nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất và sử dụng kit chẩn đoán một số bệnh nguy hiểm ở vật nuôi

Bộ KH CN Viện Thú y Bộ KH CN Viện Thú y Bộ khoa học - công nghệ Viện Thú Y 86, Đờng Trờng Chinh - Đống Đa Hà Nội Báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.16: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất và sử dụng KIT chẩn đoán một số bệnh nguy hiểm ở vật nuôi Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Trơng Văn Dung 6101 19/9/2006 Hà Nội 2005 Bản quyền 2005 thuộc Viện Thú y. Đơn xin sao chép toàn bộ hoặc từng phần tài liệu này phải gửi đến Viện trởng Viện Thú y trừ trờng hợp sử dụng với mục đích nghiên cứu. Bộ KHCN Viện Thú y Các đề tài nhánh của đề tài KC04-16 TT Mã số Tên đề tài nhánh Cơ quan của chủ nhiệm đề tài nhánh 1 KC04-16 01 ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học để phát hiện nhanh virus gây bệnh đốm trắng của tôm TS Đinh Thơng Vân Viện Công nghệ sinh học 2 KC04-16 02 KIT chẩn đoán dịch tả lợn TS Nguyễn Tiến Dũng Viện Thú y 3 KC04-16 03 KIT chẩn đoán bệnh do Salmonella ở gà bằng công nghệ vi sinh TS Cù Hữu Phú Viện Thú y 4 KC04-16 04 KIT ELISA chẩn đoán Salmonella ở gà công nghiệp bằng công nghệ sản xuất kháng nguyên bằng vi khuẩn biến nạp TS Trơng Nam Hải Viện Công nghệ sinh học 5 KC04-16 05 KIT chẩn đoán bệnh tụ huyết trùng trâu bò bằng kỹ thuật miễn dịchn -Bệnh lý PGS TS Trơng Văn Dung Viện Thú y Danh sách các cán bộ thực hiện đề tài KC04.16 I. Cán bộ tham gia chủ chốt STT Họ và tên Học vị Cơ quan công tác Chữ ký A Chủ nhiệm đề tài Trơng Văn Dung PGS. TS. Viện Thú y B Cán bộ tham gia chính 1 Đinh Thơng Vân TS Viện Côn g n g hệ sinh học 2 Nguyễn Tiến Dũng TS Viện Thú y 3 Cù Hữu Phú TS Viện Thú y 4 Trơng Nam Hải TS Viện Côn g n g hệ sinh học II. DAnh sách cán bộ tham gia STT Họ và tên Học vị chuyên môn Cơ quan công tác 1 Đinh Duy Kháng TS Viện Công nghệ Sinh học 2 .Nguyễn Văn Dũng TS TT N/C nuôi trồng Thuỷ Sản nớc lợ Quý Kim, Đồ Sơn, Hải Phòng 3 .Nguyễn Kim Độ GS.TS Viện Công nghệ Sinh học 4 Lê Thị Hội CN Viện Công nghệ Sinh học 5 Hà Thị Thu CN Viện Công nghệ Sinh học 6 Vũ Thị Ngọc Bích CN Viện Công nghệ Sinh học 7 Nguyễn Ngọc Nhiên TS Viện Thú y 8 KEN INUI TS JICA SNIVR 9 Hồ Thu Hơng Th.S ViệnThú Y 10 Bùi Nghĩa Vợng BSTY ViệnThú Y 11 Nguyễn Thế Vinh BSTS ViệnThú Y 12 Nguyễn Thuý Duyên Th.S ViệnThú Y 13 Nguyễn Thị Bơ KTV ViệnThú Y 14 Đỗ Ngọc Thuý TS Viện Thú y 15 Nguyễn Thu Hằng BSTY Viện Thú y 16 Âu Xuân Tuấn BSTY Viện Thú y STT Họ và tên Học vị chuyên môn Cơ quan công tác 17 Phạm Bảo Ngọc TS Viện Thú y 18 .Đào Thị Hảo Th.S Viện Thú y 19 Văn Thị Hờng BSTY Viện Thú y 20 Nguyễn Xuân Huyên BSTY Viện Thú y 21 Vũ Ngọc Quý BSTY. Viện Thú y 22 Nguyễn Bích Thuỷ BSTY Viện Thú y 23 Phạm Thuý Hồng TS Viện Công nghệ Sinh học 24 Nguyễn Thanh Thuỷ CN Viện Công nghệ Sinh học 25 Nguyễn Thanh Lịch CN Viện Công nghệ Sinh học 26 Lê Hữu Cờng Th.S Viện Công nghệ Sinh học 27 Lê Thu Hồng CN Viện Công nghệ Sinh học 28 Dơng Cẩm Thuý CN Viện Công nghệ Sinh học 29 Đỗ Thị Huyền Th.S Viện Công nghệ Sinh học 30 Nguyễn Thị Trung Th.S Viện Công nghệ Sinh học 31 Trần