉ có rất ít protease có thể hoạt động trong vùng rất acid chẳng hạn pepsin hay rất kiềm như trypsin [12, 35] Vì thế, phải tạo điều kiện pH thích hợp nhất cho hoạt

động của enzyme để thu được sản phẩm có những đặc tính như mong muốn Với từng enzyme, giá trị pH thích hợp có thể thay đổi khi nhiệt độ, nồng độ cơ chất… thay đổi

4 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Trong điều kiện thừa cơ chất nếu tăng nồng độ enzyme thì tốc độ thủy phân xảy

ra nhanh hơn Khi nồng độ enzyme bằng với nồng độ cơ chất, dù tăng nồng độ enzyme

bổ sung vào hỗn hợp thuỷ phân thì vận tốc của phản ứng thủy phân rất ít thay đổi [12]

5 Ảnh hưởng của thời gian thủy phân

Thời gian thủy phân ảnh hưởng lớn tới hiệu suất và tính chất của sản phẩm thủy phân Thời gian thuỷ phân càng dài thì cơ chất bị thủy phân càng sâu sắc làm cho hoạt tính chống oxy hóa giảm, bên cạnh đó thời gian thủy phân quá dài là điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật hoạt động phân hủy các acid amin tạo thành các sản phẩm thứ cấp như NH3, H2S, indol, scatol, …bên cạnh đó thời gian thủy phân quá dài làm giảm hiệu quả kinh tế [12, 39] Tuy nhiên, thời gian thủy phân rút ngắn, sự thủy phân protein chưa triệt để, hiệu suất thủy phân kém, gây lãng phí nguyên liệu Vì vậy, tùy thuộc vào mục đích của quá trình thủy phân mà lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp

6 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân

Nước là môi trường để phân tán enzyme và cơ chất, là môi trường tăng cường quá trình phân cắt các liên kết nhị dương nên tỷ lệ nước có ảnh hưởng lớn đến tốc độ, chiều hướng và là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme [12] Tuy nhiên, nước cũng là môi trường thích hợp cho hoạt động của vi sinh vật Vì vậy, đối với từng loại nguyên liệu cần phải nghiên cứu tỷ lệ nước bổ sung thích hợp

Vì vậy, để có thể thu nhận được dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa từ sinh khối Artemia bằng phương pháp sử dụng enzyme cần phải tiến hành các nghiên cứu lựa chọn loại enzyme protease và các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân

Từ những nội dung đã trình bày trong phần tổng quan cho thấy hiện nay việc sử dụng nguồn sinh khối Artemia chưa hiệu quả; chủ yếu dùng làm thức ăn nuôi trồng thủy sản Các nghiên cứu về giá trị dinh dưỡng, sinh học của protein Artemia để sử dụng trong sản xuất thực phẩm cho người chưa được quan tâm đặc biệt là hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân protein từ Artemia chưa có công trình nào công bố

Vì vậy, đề tài nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của protein thủy phân từ sinh khối Artemia là hoàn toàn mới mẻ

Nghiên cứu tập trung tìm loại enzyme protease và các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân protein Artemia để thu được dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao Bên cạnh đó, còn xác định thành phần có hoạt tính chống oxy hóa trong dịch thủy phân để có thể ứng dụng trong thực phẩm giàu dinh dưỡng, thực phẩm chức năng, cũng như trong chế biến và bảo quản thực phẩm Đây là nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng Artemia

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và hóa chất

2.1.1 Nguyên vật liệu

2 1.1.1 Artemia

Artemia sử dụng trong đề tài

này có tên khoa học là Artemia

franciscana Là đối tượng nuôi

thương phẩm tại trại nuôi thuộc xã

Ninh Ích - Ninh Hòa - Khánh Hòa

Từ các trang sau của luận văn

Artemia franciscana được gọi tắt là

Bảng 2.1 Điều kiện hoạt động thích hợp và điều kiện xử lý để vô hoạt các enzyme

Điều kiện hoạt động thích hợp Điều kiện xử lý để vô hoạt Enzyme

( O C) pH

Nhiệt độ ( O C)

