Thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dương trong hợp chất hữu cơ thành các đơn phân dưới tác dụng của chất xúc tác có sự tham gia của nước trong phản ứng [13].
H2N – CH – CO – NH – CH – CO – NH – H2N – CH – COOH + H2N – CH – CO – NH–
Dưới tác dụng của chất xúc tác protein bị phân giải thành các polypeptide, peptide và cuối cùng là các acid amin. Có nhiều chất xúc tác cho quá trình thủy phân như enzyme, acid mạnh, kiềm mạnh, nhiệt độ cao, áp suất cao.
- Thủy phân bằng acid: Trong sản xuất thường dùng HCl; ngoài ra có thể dùng H2SO4. Acid phân ly càng mạnh thì phản ứng thủy phân xảy ra càng nhanh. Sản phẩm thủy phân thu được chủ yếu là các acid amin tự do dưới dạng hydrogenclorate. Một số acid amin như serine và threonine bị phá hủy một phần, tryptophane bị phá hủy hoàn toàn, glutamine và asparagine phân ly thành acid glutamic, acid aspartic và NH4+[13].
- Thủy phân bằng kiềm: Thường thực hiện bằng cách đun nóng cơ chất trong NaOH. Sản phẩm thu được là các acid amin nhưng đều bị recemic hóa chuyển từ dạng L sang dạng D, trong khi cơ thể người và động vật chỉ hấp thụ được acid amin dạng L; dạng D đôi khi ảnh hưởng xấu đến quá trình trao đổi chất [13].
Dưới điều kiện thủy phân của acid, kiềm xảy ra hàng loạt các phản ứng khử amin, một phần cystein và cystin bị phá hủy; sản phẩm mất đi giá trị dinh dưỡng cũng như các tính chất chức năng cần thiết. Hơn nữa quá trình thủy phân bằng acid hay kiềm rất khó kiểm soát, đòi hỏi thiết bị chịu được acid, kiềm; không an toàn với công nhân sản xuất; là mối đe dọa đối với môi trường [13].
- Thủy phân bằng enzyme: Là phương pháp được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau. Sử dụng enzyme làm chất xúc tác có ưu điểm là không có sản phẩm phụ do enzyme có tính đặc hiệu cao, thủy phân trong điều kiện nhiệt độ
R1 R2
H2O
R1 R2
Protein Acid amin Peptide
Xúc tác: Acid, kiềm, enzyme…
khoảng 40 - 60OC, pH khoảng 6 - 8 nên không gây biến tính protein cũng như tổn hao các aicd amin, sản phẩm vẫn giữ được giá trị dinh dưỡng và bảo tồn được các tính năng sinh học. Ngoài ra, thủy phân bằng enzyme còn dễ dàng kiểm soát quá trình thủy phân; không cần sử dụng thiết bị chịu acid, chịu kiềm, nhiệt độ và áp suất cao; không gây độc hại với công nhân và thân thiện với môi trường [13].
Việc lựa chọn enzyme là một nhân tố quan trọng trong quá trình thủy phân protein vì những protease khác nhau có đặc tính thủy phân khác nhau. Enzyme thủy phân được phân loại dựa vào cơ chế thủy phân của chúng, gồm hai loại enzyme là endoprotease và exopeptidase [12].
+ Enzyme endoprotease thủy phân liên kết peptide bên trong phân tử protein một cách ngẫu nhiên, tạo ra nhiều peptide lớn và lượng rất ít các acid amin tự do.
+ Enzyme exopeptidase thủy phân các liên kết peptide từ hai đầu của chuỗi polypeptide; kết quả thu được một hỗn hợp các acid amin tự do và một phần các peptide lớn.
Hình 1.8. Qúa trình thủy phân protein và các peptide bằng endoprotease và exopeptidase 1.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein
Thủy phân là công đoạn quan trọng nhất trong sản xuất protein thủy phân. Tùy thuộc vào loại enzyme và điều kiện thủy phân mà sản phẩm thủy phân có thể là các peptide hay acid amin. Mức độ thủy phân sẽ quyết định các tính chất chức năng của sản phẩm, do đó cần kiểm soát nghiêm ngặt quá trình thủy phân nhằm thu được sản phẩm với những đặc tính mong muốn [38, 43]. Mức độ thủy phân sẽ tăng dần theo thời gian phản ứng, khi đạt giá trị yêu cầu (có thể xác định một cách tương đối dựa vào thời
gian thủy phân) quá trình thủy phân sẽ được dừng lại bằng cách vô hoạt enzyme [49]. Quá trình thủy phân thường chịu ảnh hưởng của các yếu tố sau:
1. Ảnh hưởng của loại enzyme thủy phân
Tính chất đặc hiệu là biểu hiện khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nhất định. Enzyme có tính đặc hiệu rất cao; tính đặc hiệu của enzyme cho thấy sự khác biệt rất lớn giữa enzyme với các chất xúc tác khác. Trong nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của dịch thủy phân thì enzyme thủy phân đóng vai trò rất quan trọng vì nó quyết định thành phần và tính chất của sản phẩm thủy phân [41].