Ngọc Tân CN Viện Công nghệ Sinh học 32 Tô Long Thành TS Viện Thú y 33 Hoàng Xuân Nghinh Th.S Viện Thú y 34 Đỗ Tuấn Cơng Th.S Viện Thú y STT Họ và tên Học vị chuyên môn Cơ quan công tác 35 Lê Trần Phan BSTY Viện Thú y 36 Đặng Vũ Hoàng BSTY Viện Thú y 37 Trần Thu Hiền Th.S Công ty HANVET 38 Trần Thanh Hà BSTY Viện Thú y 39 Trần Xuân ánh Th.S Viện Thú y 40 Trơng Hồng Hoa BSTY Viện Thú y 41 Nguyễn Thị Bích BSTY Viện Thú y 42 Nguyễn Thị Thanh Nhàn Th.S. Chi cục TT Lạng Sơn Danh sách các đơn vị tham gia phối hợp TT Đơn vị 1 Viện Thú y 2 Viện Công nghệ sinh học 3 Trung tâm Chân đoán thú y TW 4 Trung tâm vùng thú y Hà NộI 5 Trung tâm vùng thú y Vinh 6 Trung tâm vùng thú y Đà Nẵng 7 Trung tâm vùng thú y Thành phố Hồ Chí Minh 8 Trung tâm vùng thú y Cần Thơ 9 Trờng đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh 10 Chi cục Thú y Hà Nội 11 Chi cục Thú y thành phố Hồ Chí Minh 12 Trung tâm nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản nớc lợ Hải Phòng Mục luc Trang 1 5 Tóm tắt báo cáo Danh mục các từ viết tắt Lời nói đầu 9 Chơng I: Tổng quan tài liệu 17 1.1. Bệnh đốm trắng ở tôm 1.1.1. Tình hình dịch bệnh 1.1.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nớc 17 18 19 1.2. Bệnh Dịch tả lợn 21 1.2.1. Tình hình bệnh Dịch tả lợn trên thế giới 1.2.2. Tình hình bệnh Dịch tả lợn trên ở Việt Nam 1.2.3. Dịch tễ bệnh Dịch tả lợn 1.2.4. Chất chứa mầm bệnh và độc lực của virus 1.2.5. Sinh bệnh học 1.2.6. Một số đặc điểm chủ yếu của virus Dịch tả lợn 21 21 22 25 25 26 1.3. Bệnh Salmonella ở gà 28 1.3.1. Giới thiệu chung về Salmonella 1.3.2. Các kháng nguyên cấu trúc bề mặt tế bào 1.3.3. Các phơng pháp phát hiện Salmonella 1.3.4. Biểu hiện gen 29 30 33 35 1.4. Bệnh Tụ huyết trùng 37 1.4.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Tụ huyết trùng 1.4.2. Bệnh Tụ huyết trùng tại Việt Nam 1.4.3. Căn bệnh 1.4.4. Các phơng pháp chẩn đoán 37 40 41 52 1.4.5. Cơ sở khoa học của việc gây tối miễn dịch 58 Chơng II: Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu 62 A. Nguyên liệu 62 2.1. Đối tợng nghiên cứu bệnh Đốm trắng ở tôm 62 2.2. Bệnh Dịch tả lợn 63 2.3. Kit chẩn đoán miễn dịch bệnh Salmonella ở gà 64 2.4. Kit ELISA chẩn đoán bệnh do Salmonella 64 2.5. Kit chẩn đoán bệnh Tụ huyết trùng trâu bò 65 B. Phơng pháp nghiên cứu 69 2.1. Bệnh Đốm trắng ở tôm 69 2.1.1. Phơng pháp tách AND tổng số 2.1 2. Phơng pháp xác định nồng độ ADN 2.1.3. Kỹ thuật PCR 2.1.4. Mutiplex PCR 2.1.5 . Phơng pháp biến nạp AND plasmid vào tế bào E.coli 2.1.6. Phơng pháp tách AND plasmid từ vi khuẩn 2.1.7. Phơng pháp điện di AND trên gel 2.1.8. Phơng pháp xác định trình tự AND tự động 69 70 71 72 73 74 74 75 2.2. Kit chẩn đoán Dịch tả lợn 76 2.2.1. Phơng pháp RT - PCR 2.2.2. Phơng pháp chạy điện di nằm ngang 2.2.3. Phơng pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp 2.2.4. Phơng pháp NPLA 2.2.5. Phơng pháp lấy mẫu máubằng giấy thấm 76 78 79 80 82 2.3. Kit chẩn đoán miễn dịch bệnh Salmonella ở gà 2.3.1. Phơng pháp xác định vi khuẩn Salmonella 2.3.2. Phơng pháp thử phản ứng ngng kết trên phiến kính 2.3.3. Phơng pháp xác định kháng nguyên H 82 82 83 83 2.4. Kit ELISA chẩn đoán Salmonella 85 2.4.1. Tách chiết DNA genom từ TB VK Salmonella 85 2.4.2. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào VK E. coli 86 2.4.3. Biến nạp DNA plasmid vào E.coli bằng PP TB khả biến 87 2.4.4. Điện di DNA trên gel agarose 2.4.5. Điện di thu gen trong túi thẩm tích 2.4.6. Xử lý DNA plasmid bằng enzym hạn chế 2.4.7. Phơng pháp tiến hành PCR 2.4.8. Phơng pháp tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực 2.4.9. Phơng pháp lai Western blot 2.4.10. Thí nghiệm ELISA 88 88 89 89 90 90 91 2.5. Kit chẩn đoán Tụ huyết trùng trâu bò 92 2.5.1. Qui trình chiết tách IgG của thỏ 2.5.2. Xác định nồng độ protein 2.5.3. Qui trình gây miễn dịch cho dê 2.5.4. Phản ứng ELISA để kiểm tra HGKT của dê 2.5.5. Chế tạo Peroxidase conjugation 2.5.6. Xác định đặc tính VSV, SH và độc lực của VK 2.5.7. Qui trình chế kháng nguyên và chất gây MD 2.5.8. Lịch trình gây tối miễn dịch trên thỏ 2.5.9. Đánh giá đáp ứng miễn dịch của thỏ 2.5.10. Phơng pháp thu hoạch kháng thể 2.5.11. Xác định hàm lợng protein 2.5.12. Phơng pháp điện di protein 2.5.13. Sử dụng IgG thu đợc trong phản ứng IHA 2.5.14. Phơng pháp miễn dịch bệnh lý chẩn đoán bệnh THT 92 93 93 94 94 96 97 98 99 103 104 105 107 107 Chơng Ba: Kết quả và thảo luận 112 3.1. Kit chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm 112 [...]... nhằm nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học tiên tiến của các nớc trên thế giới để tạo ra các chế phẩm sinh học dùng trong chẩn đoán một số bệnh truyền nhiễm quan trọng ở vật nuôi đang là đòi hỏi của thực tế sản xuất ở nớc ta nh: Bệnh Đốm trắng ở tôm, bệnh Dịch tả lợn, bệnh do Salmonella gây ra và bệnh Tụ huyết trung trâu bò Trên cơ sở đề cơng và hợp đồng ký kết với Bộ khoa học công nghệ, ... quả kiểm tra bệnh tích đại thể và vi thể 190 3.5.2.5 Kết quả xác định độ pha loãng IgG trong kỹ 193 thuật miễn dịch bệnh lý 3.5.2.6 Kết quả nhuộm hoá miễn dịch các tiêu bản 195 Chơng IV: Kết luận và kiến nghị 201 Kết luận 201 Kiến nghị 203 Lời cảm ơn 204 Tài liệu tham khảo 205 Tóm tắt báo cáo Đề tài: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất và sử dụng KIT chẩn đoán một số bệnh nguy hiểm ở vật nuôi Đề tài... đốm trắng ở tôm - Đã tách dòng và xác định trình tự của đoạn AND đặc hiệu của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm - Hoàn thiện qui trình chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm - Hoàn thiện qui trình chẩn đoán đồng thời bệnh đốm trắng và bệnh MBV bằng phơng pháp Multiplex PCR - Chế tạo thành công Kit chẩn đoán bệnh đốm trắng ở tôm đơn giản dễ vận chuyển, dễ bảo quản - Chế tạo thành công Kit chẩn đoán bệnh MBV 2... bệnh MBV 2 - Chế tạo thành công Kit chẩn đoán đồng thời bệnh MBV và WSSV - Đã hớng dẫn và đào tạo 7 sinh viên, 1 cao học - Đã chuyển giao đợc 50 bộ Kit chẩn đoán bệnh đốm trắng - Đã có 2 bài báo đăng trên tạp chí thú y và báo cáo tại hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2003 Dự kiến đăng 1 bài báo tiếp theo 2) Nghiên cứu chế tạo Kit chẩn đoán bệnh Dịch tả lợn - Đã sản xuất đợc conjugate huỳnh quang... khoa học nghiên cứu tìm hiểu về những loại bệnh ở tôm Cho đến năm 1996 có trên 30 loại bệnh khác nhau trên tôm he đã đợc tập trung nghiên cứu Dựa vào các tác nhân gây bệnh, các nhà khoa học chia ra thành một số bệnh chủ yếu: Bệnh do virút Bệnh do vi khuẩn 18 Bệnh do nấm Bệnh do kí sinh trùng và một số bệnh do các yếu tố vô sinh gây ra Bắt đầu từ năm 1988, khi miền Trung Việt Nam cho đẻ thành công tôm... hợp 159 3.4.7 Nghiên cứu khả năng liên kết miễn dịch của các 161 protein tái tổ hợp 3.4.8 Xây dựng qui trình chuẩn tạo Kit ELISA 164 3.5 Kit chẩn đoán bệnh Tụ huyết trùng trâu bò 165 3.5.1 Kết quả nghiên cứu sản xuất tinh chiết kháng thể 165 dê kháng IgG 3.5.2 Kết quả nghiên cứu sản xuất tinh chiết kháng thể 169 kháng P multocida và KT chẩn đoán miễn dịch 3.5.2.1 Đặc tính sinh vật, hoá học và độc lực... thuật RT-PCR và ELISA trong chẩn đoán bệnh dịch tả lợn - Đã chuyển giao Kit và qui trình chẩn đoán bệnh dịch tả lợn cho trung tâm thú y vùng: Vinh, Đà nẵng và Cần Thơ để chẩn đoán với số lợng 1000 mẫu ( Kit chẩn đoán miễn dịch huỳnh quang) - Đã đào tạo 2 sinh viên 3) Kit chẩn đoán bệnh do Salmonella ở gà bằng công nghệ vi sinh - Từ 339 mẫu phân gà Lơng phợng đã phân lập đợc 20 mẫu dơng tính với Salmonella... hạn chế do giá thành, vận chuyển, sử dụng phức tạp 21 1.2 Bệnh Dịch tả lợn (DTL) 1.2.1 Tình hình bệnh dịch tả lợn trên thế giới: Bệnh DTL xảy ra lần đầu tiên ở Tennese vào khoảng năm 1810, sau đó bệnh xuất hiện ở bang Ohio-Mỹ vào năm 1830, ở Pháp năm 1822, ở Đức năm 1893 (Hanon,1957), (Dahle, 1992) Tuy nhiên, một quan điểm nữa cho rằng bệnh DTL lần đầu tiên xuất hiện ở Anh năm 1862 (Fuchs, 1968) sau... liệu 1.1 Bệnh đốm trắng ở tôm: 1.1.1 Tình hình dịch bệnh: Thuỷ sản đã và đang trở thành một ngành kinh tế quan trọng của đất nớc với sản lợng hiện nay khoảng 2,2 triệu tấn, trong đó nuôi trồng đạt gần 40% Theo kế hoạch, đến năm 2010 sản lợng nuôi trồng sẽ đạt 60-65% trong tổng sản lợng thuỷ sản của cả nớc Để đạt sản lợng khai thác thuỷ sản khoảng 3,5 triệu tấn, cần phải tăng cờng phát triển nuôi trồng...3.1.1 Hội chứng đốm trắng (WSSV) 112 3.1.2 Bệnh còi (MBV) 116 3.1.3 Kết quả thực nghiệm 121 3.1.3.1 Kết quả tách AND tổng số từ tôm bệnh 122 3.1.3.2 Kết quả tách dòng và trình từ AND gây WSSV 122 3.1.3.3 Kết quả tách dòng và trình từ ADN gây MBV 126 3.1.3.4 Kit chẩn đoán bệnh đốm trắng 130 3.2 Kit chẩn đoán bệnh Dịch tả lợn 134 3.2.1 Kết quả so sánh bốn phơng pháp chẩn đoán 134 3.2.1 Kết quả . cáo Đề tài : Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất và sử dụng KIT chẩn đoán một số bệnh nguy hiểm ở vật nuôi Đề tài KC04.16 nhằm nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học tiên. - công nghệ Viện Thú Y 86, Đờng Trờng Chinh - Đống Đa Hà Nội Báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.16: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất và sử dụng KIT chẩn đoán một số bệnh nguy. 03 KIT chẩn đoán bệnh do Salmonella ở gà bằng công nghệ vi sinh TS Cù Hữu Phú Viện Thú y 4 KC04-16 04 KIT ELISA chẩn đoán Salmonella ở gà công nghiệp bằng công nghệ sản xuất kháng nguy n