2.1.1. Nguyên vật liệu
2. 1.1.1. Artemia
Artemia sử dụng trong đề tài này có tên khoa học là Artemia franciscana. Là đối tượng nuôi thương phẩm tại trại nuôi thuộc xã Ninh Ích - Ninh Hòa - Khánh Hòa.
Từ các trang sau của luận văn
Artemia franciscana được gọi tắt là Artemia.
Hình 2.1. Hình ảnh sinh khối Artemia franciscana 2.1.1.2. Enzyme protease
Đề tài sử dụng các chế phẩm protease thương mại bao gồm: Neutrase, Alcalase, Flavourzyme và Protamex của hãng Novo - Đan Mạch có các thông số kỹ thuật được trình bày trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Điều kiện hoạt động thích hợp và điều kiện xử lý để vô hoạt các enzyme Điều kiện hoạt động thích hợp Điều kiện xử lý để vô hoạt Enzyme pH Nhiệt độ (OC) pH Nhiệt độ (OC) Thời gian (phút) Neutrase 7 40 - 50 7 80 10 Protamex 7- 8 50 8 85 10 Flavourzyme 6 -7,5 50 - 55 6-8 90 10 Alcalase 8 50 - 60 6-8 80 10
Neutrase là loại metallo endoprotease được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens; Alcalase là loại endoprotease được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis; Protamex kết hợp cả hai loại edoprotease và exopeptidase được thu nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis và Bacillus amyloliquefaciens; Flavourzyme kết hợp cả hai loại edoprotease và exopeptidase thu nhận từ nấm Aspergillus oryzae.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu là hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích có tên, công thức hóa học và xuất xứ được trình bày ở Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các hóa chất sử dụng trong phân tích
STT Tên hóa chất Công thức hóa học Xuất xứ 1 2,2-diphenyl-1-picryhyrazyl (DPPH) C18H12N5O6 Sigma (Mỹ) 2 Potassium ferricyanide K3[Fe(CN)6] Trung Quốc
3 Trichloro acetic acid CCl3.COOH Trung Quốc
4 Ferric chloride FeCl3 Trung Quốc
5 Metanol CH3OH Trung Quốc
6 Disodium hydrogen phosphate Na2HPO4..12H2O Trung Quốc 7 Sodium dihydrogen phosphate NaH2PO4. 2H2O Trung Quốc
8 Acid clohydric HCl Trung Quốc
9 Sodium hydroxyde NaOH Trung Quốc
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Các nghiên cứu tổng thể của đề tài được trình bày trên sơ đồ bố trí thí nghiệm Hình 2.2
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Artemia
Xử lý Xác định thành
phần hóa học
Thăm dò loại enzyme thủy phân thích hợp
Thăm dò điều kiện thủy phân thích hợp
Xác định thành phần có hoạt tính chống oxy hóa
Thuyết minh
Artemia sau khi thu mua vận chuyển sống về phòng được xử lý loại bỏ tạp chất và bảo quản. Artemia nguyên liệu được gửi đi xác định thành phần hóa học. Tiếp theo, tiến hành các thí nghiệm thăm dò loại enzyme và điều kiện thủy phân thích hợp để thu được dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao. Tiến hành thủy phân Artemia bằng enzyme và các thông số thích hợp để thu dịch thủy phân và xác định các chất có hoạt tính chống oxy hóa trong dịch thủy phân. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2. Bố trí thí nghiệm thu và xử lý mẫu
Mẫu Artemia sử dụng trong các thí nghiệm được thu, xử lý và bảo quản theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.3.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu và xử lý mẫu Thuyết minh:
Artemia được thu mua tại trại nuôi Ninh Hòa - Khánh Hòa được bảo quản sống bằng nước biển sạch và vận chuyển về phòng thí nghiệm. Sau đó sốc lạnh ở nhiệt độ 0 - 2oC trong thời gian 30 phút cho Artemia chết đồng loạt; một phần nguyên liệu được
Artemia
Bảo quản sống
Vận chuyển về phòng thí nghiệm
Sốc lạnh
Bảo quản đông
Đưa vào các thí nghiệm
sử dụng để xác định thành phần hóa học; phần còn lại được bao gói trong bao bì poly etylen và bảo quản đông (t0 = -200C ± 20C) để sử dụng cho các thí nghiệm sau.
2.2.3. Xác định thành phần hóa học của Artemia
Thành phần hóa học của Artemia được xác định theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.4.