Hình 1.9. Qúa trình thủy phân để hình thành các peptide có hoạt tính sinh học 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Bản chất của enzyme là protein nên kém bền với nhiệt, khi tăng hay giảm nhiệt độ thường ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme. Cũng như các enzyme khác, enzyme protease chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất ở một giới hạn nhiệt độ nhất định, nhiệt độ thích hợp với đa số enzyme nằm trong khoảng 40OC - 50OC. Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme, cứ nhiệt độ tăng 10OC thì tốc độ thủy phân tăng từ 1,5 - 2 lần. Ở nhiệt độ lớn hơn 70OC đa số enzyme bị mất hoạt tính [12]. Do vậy, nhiệt độ 70OC gọi là nhiệt độ tới hạn của enzyme. Bên cạnh đó nhiệt độ thủy phân còn ảnh hưởng đến các chất có hoạt tính sinh học của dịch thủy phân [40]. Nhiệt độ thích hợp của một enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH và cơ chất.
3.Ảnh hưởng của pH môi trường
pH có ảnh hưởng lớn tới hoạt tính của enzyme vì pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và độ bền của phức hợp protein - enzyme. Mỗi enzyme nói chung và protease nói riêng chỉ hoạt động ở một khoảng pH nhất định gọi là pH tối thích; pH tối thích của đa số protease nằm trong vùng trung tính, acid yếu hoặc kiềm yếu, chỉ có rất ít protease có thể hoạt động trong vùng rất acid chẳng hạn pepsin hay rất kiềm như trypsin [12, 35]. Vì thế, phải tạo điều kiện pH thích hợp nhất cho hoạt
động của enzyme để thu được sản phẩm có những đặc tính như mong muốn. Với từng enzyme, giá trị pH thích hợp có thể thay đổi khi nhiệt độ, nồng độ cơ chất… thay đổi.
4.Ảnh hưởng của nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất nếu tăng nồng độ enzyme thì tốc độ thủy phân xảy ra nhanh hơn. Khi nồng độ enzyme bằng với nồng độ cơ chất, dù tăng nồng độ enzyme bổ sung vào hỗn hợp thuỷ phân thì vận tốc của phản ứng thủy phân rất ít thay đổi [12].
5. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Thời gian thủy phân ảnh hưởng lớn tới hiệu suất và tính chất của sản phẩm thủy phân. Thời gian thuỷ phân càng dài thì cơ chất bị thủy phân càng sâu sắc làm cho hoạt tính chống oxy hóa giảm, bên cạnh đó thời gian thủy phân quá dài là điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật hoạt động phân hủy các acid amin tạo thành các sản phẩm thứ cấp như NH3, H2S, indol, scatol, …bên cạnh đó thời gian thủy phân quá dài làm giảm hiệu quả kinh tế [12, 39]. Tuy nhiên, thời gian thủy phân rút ngắn, sự thủy phân protein chưa triệt để, hiệu suất thủy phân kém, gây lãng phí nguyên liệu. Vì vậy, tùy thuộc vào mục đích của quá trình thủy phân mà lựa chọn thời gian thủy phân thích hợp.
6.Ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào hỗn hợp thủy phân
Nước là môi trường để phân tán enzyme và cơ chất, là môi trường tăng cường quá trình phân cắt các liên kết nhị dương nên tỷ lệ nước có ảnh hưởng lớn đến tốc độ, chiều hướng và là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme [12]. Tuy nhiên, nước cũng là môi trường thích hợp cho hoạt động của vi sinh vật. Vì vậy, đối với từng loại nguyên liệu cần phải nghiên cứu tỷ lệ nước bổ sung thích hợp.
Vì vậy, để có thể thu nhận được dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa từ sinh khối Artemia bằng phương pháp sử dụng enzyme cần phải tiến hành các nghiên cứu lựa chọn loại enzyme protease và các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân.
Từ những nội dung đã trình bày trong phần tổng quan cho thấy hiện nay việc sử dụng nguồn sinh khối Artemia chưa hiệu quả; chủ yếu dùng làm thức ăn nuôi trồng thủy sản. Các nghiên cứu về giá trị dinh dưỡng, sinh học của protein Artemia để sử dụng trong sản xuất thực phẩm cho người chưa được quan tâm đặc biệt là hoạt tính chống oxy hóa của dịch thủy phân protein từ Artemia chưa có công trình nào công bố. Vì vậy, đề tài nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của protein thủy phân từ sinh khối Artemia là hoàn toàn mới mẻ.
Nghiên cứu tập trung tìm loại enzyme protease và các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân protein Artemia để thu được dịch thủy phân có hoạt tính chống oxy hóa cao. Bên cạnh đó, còn xác định thành phần có hoạt tính chống oxy hóa trong dịch thủy phân để có thể ứng dụng trong thực phẩm giàu dinh dưỡng, thực phẩm chức năng, cũng như trong chế biến và bảo quản thực phẩm. Đây là nghiên cứu có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng Artemia.
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU