2. 1.1.1 Artemia
2.2.6. Xác định các điều kiện thủy phân thích hợp để thu được dịch protein
- Tiến hành: Artemia sau khi rã đông dưới vòi nước chảy được xay nhỏ, cho vào hũ thủy tinh (khô, sạch); khối lượng mỗi mẫu là 100 g. Trong đó, mẫu 1: bổ sung enzyme Protamex, mẫu 2: bổ sung enzyme Neutrase, mẫu 3: bổ sung enzyme Flavourzyme, mẫu 4 bổ sung enzyme Alcalase với hoạt độ enzyme 0,375 AU/g nguyên liệu, mẫu đối chứng không bổ sung enzyme. Tiến hành thủy phân trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 50OC (khi nhiệt độ trong hũ đạt 50OC tiến hành bổ sung enzyme), pH tự nhiên của nguyên liệu, thời gian thủy phân 5 giờ. Sau khi thủy phân tiến hành bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85OC/10 phút; pha loãng dịch thủy phân trong mỗi hũ bằng 100 ml nước cất rồi lọc lấy dịch; dịch lọc được tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
- Thảo luận kết quả thu được và chọn loại enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân protein Artemia để thu được dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao; đồng thời để tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân.
2.2.6. Xác định các điều kiện thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao cần xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân như tỷ lệ enzyme, nhiệt độ, pH, thời gian thủy phân.
1. Xác định tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Tỷ lệ enzyme/cơ chất thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao xác định theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.7.
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao Thuyết minh:
- Mục đích: Xác định tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp để thu được sản phẩm thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
- Tiến hành: Artemia sau khi rã đông dưới vòi nước chảy được xay nhỏ, cho vào hũ thủy tinh (khô, sạch); khối lượng mẫu mỗi mẫu là 100g. Tiến hành thủy phân Artemia bằng enzyme bổ sung đã chọn được ở trên với các tỷ lệ khác nhau (0,1%; 0,2%, 0,3%; 0,4%, 0,5%, 0,6%) trong điều kiện cố định các thông số như nhiệt độ, pH, thời gian thủy phân. Sau 5 giờ thủy phân, lấy mẫu bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85OC /10 phút; pha loãng dịch thủy phân trong mỗi hũ bằng 100 ml nước cất rồi lọc lấy dịch;
Artemia
Xay nhỏ
Thủy phân - pH tự nhiên
- Nhiệt độ: 50OC - Thời gian: 5 giờ - Tỷ lệ enzyme: 0,1%; 0,2%, 0,3%; 0,4%, 0,5%, 0,6% Lọc Xác định hoạt tính chống oxy hóa Dịch thủy phân Chọn tỷ lệ enzyme thích hợp Kết quả Thảo luận
dịch lọc được tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
- Thảo luận kết quả thu được và chọn tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
2. Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Nhiệt độ thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao tiến hành theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.8.
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Kết quả
Chọn nhiệt độ thủy
phân thích hợp. Thảo luận
Artemia Xay nhỏ Thủy phân - Enzyme thích hợp - Tỷ lệ E/S thích hợp - pH tự nhiên
- Thời gian: 5 giờ - Nhiệt độ : 30, 40, 45,
50, 55, 60 OC Lọc
Dịch thủy phân
Xác định hoạt tính chống oxy hóa
Thuyết minh:
- Mục đích: Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
- Tiến hành: Artemia sau khi rã đông dưới vòi nước chảy được xay nhỏ, cho vào hũ thủy tinh (khô, sạch); khối lượng mẫu mỗi mẫu là 100g. Tiến hành thủy phân Artemia bằng enzyme đã chọn được ở trên với các nhiệt độ thủy phân khác nhau (tO = 30OC, 40OC, 45OC, 50OC, 55OC, 60OC) trong điều kiện cố định các thống số như nồng độ enzyme, pH, thời gian thủy phân. Sau 5 giờ thủy phân, lấy mẫu bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85OC/10 phút; pha loãng dịch thủy phân trong mỗi hũ bằng 100 ml nước cất rồi lọc lấy dịch; dịch lọc được tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
- Thảo luận kết quả thu được và chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp để sản phẩm thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
3. Xác định pH thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
pH thích hợp cho quá trình thủy phân để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao được xác định theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.9.
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Artemia Xử lý Thủy phân Dịch thủy phân Xác định hoạt tính chống oxy hóa Kết quả Thảo luận Chọn pH thích hợp - Enzyme thích hợp - Tỷ lệ E/S thích hợp - Nhiệt độ thích hợp - Thời gian thủy phân: 5
giờ
Thuyết minh:
- Mục tiêu: Xác định pH thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
- Tiến hành: Mẫu thủy phân được chuẩn bị tương tự như các thí nghiệm trên. Tiến hành thủy phân Artemia bằng enzyme bổ sung đã chọn ở các pH khác nhau trong điều kiện cố định các thông số khác như nhiệt độ, tỷ lệ E/S, thời gian thủy phân. Sau 5 giờ thủy phân, lấy mẫu bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85OC/10 phút; pha loãng dịch thủy phân trong mỗi hũ bằng 100 ml nước cất rồi lọc lấy dịch; dịch lọc được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
- Thảo luận kết quả thu được và chọn pH thích hợp để sản phẩm thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
4. Xác định thời gian thủy phân thích hợp để dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Thời gian thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao được tiến hành theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.10.