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học của Artemia Thuyết minh:
- Mục đích: Xác định thành phần hóa học cơ bản như protein, lipid, nước, tro. - Tiến hành: Cân một lượng mẫu Artemia nguyên liệu rồi gửi đi phân tích. - Thảo luận kết quả phân tích và kết luận về thành phần hóa học của Artemia. Protein
Artemia
Rửa
Cân lấy mẫu
Phân tích Xử lý Kết quả Thảo luận Kết luận thành phần hóa học của Artemia
2.2.4. Xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại enzyme nội tại
Hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân được xác định theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.5.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại
Thuyết minh:
- Mục đích: Xác định họat tính chống oxy hóa của sản phẩm thủy phân bằng enzyme nội tại của Artemia.
- Tiến hành: Artemia sau khi rã đông dưới vòi nước chảy được xay nhỏ, cho vào hũ thủy tinh (khô, sạch); khối lượng mẫu mỗi mẫu là 100g. Tiến hành thủy phân
Artemia
Xác định hoạt tính chống oxy hóa
Thảo luận Kết luận về hoạt tính
chống oxy hóa của dịch thủy phân Artemia bằng
enzyme nội tại - Nhiệt độ 50 OC - pH tự nhiên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-Thời gian thủy phân: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 giờ Xay nhỏ Thủy phân Lọc Dịch thủy phân Kết quả
protein Artemia trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 50OC, pH tự nhiên của nguyên liệu trong các khoảng thời gian 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 giờ. Sau khi thủy phân tiến hành bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85OC/10 phút; pha loãng dịch thủy phân trong mỗi hũ bằng 100 ml nước cất rồi lọc lấy dịch; dịch lọc được tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
- Thảo luận kết quả thu được và kết luận về hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân bằng enzyme nội tại.
2.2.5. Chọn loại enzyme protease thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Lựa chọn loại enzyme protease thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao được tiến hành theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.6.
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn loại enzyme protease thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Artemia Xay nhỏ Thủy phân Lọc Dịch thủy phân - pH tự nhiên - Nhiệt độ: 50OC - Hoạt độ enzyme: 0,375 AU/g nguyên liệu
- Thời gian thủy phân: 5 giờ - Neutrase - Flavouzyme - Protamex - Alcalase Xác định hoạt tính chống oxy hóa Kết quả
Thuyết minh:
- Mục đích: Xác định loại enzyme bổ sung thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
- Tiến hành: Artemia sau khi rã đông dưới vòi nước chảy được xay nhỏ, cho vào hũ thủy tinh (khô, sạch); khối lượng mỗi mẫu là 100 g. Trong đó, mẫu 1: bổ sung enzyme Protamex, mẫu 2: bổ sung enzyme Neutrase, mẫu 3: bổ sung enzyme Flavourzyme, mẫu 4 bổ sung enzyme Alcalase với hoạt độ enzyme 0,375 AU/g nguyên liệu, mẫu đối chứng không bổ sung enzyme. Tiến hành thủy phân trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 50OC (khi nhiệt độ trong hũ đạt 50OC tiến hành bổ sung enzyme), pH tự nhiên của nguyên liệu, thời gian thủy phân 5 giờ. Sau khi thủy phân tiến hành bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85OC/10 phút; pha loãng dịch thủy phân trong mỗi hũ bằng 100 ml nước cất rồi lọc lấy dịch; dịch lọc được tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
- Thảo luận kết quả thu được và chọn loại enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân protein Artemia để thu được dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao; đồng thời để tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện thủy phân đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân.
2.2.6. Xác định các điều kiện thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao cần xác định các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân như tỷ lệ enzyme, nhiệt độ, pH, thời gian thủy phân.
1. Xác định tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Tỷ lệ enzyme/cơ chất thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao xác định theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.7.
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao Thuyết minh:
- Mục đích: Xác định tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp để thu được sản phẩm thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
- Tiến hành: Artemia sau khi rã đông dưới vòi nước chảy được xay nhỏ, cho vào hũ thủy tinh (khô, sạch); khối lượng mẫu mỗi mẫu là 100g. Tiến hành thủy phân Artemia bằng enzyme bổ sung đã chọn được ở trên với các tỷ lệ khác nhau (0,1%; 0,2%, 0,3%; 0,4%, 0,5%, 0,6%) trong điều kiện cố định các thông số như nhiệt độ, pH, thời gian thủy phân. Sau 5 giờ thủy phân, lấy mẫu bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85OC /10 phút; pha loãng dịch thủy phân trong mỗi hũ bằng 100 ml nước cất rồi lọc lấy dịch;
Artemia
Xay nhỏ
Thủy phân - pH tự nhiên
- Nhiệt độ: 50OC - Thời gian: 5 giờ - Tỷ lệ enzyme: 0,1%; 0,2%, 0,3%; 0,4%, 0,5%, 0,6% Lọc Xác định hoạt tính chống oxy hóa Dịch thủy phân Chọn tỷ lệ enzyme thích hợp Kết quả Thảo luận
dịch lọc được tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
- Thảo luận kết quả thu được và chọn tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
2. Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Nhiệt độ thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao tiến hành theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.8.