Thời gian (phút)

Neutrase là loại metallo endoprotease được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus

amyloliquefaciens; Alcalase là loại endoprotease được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis; Protamex kết hợp cả hai loại edoprotease và exopeptidase được thu

nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus amyloliquefaciens; Flavourzyme kết hợp cả hai loại edoprotease và exopeptidase thu nhận từ nấm Aspergillus oryzae

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích có tên, công thức hóa học và xuất xứ được trình bày ở Bảng 2.2

Bảng 2.2 Các hóa chất sử dụng trong phân tích

1 2,2-diphenyl-1-picryhyrazyl (DPPH) C18H12N5O6 Sigma (Mỹ)

2 Potassium ferricyanide K3[Fe(CN)6] Trung Quốc

6 Disodium hydrogen phosphate Na2HPO4..12H2O Trung Quốc

7 Sodium dihydrogen phosphate NaH2PO4 2H2O Trung Quốc

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu

Các nghiên cứu tổng thể của đề tài được trình bày trên sơ đồ bố trí thí nghiệm Hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

Thuyết minh

Artemia sau khi thu mua vận chuyển sống về phòng được xử lý loại bỏ tạp chất

và bảo quản Artemia nguyên liệu được gửi đi xác định thành phần hóa học Tiếp theo, tiến hành các thí nghiệm thăm dò loại enzyme và điều kiện thủy phân thích hợp để thu được dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao Tiến hành thủy phân Artemia bằng enzyme và các thông số thích hợp để thu dịch thủy phân và xác định các chất có hoạt tính chống oxy hóa trong dịch thủy phân

2.2.2 Bố trí thí nghiệm thu và xử lý mẫu

Mẫu Artemia sử dụng trong các thí nghiệm được thu, xử lý và bảo quản theo sơ

đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu và xử lý mẫu Thuyết minh:

Artemia được thu mua tại trại nuôi Ninh Hòa - Khánh Hòa được bảo quản sống

bằng nước biển sạch và vận chuyển về phòng thí nghiệm Sau đó sốc lạnh ở nhiệt độ 0

- 2oC trong thời gian 30 phút cho Artemia chết đồng loạt; một phần nguyên liệu được

Artemia

Bảo quản sống

Vận chuyển về phòng thí nghiệm

Sốc lạnh

Bảo quản đông

Đưa vào các thí nghiệm

sử dụng để xác định thành phần hóa học; phần còn lại được bao gói trong bao bì poly etylen và bảo quản đông (t0 = -200C ± 20C) để sử dụng cho các thí nghiệm sau

2.2.3 Xác định thành phần hóa học của Artemia

Thành phần hóa học của Artemia được xác định theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.4

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học của Artemia

Thuyết minh:

- Mục đích: Xác định thành phần hóa học cơ bản như protein, lipid, nước, tro

- Tiến hành: Cân một lượng mẫu Artemia nguyên liệu rồi gửi đi phân tích

- Thảo luận kết quả phân tích và kết luận về thành phần hóa học của Artemia Protein

2.2.4 Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại

Hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân được xác định theo

sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.5

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch

protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại Thuyết minh:

- Mục đích: Xác định họat tính chống oxy hóa của sản phẩm thủy phân bằng enzyme nội tại của Artemia

- Tiến hành: Artemia sau khi rã đông dưới vòi nước chảy được xay nhỏ, cho vào

hũ thủy tinh (khô, sạch); khối lượng mẫu mỗi mẫu là 100g Tiến hành thủy phân

Artemia

Xác định hoạt tính chống oxy hóa

Thảo luận

Kết luận về hoạt tính

chống oxy hóa của dịch

thủy phân Artemia bằng

enzyme nội tại