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Xay nhỏ Thủy phân Dịch thủy phân Xác định hoạt tính chống oxy hóa Kết quả
Thảo luận Chọn thời gian thủy phân thích hợp - Enzyme thích hợp - Tỷ lệ E/S thích hợp - Nhiệt độ thích hợp - pH thích hợp
-Thời gian thủy phân: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 giờ Artemia
Thuyết minh:
- Mục đích: Xác định thời gian thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
- Tiến hành: Mẫu Artemia được chuẩn bị tương tự như thí nghiệm 2. Thủy phân protein Artemia với các điều kiện đã lựa chọn như loại enzyme, nhiệt độ, pH. Sau các khoảng thời gian 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 giờ lấy mẫu rồi bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85OC/10phút; pha loãng dịch thủy phân trong mỗi hũ bằng 100 ml nước cất rồi lọc lấy dịch; dịch lọc được tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
- Thảo luận kết quả thu được và chọn thời gian thích hợp để sản phẩm thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
2.2.3. Xác định các chất có hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân
Các chất có hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân được xác định theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.11.
Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định các chất có hoạt tính chống oxy hóa trong dịch protein Artemia thủy phân
Xác định hoạt tính chống oxy hóa Dịch thủy phân Tách lipid bằng n-hexan Artemia Xay nhỏ Thủy phân - Enzyme thích hợp - Tỷ lệ E/S - Nhiệt độ thích hợp - pH thích hợp - Thời gian thích hợp Lọc
Protein thủy phân và carotenoid Xác định hoạt tính chống oxy hóa Điện di Kết tủa cồn Kết tủa Dịch màu Dịch chiết n – hexan
Thuyết minh:
- Mục đích: Xác định các chất có hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân.
- Tiến hành: Artemia sau khi xử lý được thủy phân bằng enzyme và điều kiện thủy phân thích hợp đã lựa chọn. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân được xác định dựa trên hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử. Sau đó dịch thủy phân được tinh chế và xác định các chất có hoạt tính chống oxy hóa.
2.3. Phương pháp phân tích
- Hàm lượng protein xác định theo TCVN 4321-1 (1997) [18]. - Hàm lượng ẩm và tro xác định theo AOAC (1990) [32].
- Hàm lượng lipid được xác định bằng phương pháp Folch (1957) [28]. - Thành phần acid amin và acid béo được xác định bằng sắc ký khí.
- Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch thủy phân được xác định theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002) [29].
- Tổng năng lực khử của dịch thủy phân được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) [48].
- Khối lượng phân tử protein được xác định bằng điện di trên gel polyacrylamide.
2.2.3. Các máy móc thiết bị sử dụng
- Máy so màu UV/VIS - Máy đo PH
- Thiết bị sắc kí khí - Thiết bị điện di - Sắc kí bản mỏng - Thiết bị ổn nhiệt
2.2.4. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu
Các thí nghiệm và các phép phân tích được thực hiện lặp lại 3 lần. Tính giá trị trung bình, vẽ đồ thị và so sánh sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05) của các giá trị trung bình được thực hiện bằng phần mềm Microsoft Excel 2003.
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thành phần hóa học của Artemia
Kết quả xác định thành phần hóa học cơ bản của Artemia thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của sinh khối Artemia
STT Thành phần Hàm lượng
(% so với trọng lượng tươi)
1 Protein 8,13
2 Lipid 3,77
3 Tro 1,10
4 Ẩm 85,92
Kết quả phân tích ở Bảng 3.1 cho thấy Artemia có hàm lượng nước chiếm 85,92%, hàm lượng lipid chiếm 3,77% và hàm lượng protein 8,13%. So với một số loại nguyên liệu thủy sản khác thì Artemia có hàm lượng nước và lipid khá cao. Hàm lượng protein của Artemia thấp hơn so với một số loại loại nguyên liệu thủy sản khác như tôm (18 - 22%), cá (16 - 25%), mực (17 -20%) [3]. Tuy nhiên, Artemia có vòng đời ngắn, dễ nuôi, sản lượng thu được trên một hecta trong cùng thời gian nuôi cao [1] nên có thể cung cấp nguồn nguyên liệu dồi dào cho sản xuất thực phẩm. Bên cạnh đó, protein Artemia chứa hàm lượng cao các acid amin đặc biệt là các acid amin không thay thế được thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Thành phần acid amin của sinh khối Artemia STT Thành phần acid amin Hàm lượng (g/kg)
1 Alanine 0,04 2 Glycine 0,01 3 Valine* 0,77 4 Leucine* 0,24 5 Isoleucine* 0,61 6 Threonine* 0,08 7 Serine 0,12
8 Proline 0,16 9 Asparagine 1,13 10 Methionine* 0,61 11 4-Hydroxyproline 1,24 12 Glutamine 0,02 13 Phenylalanine* 0,83 14 Lysine* 1,3 15 Histidine 0,75 16 Tyrosine 2,93
Tổng hàm lượng acid amin 10,84
*Acid amin không thay thế
Kết quả phân tích ở bảng 3.2 thể hiện 16 loại acid amin của sinh khối Artemia trong đó có 7 acid amin không thay thế với hàm lượng cao là valine, isoleucine leucine, phenylalanine, lysine, threonine, methionine. Đây là các acid amin thiết yếu đối với quá trình sinh trưởng, phát triển và hoàn thiện các chức năng của cơ thể. Ngoài ra, protein Artemia còn chứa một lượng lớn các acid amin như tyrosine, histidine, proline. Theo một số nghiên cứu [45, 49] thì protein chứa các acid amin kị nước như valine, leucine; các acid amin có chứa lưu huỳnh như cystein, methionine hoặc các acid amin như tryptophan, histidine, proline khi thủy phân bằng enzyme thường cho sản phẩm là các peptide hoặc các acid amin có hoạt tính chống oxy hóa. Như vậy, sinh khối Artemia không chỉ rất giàu các chất dinh dưỡng thiết yếu đối với cơ thể mà còn là nguồn protein có chứa các acid amin có hoạt tính chống oxy hóa có thể sử dụng để phát triển các sản phẩm chức năng có hoạt tính chống oxy hóa.
Bên cạnh giá trị dinh dưỡng và sinh học từ protein, lipid của Artemia rất giàu các acid béo không no thiết yếu được thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Thành phần acid béo của sinh khối Artemia
STT Acid béo Hàm lượng
(% so với tổng lượng acid béo)
1 C14:0 0,087
3 C15:0 - 4 C16:0 0,12 5 C16:1w7 0,150 6 C17:0 - 7 C18:0 0,047 8 C18:1w7 - 9 C18:1w9 0,092 10 C18:2w6 0,120 11 C18:3w3 0,092 12 C18:4w3 - 13 C19:0 - 14 C20:0 - 15 C20:1w11 - 16 C20:1w7 - 17 C20:1w9 0,0850 18 C20:2w6 0,0210 19 C20:3w3 0,045 20 C20:3w6 0,0058 21 C20:4w3 - 22 C20:4w6 0,110 23 C20:5w3 0,750 24 C22:0 - 25 C22:1w11 - 26 C22:1w7 - 27 C22:1w9 - 28 C22:2w6 - 29 C22:3w3 - 30 C22:3w6 - 31 C22:4w6 - 32 C22:5w3 - 33 C22:5w6 -
34 C22:6w3 0,16 35 C24:0 - 36 C24:1w9 - 37 w3 1,05 38 w6 0,26 39 SFA 0,25 40 MUFA 0,39 41 PUFA 0,28 42 HUFA 1,02 43 Toltal FA 1,95 44 Lipid (%DM) 3,77 45 TFA/Lipid (%) 51,67
Kết quả phân tích ở Bảng 3.3 cho thấy sinh khối Artemia chứa hàm lượng cao các acid béo đặc biệt là các acid béo không no. Các acid béo không no chiếm 86,7% tổng hàm lượng acid béo; trong đó chủ yếu là các acid béo không no chưa bão hòa có nhiều nối đôi (có từ 2 nối đôi trở lên) như linoleic acid (C18:2w6), alpha linolenic acid (C18:3w3) và các acid béo chưa bão hòa bậc cao (có mạch từ 20 carbon trở lên và có từ 4 - 6 nối đôi) như arachidonic acid (C20:4w6), eicosapentaenoic acid (C20:5w3), docosahexaenoic aicd (C22:6w3); đây là các thành phần rất cần thiết cho sự phát triển não bộ và thị giác của trẻ em. Ngoài ra, với hàm lượng các acid béo bão hòa thấp nên lipid của Artemia dễ tiêu hóa và hấp thụ.
Từ kết quả phân tích thành phần hóa học của Artemia cho thấy sinh khối Artemia có giá trị dinh dưỡng cao thể hiện ở hàm lượng protein, hàm lượng các acid amin và acid béo không thay thế. Do đó, nghiên cứu phát triển các thực phẩm cho người đặc biệt là các thực phẩm chức năng chứa các chất có hoạt tính sinh học từ sinh khối Artemia là hướng đi có triển vọng để nâng cao giá trị của Artemia.
3.2. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại 3.2.1. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH 3.2.1. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH
Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại được trình bày trên đồ thị Hình 3.1.
be bcde bcd bc c b b b a 0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Thời gian thủy phân (giờ)
T ỷ l ệ D P P H b ị k h ử ( % )
Hình 3.1. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của dịch protein Artemia thủy phân