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Kết quả
Chọn nhiệt độ thủy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phân thích hợp. Thảo luận
Artemia Xay nhỏ Thủy phân - Enzyme thích hợp - Tỷ lệ E/S thích hợp - pH tự nhiên
- Thời gian: 5 giờ - Nhiệt độ : 30, 40, 45,
50, 55, 60 OC Lọc
Dịch thủy phân
Xác định hoạt tính chống oxy hóa
Thuyết minh:
- Mục đích: Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
- Tiến hành: Artemia sau khi rã đông dưới vòi nước chảy được xay nhỏ, cho vào hũ thủy tinh (khô, sạch); khối lượng mẫu mỗi mẫu là 100g. Tiến hành thủy phân Artemia bằng enzyme đã chọn được ở trên với các nhiệt độ thủy phân khác nhau (tO = 30OC, 40OC, 45OC, 50OC, 55OC, 60OC) trong điều kiện cố định các thống số như nồng độ enzyme, pH, thời gian thủy phân. Sau 5 giờ thủy phân, lấy mẫu bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85OC/10 phút; pha loãng dịch thủy phân trong mỗi hũ bằng 100 ml nước cất rồi lọc lấy dịch; dịch lọc được tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
- Thảo luận kết quả thu được và chọn nhiệt độ thủy phân thích hợp để sản phẩm thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
3. Xác định pH thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
pH thích hợp cho quá trình thủy phân để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao được xác định theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.9.
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Artemia Xử lý Thủy phân Dịch thủy phân Xác định hoạt tính chống oxy hóa Kết quả Thảo luận Chọn pH thích hợp - Enzyme thích hợp - Tỷ lệ E/S thích hợp - Nhiệt độ thích hợp - Thời gian thủy phân: 5
giờ
Thuyết minh:
- Mục tiêu: Xác định pH thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
- Tiến hành: Mẫu thủy phân được chuẩn bị tương tự như các thí nghiệm trên. Tiến hành thủy phân Artemia bằng enzyme bổ sung đã chọn ở các pH khác nhau trong điều kiện cố định các thông số khác như nhiệt độ, tỷ lệ E/S, thời gian thủy phân. Sau 5 giờ thủy phân, lấy mẫu bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85OC/10 phút; pha loãng dịch thủy phân trong mỗi hũ bằng 100 ml nước cất rồi lọc lấy dịch; dịch lọc được đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
- Thảo luận kết quả thu được và chọn pH thích hợp để sản phẩm thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
4. Xác định thời gian thủy phân thích hợp để dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Thời gian thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao được tiến hành theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.10.
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao
Xay nhỏ Thủy phân Dịch thủy phân Xác định hoạt tính chống oxy hóa Kết quả
Thảo luận Chọn thời gian thủy phân thích hợp - Enzyme thích hợp - Tỷ lệ E/S thích hợp - Nhiệt độ thích hợp - pH thích hợp
-Thời gian thủy phân: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 giờ Artemia
Thuyết minh:
- Mục đích: Xác định thời gian thủy phân thích hợp để thu được dịch protein Artemia thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
- Tiến hành: Mẫu Artemia được chuẩn bị tương tự như thí nghiệm 2. Thủy phân protein Artemia với các điều kiện đã lựa chọn như loại enzyme, nhiệt độ, pH. Sau các khoảng thời gian 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 giờ lấy mẫu rồi bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 85OC/10phút; pha loãng dịch thủy phân trong mỗi hũ bằng 100 ml nước cất rồi lọc lấy dịch; dịch lọc được tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa dựa trên hoạt tính khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử.
- Thảo luận kết quả thu được và chọn thời gian thích hợp để sản phẩm thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao.
2.2.3. Xác định các chất có hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các chất có hoạt tính chống oxy hóa của dịch protein Artemia thủy phân được xác định theo sơ đồ bố trí thí nghiệm trên Hình 2.11.
Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định các chất có hoạt tính chống oxy hóa trong dịch protein Artemia thủy phân
Xác định hoạt tính chống oxy hóa Dịch thủy phân Tách lipid bằng n-hexan Artemia Xay nhỏ Thủy phân - Enzyme thích hợp - Tỷ lệ E/S - Nhiệt độ thích hợp - pH thích hợp - Thời gian thích hợp Lọc
Protein thủy phân và carotenoid Xác định hoạt tính chống oxy hóa Điện di Kết tủa cồn Kết tủa Dịch màu Dịch chiết n – hexan
Thuyết minh: